氨甲环酸注射液细菌内毒素方法学验证报告

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学

验证报告

长春博奥生化药业有限公司质量控制部

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学

起草、审核和批准

版本历史

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学

目录

1目的 (4)

2范围 (4)

3职责 (4)

4内容 (4)

4.1验证小组成员及职责 (4)

4.2本次验证实施时间 (4)

4.3验证人员的培训 (5)

4.4仪器仪表校验情况 (5)

4.5仪器与设备 (5)

5验证过程 (5)

5.1 实验材料 (5)

5.2 实验用具 (6)

5.3 实验准备 (6)

5.4 具体验证步骤 (6)

5.5漏项及偏差处理 (10)

6验证结论 (10)

7附录 (11)

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学

1.目的

验证组根据氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学验证方案规定的验证项目及合格标准，对氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法进行了验证，经过对验证过程的数据分析和评价，得出验证结论，特制订本报告，并提请质量负责人批准。

2.范围

本验证方案适用于氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学验证的验证过程总结及评价。

3.职责

验证组对本报告的编制负责。

4.内容

4.1验证组成员及职责

4.1.1验证组成员

4.1.2验证组成员职责

4.1.2.1验证组组长：负责组织验证方案、验证报告的起草、审核，负责组织验证组成员按照批准的方案进行实施，以及实施验证全过程的组织工作。

4.1.2.2质量控制部：负责本验证方案、验证报告的起草，并在验证组长的组织下实施验证，详实记录验证过程中的相关记录；参加验证方案的会审。

4.1.2.3质量保证部：负责对本验证方案实施的全过程监督，确认验证实施过程严格执行验证方案的规定。负责验证过程中的检验和检测及其相关检验记录；审核、批准验证方案和验证报告，建立验证档案，归档验证资料。

4.2本次验证实施时间：

****年**月**日至****年**月**日

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学4.3验证人员的培训

4.4仪器/仪表校验确认

仪器/仪表校验评价

4.5仪器与设备

电子天平

电热干燥箱

恒温水浴箱

水银温度计

旋涡混合器

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5. 验证过程：

5.1 实验材料

鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）

细菌内毒素工作标准品

细菌内毒素检查用水

5.2 实验用具

移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。

5.3 实验准备

5.3.1 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。

5.3.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。

5.4 具体验证步骤

5.4.1鲎试剂灵敏度复核

5.4.1.1.细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。

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5.4.1.2.待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

5.4.1.3.加样

将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2 分钟。观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）

5.4.1.4 实验结果计算

如最大浓度2.0λ, 4管均为阳性，最低浓度0.25λ, 4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果

（λ

c ）。λ

c

= lg-1 (∑X/4)

式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

5.4.1.5 结果判断

5.4.1.5.1 判断标准

当λ

c

在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。

5.4.1.5.2 判断结果：（记录附后）

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5.4.2 干扰实验

5.4.2.1. 操作方法

5.4.2.1.1.目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

5.4.2.1.2.制备内毒素标准对照溶液

取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（方法同5.4.1.1.）。

5.4.2.1.3.制备含内毒素的供试品溶液

将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将5.4.1.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。

5.4.2.1.4.鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

5.4.2.1.5.加样

将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。

5.4.2.2 实验结果计算

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如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照, 管均为阴性

时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(E

s

)

和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(E

t

).

E s = lg-1 (∑X

s

/4)

E t = lg-1 (∑X

t

/4)

X s 、X

t

分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的

对数值（lg）。

5.4.2.3 结果判断5.4.2.3.1.判断标准

当E

s 在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且E

t

在0.5 E

s

～2.0E

s

（包括0.5 E

s

和2.0E

s

）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行

细菌内毒素检查。当E

t 不在0.5 E

s

～2.0E

s

（包括0.5 E

s

和2.0E

s

）时，则认为供试品在

该浓度下干扰实验。

5.4.2.3.2.判断结果：（记录附后）

。5.4.3 供试品细菌内毒素检查

在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。

5.4.3.1.操作方法

5.4.3.1.1.供试品溶液的制备：（稀释倍数不得超过MVD）

见细菌内毒素检查记录（记录附后）

5.4.3.1.2. 阳性对照溶液的制备

用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同5.4.2.1.2）。

5.4.3.1.3.供试品阳性对照溶液的制备

用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。（方

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法同5.4.2.1.3 供试品阳性对照溶液的制备）。

5.4.3.1.4.阴性对照液用细菌内毒素检查用水

5.4.3.1.5 鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

5.4.3.1.6 加样

取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

5.4.3.1.7 结果判断

5.4.3.1.7.1 判断标准

当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2 管均为阳性，应认为不符合规定；如2 管中1管为阳性，1 管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD 而结果出现2 管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。

5.4.3.1.7.2.判断结果：（记录附后）

5.4漏项及偏差处理

验证组严格执行了验证方案规定的方法和标准，根据验证过程及结果的分析，验证过

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程中未出现漏项及偏差。

6. 验证结论：

以上试验结果表明：氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法的专属性、灵敏度均符合《中国药典》2010年版二部要求，请验证领导小组批准该检验方法合法使用。

7附录

7.1 表1

氨甲环酸注射液细菌内毒素检验方法学

细菌内毒素检查记录

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1.试药与试液

2．操作方法

供试品溶液（A）：内毒素限值为 EU/ml

a 取供试液 ml，加BET水 ml，混匀，作倍稀释；

b 取上述溶液a ml，加BET水 ml，混匀，作倍稀释；

阳性对照（B）：取内毒素工作标准品1支，加BET水 ml，在漩涡混合器上混合分钟后，使成 EU/ml工作标准品作为原液。

a 取原液 ml，加BET水 ml，混匀，制成 EU/ml；

b 取溶液a ml，加BET水 ml，混匀，作为阳性对照（B）；

供试品阳性对照（C）：取工作标准品原液 ml，加供试品倍稀释液 ml,混匀，取上述稀释液 ml，加供试品倍稀释液 ml,混匀，制成 EU/ml；作为供试品阳性对照（C）阴性对照（D）：加BET水。

3加样：取鲎试剂，每支加入 ml细菌内毒素检查用水复溶，另取A、B、C、D溶液各

ml，加至已复溶的鲎试剂中，轻轻混匀，每种溶液各加支，轻微混合，置 37℃±1℃保温60±2分钟，观察结果。

4．试验结果

检验人：复核人：