利用内标为基础的多重+RT-PCR+技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ，２０１４，２６（１）：１０５－１０９ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｊｎｙｘｂ．ｃｎ

王红，王菁菁，张科立，等．利用内标为基础的多重ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒［Ｊ］．浙江农业

学报，２０１４，２６（１）：１０５－１０９．

ＤＯＩ：１０畅３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－

１５２４畅２０１４畅０１畅１９收稿日期：２０１３－０３－１８

基金项目：农业科技成果转化资金项目（ＳＱ２０１２ＥＣＣ２２０００８）作者简介：王红（１９８７—），女，山东临沂人，硕士，研究方向为植物病理学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｏｃｏ９６８１２＠１６３．ｃｏｍ

利用内标为基础的多重ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

王　红，王菁菁，张科立，成卓敏

（宁波华厦现代农业研究所，浙江宁波３１５０００）

摘　要：草莓斑驳病毒（ＳＭｏＶ）和草莓轻型黄边病毒（ＳＭＹＥＶ）分布较广，危害较重。应用ＣＴＡＢ法提取草莓总ＲＮＡ，以优质的草莓总ＲＮＡ为模板，结合扩增内标的检测体系，建立了ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ的多重ＲＴ－ＰＣＲ检测体系，可以对草莓田间植株和试管苗进行快速稳定的病毒检测。关键词：草莓病毒；内标；多重ＲＴ－ＰＣＲ；病毒检测

中图分类号：Ｓ４３６畅６３９ 文献标志码：Ａ

文章编号：１００４－１５２４（２０１４）０１－０１０５－０５

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓａｎｄＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｍｉｌｄｙｅｌｌｏｗｅｄｇｅｖｉｒｕｓｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲｂａｓｅｄｏｎｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ

ＷＡＮＧＨｏｎｇ，ＷＡＮＧＪｉｎｇ－ｊｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＫｅ－ｌｉ，ＣＨＥＮＧＺｈｕｏ－ｍｉｎ

（ＮｉｎｇｂｏＨｕａＳｈａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｉｎｇｂｏ３１５０００，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ（ＳＭｏＶ）ａｎｄＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｍｉｌｄｙｅｌｌｏｗｅｄｇｅｖｉｒｕｓ（ＳＭＹＥＶ），ｗｈｉｃｈａｒｅｆｏｕｎｄｗｏｒｌｄ－ｗｉｄｅ，ｃａｎｃａｕｓｅｓｅｒｉｏｕｓｃｒｏｐｌｏｓｓｅｓ．ＴｏｔａｌＲＮＡｆｏｒｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）ｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｗｉｔｈＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ．ＡｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｎｇＳＭｏＶａｎｄＳＭＹＥＶｂａｓｅｄｏｎｎｄｈＢｇｅｎｅａｓｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ．Ｂｏｔｈｆｉｅｌｄｐｌａｎｔｓａｎｄｔｅｓｔ－ｔｕｂｅｐｌａｎｔｌｅｔｓｏｆｓｔｒａｗｂｅｒｒｉｅｓｗｅｒｅ

ｄｅｔｅｃｔｅｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｖｉｒｕｓ；ｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲ；ｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

草莓是多年生草本植物，因其果实色泽鲜艳、营养丰富、酸甜可口、效益可观而备受栽培者和消费者喜爱，有“水果皇后”的美誉。在浙江省，草莓是一项非常重要的农业特色优势产业。长期以来，草莓产区一直都依靠传统的匍匐茎繁殖法，草莓上多种病毒随无性繁殖不断增殖扩大，致使草莓种性退化，长势减弱，产量逐年下

降。侵染草莓的病毒据统计有２０多种，很多病

毒在商品草莓上不会诱发明显的症状，侵染后通常仅表现在失去活力、植株矮化产量低，以及通

常意义上的品种“退化”［１］

。影响草莓的主要蚜传病毒有草莓斑驳病毒（ＳＭｏＶ）和草莓轻型黄边

病毒（ＳＭＹＥＶ），它们分布较广，危害较重［２，３］

。解决病毒危害的关键是大面积推广应用无病毒苗，实行无病毒化生产。病毒检测是草莓病毒研究的一个重要环节，其水平的高低必将影响无病毒化生产的进程。以往草莓病毒检测的方法主要有小叶嫁接法、电镜观测和酶联免疫吸附

法［４，５］，但均存在局限性。ＰＣＲ技术是病毒检测的主要方法之一，目前已有利用多重ＰＣＲ技术对这两种病毒进行检测的报道［６－８］。多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉ－

ｐｌｅｘｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）是在１次ＰＣＲ反应中加入多对引物，特异性地扩增多个基因位点的反应，通过优化反应体系和反应程序，直到保证所有引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。由于草莓病毒多为混合侵染，综合表现症状，多重ＰＣＲ可以同时检测多种病毒或区分病毒的不同株系，极大地提高检测效率，降低检测成本。

本研究在利用单一ＲＴ－ＰＣＲ检测内标及ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ的基础上，通过调节和优化影响多重ＲＴ－ＰＣＲ的因子，建立了利用内标为基础的多重ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ。

１　材料与方法

１．１　植物材料、试剂和引物

已证明带有ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ的草莓品种布兰登堡（Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ）生长于温室（沈阳农业大学张志宏教授馈赠）。通过０畅２ｍｍ微茎尖获得的红颊、章姬和丰香保存于组培瓶中。

反转录酶Ｍ－ＭＬＶ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰ，ＲＮＡ酶抑制剂，ＤＮＡＭａｒｋｅｒ均购于上海生工公司，其他药品为国产分析纯。所有引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。

根据文献［６，７］进一步优化反应条件筛选到本研究所用引物，如表１。

表１　扩增ＳＭｏＶ，ＳＭＹＥＶ及内标片段的引物对

Ｔａｂｌｅ１　ＰｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｕｓｅｄｉｎａｍｐｌｉｆｙｉｎｇｏｆＳＭｏＶ，ＳＭＹＥＶａｎｄｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ

引物对序列（５→３）目的片段来源大小／ｂｐ

Ｄ１／Ｄ３ＴＡＡＧＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＴＧＴＧ

ＡＣＡＡＡＧ（正义引物）ＳＭｏＶ２１９

ＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＣＧＴ－

ＣＡＣＣＴＧ（反义引物）Ｎ１／Ｎ２ＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＣＧＴＡＴＡＣＧ

ＡＡＧＧＡＴＣ（正义引物）ｎｄｈＢ５７１

ＡＡＡＣＡＡＣＧＣＴＴＧＴＡＡＧ－

ＧＡＧＴＣＣ（反义引物）Ｙａ／Ｙ２ＣＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＴＡ

（正义引物）

ＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴ－ＧＧＧ（反义引物）ＳＭＹＥＶ８６１

１．２　ＲＮＡ的提取及电泳检测

从待测草莓植株上取幼嫩的叶片，采用改进

的ＣＴＡＢ方法提取总ＲＮＡ，具体方法如下：取０畅１

ｇ幼嫩的叶片放在５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，立即倒

入液氮，用玻璃棒快速研磨，研磨充分后加入１

ｍＬＣＴＡＢ提取缓冲液（２％ＣＴＡＢ；１００ｍｍｏｌ?Ｌ－１

Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８畅０；２０ｍｍｏｌ?Ｌ－１ＥＤＴＡ，１畅４ｍｏｌ?

Ｌ－１ＮａＣｌ），６５℃水浴１５ｍｉｎ；用等体积氯仿／酚

混合液（１∶１）抽提１次，上清液中加入１／４体积

１０ｍｏｌ?Ｌ－１ＬｉＣｌ，－２０℃放置１ｈ；１２０００ｒ?

ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，沉淀用５００μＬＤＥＰＣｄｄＨ２Ｏ

溶解，用等体积氯仿／异戊醇混合液（２４∶１）抽

提，将上清液转入新的离心管中，加入等体积

异丙醇，颠倒混匀，－２０℃放置２０ｍｉｎ；１２０００

ｒ?ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上清，放置超净工作台上

吹干，加入５０μＬＤＥＰＣｄｄＨ２Ｏ。此方法简单易

行，实验中除ＣＴＡＢ提取缓冲液用ＤＥＰＣ处理，

其他都不需要用ＤＥＰＣ处理，两次高压灭菌即

可，所用离心机为常温离心机。取５μＬ总ＲＮＡ

溶液在１％琼脂糖凝胶中电泳，电泳后ＥＢ染

色，检测ＲＮＡ完整性。

１．３　ＲＴ－ＰＣＲ

反转录反应体积为２０μＬ，其中包括模板５

μＬ，反转录酶１μＬ，随机引物、Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）引物各

０畅５μＬ，其他成分与操作步骤参考上海生工反转

录试剂盒说明书进行。反转录结束后取１μＬ进

行ＰＣＲ反应，反应体积为２０μＬ，反应体系中含

２μＬ１０×Ｂｕｆｆｅｒ，１畅５ｍｍｏｌ?Ｌ－１ＭｇＣｌ２，０畅２ｍｍｏｌ?

Ｌ－１ｄＮＴＰ，０畅２μｍｏｌ?Ｌ－１引物，０畅５ＵＴａｑ酶，用水

补足至２０μＬ。

对于单一ＰＣＲ反应，ＰＣＲ反应体积２０μＬ，

含１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２畅０μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ?Ｌ－１）

１畅２μＬ、ｄＮＴＰ（２ｍｍｏｌ?Ｌ－１）２μＬ、引物（１０μｍｏｌ?

Ｌ－１）０畅４μＬ、０畅７５ＵＴａｑ酶、反转录产物１畅０

μＬ。对于多重ＰＣＲ反应，ＰＣＲ反应体积２０μＬ，

含１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２畅０μＬ、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ?Ｌ－１）

１畅２μＬ、ｄＮＴＰ（２ｍｍｏｌ?Ｌ－１）２μＬ、引物（１０μｍｏｌ

?Ｌ－１）０畅４μＬ、０畅７５ＵＴａｑ酶、反转录产物１畅０

μＬ。引物对Ｄ１／Ｄ３，Ｙａ／Ｙ２，Ｎ１／Ｎ２依次加０畅６，

０畅４和０畅４μＬ。

单一ＰＣＲ反应程序分别为：（１）引物对Ｄ１／

?６０１?浙江农业学报　第２６卷　第１期（２０１４年１月）

３５个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ；（２）引物对Ｎ１／

Ｎ２的退火温度为５４℃，其他与Ｄ１／Ｄ３的相同；（３）引物对Ｙａ／Ｙ２的退火温度为５６℃，其他与Ｄ１／Ｄ３的相同。多重ＰＣＲ的反应程序为：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５７℃４０ｓ，７２℃６０ｓ，３５个循环；最后７２℃延伸５ｍｉｎ。用含ＥＢ的２％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

２　结果与分析

采用单一ＲＴ－ＰＣＲ技术，引物对Ｄ１／Ｄ３从感

染ＳＭｏＶ的草莓植株中稳定地扩增出ＳＭｏＶ的特异片段；引物对Ｙａ／Ｙ２可以从感染ＳＭＹＥＶ的草莓植株中稳定地扩增出ＳＭＹＥＶ的特异片段；引物对Ｎ１／Ｎ２从草莓病毒指示植物和草莓品种的反转录产物中扩增出了５７１ｂｐ的ｎｄｈＢ基因特异片段，而未加反转录酶则没有任何扩增产物，说明ｎｄｈＢ基因存在于草莓中，跨越内含子的引物设计是有效的，ｎｄｈＢ基因适合作为草莓ＲＮＡ病毒检测的内标。２．１　总ＲＮＡ的提取

分别从带毒草莓植株布兰登堡和脱毒草莓植株红颊、章姬和梦香的叶片中提取总ＲＮＡ，从电泳结果可以看出２８Ｓ，１８Ｓ谱带清晰（图１），这表明总ＲＮＡ没有发生严重的降解，完整性较好。以本研究方法提取的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ，

多次重复的结果稳定。

１：章姬；２：红颊；３：丰香；４：布兰登堡；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００。

图１　总ＲＮＡ电泳图

Ｆｉｇ．１　ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｐｉｃｔｕｒｅｏｆｔｏｔａｌＲＮＡ

２．２　内标的ＲＴ－ＰＣＲ

以Ｎ１／Ｎ２为引物，在不同的草莓品种的反转录产物中，都扩增出预期的５７１ｂｐ大小的特异片段，而未加反转录酶则没有任何扩增产物（图２）。说明ｎｄｈＢ基因存在于草莓中，跨越内含子的设计是有效的，该基因适合作为草莓

ＲＮＡ病

１：章姬；２：红颊；３：丰香；４：布兰登堡；５：未加反转录酶的ＲＴ－ＰＣＲ；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００。

图２　不同草莓品种ｎｄｈＢ基因的ＲＴ－ＰＣＲ

Ｆｉｇ．２　ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｄｈＢｇｅｎｅｂｙＲＴ－ＰＣＲｆｒｏｍｖａ－ｒｉｏｕｓｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｃｕｌｔｉｖａｒｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｉｎＲＴ－ＰＣＲ

毒检测的内标。

２．３　ＳＭｏＶ，ＳＭＹＥＶ的ＲＴ－ＰＣＲ检测

利用引物Ｄ１／Ｄ３在带毒草莓品种布兰登堡上扩增出预期的２１９ｂｐ大小的特异片段，且重复性好（图３）。利用引物Ｙａ／Ｙ２在带毒草莓品种布兰登堡上扩增出预期的８６１ｂｐ大小的特异片段，且重复性好（图３）。２．５　多重ＲＴ－ＰＣＲ检测体系

在结合内标的ＳＭｏＶ与ＳＭＹＥＶ检测中，带毒植株布兰登堡（已证明含有ＳＭｏＶ与ＳＭＹＥＶ）可以扩增出３条特异条带，一条是５７１ｂｐ的ｎｄｈＢ基因的特异片段，另外两条分别是２１９ｂｐ的ＳＭｏＶ的特异片段和８６１ｂｐ的ＳＭＹＥＶ特异片段（图３）。

２．６　多重ＲＴ－ＰＣＲ检测体系的特异性

应用多重ＲＴ－ＰＣＲ检测体系从侵染ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ的草莓植株叶片中扩增出５７１ｂｐ的草莓内标谱带，２１９ｂｐ的ＳＭｏＶ的特异片段和８６１ｂｐ的ＳＭＹＥＶ特异片段；侵染ＳＭｏＶ的草莓植株叶片中扩增出５７１ｂｐ的草莓内标谱带，２１９ｂｐ的ＳＭｏＶ的特异片段；侵染ＳＭＹＥＶ的草莓植株叶片中扩增出５７１ｂｐ的草莓内标谱带，８６１ｂｐ的ＳＭＹＥＶ特异片段；健康的草莓植株叶片中只扩增出５７１ｂｐ草莓内标谱带；不加反转录酶的反转录产物则没有扩增出任何特异性条带（图４）。结果显示：该多重ＲＴ－ＰＣＲ检测体系具有较高的特异性，可以同时准确地检测到草莓植株中复合感染的ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ，而且引入的草莓内标可以防止检测过程中假阴性情况的出现。

?

７０１?王　红，等．利用内标为基础的多重ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

１～４：ＳＭｏＶ的检测；５～８：ＳＭＹＥＶ的检测；９～１２：以内标为基础检测ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００。

图３　以内标为基础的ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ

Ｆｉｇ．３　ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳＭｏＶａｎｄＳＭＹＥＶｉｎｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｗｉｔｈＲＴ－ＰＣＲｂａｓｅｄｏｎｎｄｈ

Ｂｇｅｎｅａｓｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ

Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１：侵染ＳＭｏＶ和ＳＭＹＥＶ的草莓植株；

２：侵染ＳＭｏＶ的草莓植株；３：侵染ＳＭＹＥＶ的草莓植株；４：健康草莓植株；５：不加反转录酶的反转录产物为模板；６：清水对照。

图４　多重ＲＴ－ＰＣＲ特异性实验Ｆｉｇ．４　ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｍｕｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲ

３　讨论

草莓总ＲＮＡ的提取方法主要有Ｔｒｉｚｏｌ和商业化试剂盒，提取的ＲＮＡ效果并不理想，且价格高。Ｐｏｓｔｈｕｍａ等

［９］

利用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＣｒＶ的结

果不稳定，只有通过嵌套引物才可以检测出。而Ｋａｄｅｎ－Ｋｒｅｕｚｉｇｅｒ等

［３］

在检测ＳＭＹＥＶ研究中未

能筛选出有效的提取草莓总ＲＮＡ的方法，只有应用免疫捕获ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅＰＣＲ）进行检测。ＣＴＡＢ主要用于提取ＤＮＡ，利用ＣＴＡＢ提取的草莓ＤＮＡ可以稳定地进行ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍ－ｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）反应，说明其中的抑制物质已经基本去除。杨洪一等

［７］

利用ＣＴＡＢ法

提取草莓总ＲＮＡ，方法有所改进，但仍耗时较长，并且需要提前对各种玻璃器皿以及离心管用ＤＥＰＣ（焦碳酸二乙酯）进行处理，ＤＥＰＣ有致癌嫌疑。本研究利用改良的ＣＴＡＢ方法提取草莓总ＲＮＡ，此方法简单易行、用时少，３ｈ之内即可完成实验。实验中除ＣＴＡＢ提取缓冲液时用ＤＥＰＣ

处理，其他都不需要用ＤＥＰＣ处理，２次高压灭菌

即可，所用离心机为常温离心机。

单一ＰＣＲ中扩增效果好的引物作为多重ＰＣＲ的引物时，很可能因为引物间的相互作用而未建立多重ＰＣＲ体系。慎重选择引物可以使反应更容易优化，特别是在扩增多个片段时。合理选择引物后，对单个或多个目的片段不能良好地扩增是多重ＰＣＲ中最主要的问题。

本研究在植物病毒检测过程中引入内标，由于ＲＮＡ在提取过程中容易降解，再加上草莓是富含多酚多糖的植物，如果去除不干净很可能影响下一步的ＲＴ－ＰＣＲ反应。为了监测ＲＮＡ的质

量和ＲＴ－ＰＣＲ反应的正常进行，Ｂａｒｉａｎａ等［１０］

率先在ＲＴ－ＰＣＲ检测豆类病毒体系中引入内标（ｉｎ－ｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏ１），但是在健康植株上产生非特异性

条带；Ｎａｓｓｕｔｈ等［１１］

在果树病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测研究中，利用苹果酸脱氢酶基因和２－磷酸核酮糖羧化氧化酶基因作为内标，虽然可以应用于多种果树的不同组织，但无法有效区别ＤＮＡ模板和ＲＮＡ模板，只有在ＲＴ－ＰＣＲ反应前进行ＤＮＡ酶

解才可以起到监测作用。Ｍｅｎｚｅｌ等［１２］

在检测病毒体系中引入内标（ｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏ１），并且在应用内标时设计了跨越内含子区域的引物，实现了只对剪接后的ｍＲＮＡ进行特异扩增，防止产生假阳性结果。本研究引入的草莓内标是跨越内含子区域设计的，只对剪接后的ｍＲＮＡ进行特异性扩增，排除了基因组的干扰，同时也可以防止检测过程中假阴性情况的出现。参考文献：

［１］　麦斯ＪＬ．（张运涛，张国珍译）．草莓病虫害概论［Ｍ］．第２

版．北京：中国农业出版社，２０１２：１０８－１１０．

?８０１?浙江农业学报　第２６卷　第１期（２０１４年１月）

［２］　ＴｈｏｍｐｓｏｎＪＲ，ＬｅｏｎｅＧ，ＬｉｎｄｎｅｒＪＬ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ：ａ

ｔｅｎｔａｔｉｖｅｍｅｍｂｅｒｏｆａｎｅｗｆａｍｉｌｙｏｆｂｉｐａｒｔｉｔｅｐｌａｎｔｐｉｃｏｒｎａ－ｌｉｋｅ

ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，２００２，８３（１）：２２９－２３９．

［３］　Ｋａｄｅｎ－ＫｒｅｕｚｉｇｅｒＤ，ＬａｍｐｒｅｃｈｔＳ，ＭａｒｔｉｎＲＲ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕ－ｎｏｃａｐｔｕｒｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｓｓａｙａｎｄＥＬＩＳＡｆｏｒｔｈｅ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｍｉｌｄｙｅｌｌｏｗｅｄｇｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ

［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，１９９５，３８５：３３－４０．

［４］　ＦｒａｚｉｅｒＮＷ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｒａｆｔ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｎｓｔｒａｗ－ｂｅｒｒｙｂｙａｍｏｄｉｆｉｅｄｌｅａｆｇｒａｆｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ

Ｒｅｐｏｔｅｒ，１９７４，５８（３）：２０３－２０７．

［５］　韦石泉，吴元华．我国草莓斑驳病毒研究鉴定［Ｊ］．植物病理学报，１９９４，２４（４）：２９３－２９８．

［６］　ＴｈｏｍｐｓｏｎＪＲ，ＷｅｔｚｅｌＳ，ＫｌｅｒｋｓＭＭ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒａｐｈｉｄｂｏｒｎｅｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｖｉｒｕｓｅｓｉｎＦｒａｇａｒｉａ

ｓｐｐ．ｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈａｐｌａｎｔｍＲＮＡｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎ－ｔｒｏｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００３，１１１（２）：８５－９３．

［７］　杨洪一，张志宏，杜国栋，等．利用内标为基础的ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草莓斑驳病毒［Ｊ］．植物病理学报，２００５，３５

（２）：１１６－１２２．

［８］　杨洪一，张志宏，高秀岩，等．草莓轻型黄边病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测及其３’端序列分析［Ｊ］．园艺学报，２００５，３２

（３）：４０３－４０７．

［９］　ＰｏｓｔｈｕｍａＫＩ，ＨｏｎｇＹＧ，ＡｄａｍｓＡＮ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｃｒｉｎｌｅｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００１，５５１：

７５－７９．

［１０］　ＢａｒｉａｎａＨＳ，ＳｈａｎｎｏｎＡＬ，ＣｈｕＰＷＧ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｉｖｅｌｅｇ－ｕｍｅｖｉｒｕｓｅｓｉｎｏｎｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃ－

ｔｉｏｎｔｅｓｔ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４，８４（１０）：１２０１－１２０５．［１１］　ＮａｓｓｕｔｈＡ，ＰｏｌｌａｒｉＥ，ＨｅｌｍｅｃｚｙＫ，ｅｔａｌ．ＩｍｐｒｏｖｅｄＲＮＡｅｘ－ｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｏｎｅ－ｔｕｂｅＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃ－

ｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｒｏｌｐｌａｎｔＲＮＡｐｌｕｓｓｅｖｅｒａｌｖｉｒｕｓｅｓｉｎｐｌａｎｔｅｘ－

ｔｒａｃｔｓｌ［Ｊ］．ＪｏｕｍａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２０００，９０（１）：

３７－４９．

［１２］　ＭｅｎｚｅｌＷ，ＪｅｌｋｍａｎｎＷ，ＭａｉｓｓＥ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒａｐｐｌｅｖｉｒｕｓｅｓｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙｓｗｉｔｈｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ

ｐｌａｎｔｍＲＮＡａｓｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ

Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，９９（１－２）：８１－９２．

（责任编辑　张　韵）

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王　红，等．利用内标为基础的多重ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒