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猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导.pdf

脂肪细胞的基础知识

脂肪细胞的基础知识脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.

间充质干细胞概念：不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多种抗原标志。李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外，它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

中国组织工程研究第19卷第32期 2015–08–06出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155 www. CRTER .org 肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 https://www.wendangku.net/doc/064590784.html, Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Accepted: 2015-07-01 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700) 文章亮点： 1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。 2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 3 DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。关键词：干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金主题词：干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的基金资助：国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02) 摘要背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161. doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013 Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification Xiao Jian-hong 1, Zhang Yang-chun 2, Zhang Chang-ran 1, Yang Xing 2 (1Department of Internal Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).

人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立

人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立徐潇，张旭毅，闫俊灵，陈冲，赵欣，李明辉，汤苏阳【摘要】［摘要］目的探讨建立生物学性状稳定的人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)库的可行性，旨在为组织工程种子细胞提供更多来源。方法对分离得到的hADSCs采用液氮低温冻存,并在一定时间复苏培养,以流式细胞仪检测其表面抗原Z在诱导培养基中对其进行成脂和成骨诱导培养,光镜下观察细胞形态Z 免疫组织化学方法检测成骨诱导的特异标志物碱性磷酸酶(ALP)的表达, 观察hADSCs在复苏前后的分化能力。结果从脂肪组织中分离培养扩增获得数目稳定的hADSCs ,经冻存并复苏后的hADSCs形态和表面抗原保持不变Z可继续扩增10代以上，倍增时间为48h o复苏后第2、第6、第10代hADSCs 均保持了较强的成脂及成骨分化能力。结论初步建立hADSCs库,可为再生医学修复重建组织工程提供较好的种子细胞。【期刊名称】解放军医学杂志【年(卷),期］2016(041)012 【总页数】6 【关键词】［关键词］脂肪来源间质干细胞；干细胞库；低温保存；可行性研究近年来，再生医学的迅速发展为组织工程修复组织缺损提供了种子细胞和可利用的细胞基质，其中脂肪干细胞与其他干细胞相比具有来源丰富、取材简单、便于培养、无组织配型及免疫排斥问题、可跨胚层多向分化、增殖速度快等显著优点Z是优秀的组织工程种子细胞［1-3］O人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived Stem CeIlS , hADSCs)是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞［4］,是极具前景的组织工程和基因治

间充质干细胞分离与培养

文章编号:100025404(2001)0520553203论著骨髓间充质干细胞的分离与培养艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提　要:目的　摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果　以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论　建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective　T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods　C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults　The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion　The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1　材料与方法 1.1　骨髓MSC的分离从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2　不同贴壁时间对MSC增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3　不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4　比较不同种植密度对MSC生长的影响用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5　培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月第　三　军　医　大　学　学　报 ACT A　AC ADE MI AE　ME DICI NAE　MI LIT ARIS　TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

中国组织工程研究与临床康复第14卷第14期 2010–04–02出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14 P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.wendangku.net/doc/064590784.html, 2492 1 Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 3 Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4 Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 5 Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC 29634-0905, USA He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China heshq106@https://www.wendangku.net/doc/064590784.html, 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○ 何绍清1， 2，罗振宇1， 2，刘秋英1， 2，周向荣△2， 3，邓铭权△2， 3，罗新4，姚润斯4，高志5，王一飞○1， 2 Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2 Abstract He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.wendangku.net/doc/064590784.html, https://www.wendangku.net/doc/064590784.html,] 摘要何绍清，罗振宇，刘秋英，周向荣，邓铭权，罗新，姚润斯，高志，王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2492-2496. [https://www.wendangku.net/doc/064590784.html, https://www.wendangku.net/doc/064590784.html,] 0 引言间充质干细胞具有自我更新能力，能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3]，甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞 [7-10] 。目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少和降低[11-13]，并且取材时易对供体造成身体伤害。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，还必须取材便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制等。脐带由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃，近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究易敬林1,杨海军1,丁伟荣2,柳　2,吴晓牧2,杨志刚2,陈　波2,何　丹2 (江西省人民医院1.眼科;2.中心实验室,江西南昌330006) 摘要:目的　研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法　取无恶性血液病的32～65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DM EM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1mL/孔)进行培养,48h后更换新鲜培养液,以后每3d 换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HL A2DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果　成人骨髓接种后24h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6～15d细胞进入快速增殖期,一般培养20～25d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10～15d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HL A-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论　用密度为1.077g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。关键词:骨髓;间充质干细胞;细胞培养中图分类号:Q813.1+1 文献标识码:A 文章编号:1000-2294(2005)06-0001-04 Study of the Isolation,Culture,and Biological Properties of H um an Bone Marrow Mesenchym al Stem Cells YI Jing2lin1,YANG H ai2jun1,DING Wei2rong2,L IU Zhe2, WU Xiao2mu2,YANG Zhi2gang2,CHEN Bo2,HE Dan2 (1.Dep artment of O p ht hal molog y; 2.Center L aboratory,J i ang x i Provi nce People’s Hos pit al,N anchan g330006,Chi na) ABSTRACT:Objective　To st udy a met hod for t he isolation and cult ure of human bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)in vitro and explore t heir biological properties.Methods　Bone marrow aspiration samples were obtained f rom7adult human donors32to65years old wit hout severe hematopietic diseases.Mononuclear cells were acquired after density gradient cent rif uga2 tion of t he collected bone marrow aspiration.Then t hey were seeded at1×106cells/ml in DM EM/F12supplemented wit h10%fetal bovine serum(FBS)in a hole of12holes cult ure plate.The medium was changed first time after48hours,and o nce every3days t hereafter. When t he cult ures reached nearly90%of confluence,cells were passaged wit h routine met hods. Cell surface antigens which contain CD29,CD44,CD166,CD105,CD34,CD45,HL A2DR were detected wit h flow cytomet ry.MSCs were treated wit h adipocyte cult ure fluid,t hen t hey were detected wit h oil red stain to ascertain whet her MSCs could be induced to adipocyte or not.R esults 　A small percentage of isolated cells were adherent to t he flasks and grew as typically fibroblas2 收稿日期:2005-07-29 作者简介:易敬林(1951-),男,本科,教授,主任医师,研究方向:干细胞的基础及应用研究。

脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序

脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息 1.极限必须培养基 (Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L (SH30021.01B, Hyclone) 2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10% (ES-009-B, Millipore) 3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1% （TMS-AB2C, CHEMICON） 4.地塞米松 (Dexamethasone,DM) 1μmo／L 分子量：392.46 (D4902-25MG, Sigma) 5.胰岛素 (Insulin, IS) 10 μmol／L 分子量：5808 (91077C—1g, Sigma) 6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24 ( I5879-100MG, Sigma) 7.吲哚美辛 (Indomethacin,ID) 200 μmol／L 分子量：357.79 (I7378—5G, Sigma) （二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法 1.Stock A 胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃ 2.Stock B 青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃ 3.Stock C 地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300 保存：-20℃ 4.Stock D 胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100 保存：4℃ 5.Stock E 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃ 6.Stock F 吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100 保存：-20℃ （三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml） 1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）; 2.加1管Stock A（1ml）； 3.加1管Stock B（0.1ml）； 4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml； 5.加1管Stock E（0.05ml）；

脂肪间充质干细胞成瘤性分析

脂肪间充质干细胞成瘤性分析干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。目前，各类干细胞在临床治疗上的应用研究如火如荼，已有已有大量实验证实干细胞治疗的有效性。由于干细胞具有较强的分化和增殖能力，人们对其在人体使用时的安全性产生了怀疑，其中最主要的是干细胞注射后的异常分化导致的致瘤性。癌细胞是肿瘤的组成细胞，与干细胞的相同点在于具有增殖和多向分化的能力。不同点在于癌细胞的增殖和分化不可控，而干细胞的增殖和分化受到了机体的调控，是有目的有方向的调控，用于补充机体所需的各种细胞。因此，干细胞与癌细胞并不相同，人们所担忧的是注射干细胞后，不但造成干细胞所处的微环境改变，而且干细胞同样会造成机体的微环境改变，这样的改变对人体是否安全？干细胞按照其分化潜能，可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。受精卵即为全能干细胞，当其在调控下可有序增殖，定向分化，最终发展成为一个正常的个体。胚胎干细胞同样为全能干细胞，来源于胚胎囊胚时期的内细胞团。由于其具有无限增殖全能分化的能力，同时对外界抵抗较弱，其基因容易受到外界影响而突变，在实验过程中发现其有潜在的致瘤性，注射至机体后可能会导致畸胎瘤。目前另一种研究热门的干细胞为iPSC（诱导多能干细胞），是在体细胞中转入四个转录因子，使其去分化重新恢复全能干细胞的特性。它的出现解决了干细胞的获得问题，但iPSC是将激活的癌基因转入细胞，致瘤性问题会较胚胎干细胞更为严重。而多能干细胞和单能干细胞的分化方向已经固定，增殖能力有限，同时机体本身已大量存在，实验主要关注于体外扩增后回输体内，补充体内干细胞增殖较慢无法满足机体需求，并不会对细胞的基因型和转录组造成改变，理论上讲注射入机体后不存在致瘤性。目前的干细胞注射治疗研究热点有神经干细胞对神经退行性疾病和外部损伤的治疗，软骨干细胞对软骨组织磨损及缺失的治疗，皮肤干细胞对烧伤或创伤的治疗，成纤维细胞在美容中的应用，以及临床上已广泛应用的造血干细胞对血液疾病的治疗。这些大样本及长期的应用及研究，均未发现其对机体所造成的致瘤性等其他伤害，同时发现干细胞起到比药物更好的治疗效果或治疗传统药物无法应对的疾病。间充质干细胞属于多能干细胞的一种，主要分布于成人的骨髓、外周血、脂肪和新生儿的脐血和脐带，可以分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。目前研究较多的是从骨髓和外周血提取的间充质干细胞，而新生儿的脐血和脐带的间充质干细胞则有获得方面的伦理问题及使用时的异体移植所产生的免疫排斥问题，实验关注度不如骨髓和外周血。已有大量实验证实，骨髓间充质干细胞可在体外诱导后从静脉回输或向病变部位移植，治疗脊髓损伤、阿尔兹海默、帕金森、心肌缺损、血管内皮缺损、软骨缺损等疾病，并在这些研究中未见到肿瘤发生。同时也有实验关注于血液间充质干细胞的致瘤性，经体外和体内同时验证，也未发现肿瘤发生。并有实验报道，间充质干细胞经静脉回输入有肿瘤的裸鼠后，会聚集在肿瘤附近，抑制肿瘤的生长，具有一定的抑癌作用。目前国外也已有多家公家公司将骨髓间充质干细胞的产品申请专利及向药品管理部门或卫生部门申请临床化及药品化。因此，通过大量的实验及权威部门的证实，均说明了骨髓间充质干细胞的安全性，当其在体外增殖及诱导分化回输至机体后，不会对机体产生致瘤性。脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞同属于间充质干细胞，具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34、CD45为阴性反应，说明了两类细胞在基因表达方面的一致性。同时有实验证实，不同部位提取的间充质干细胞在自然分化条件下分化方向不同，主要向周围相同细胞分化。但当在有相同外界因子的诱导下，可向同一种特定细胞分化，如软骨细胞、神经干细胞、内皮细胞等。这些说明二者