分子排阻色谱法

附录Ⅴ H 分子排阻色谱法

分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(Sephadex )和聚丙烯酰胺凝胶(Sepharose )等为填充剂,这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径,药物分子进入色谱柱后,它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内,大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部,在色谱过程中不被保留,最早被流动相洗脱至柱外,表现为保留时间较短;小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径,在色谱柱中滞留时间较长,表现为保留时间较长;其余分子则按分子大小依次被洗脱。

1.对仪器的一般要求

分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法,液相色谱泵一般分常压、中压和高压。在药物分析中,尤其是分子量或分子量分布测定中,通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC )。应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液,溶液的pH 值不宜超出填充剂的耐受力,一般pH 值在2~8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂,但不宜过浓,一般不应超过30%,流速不宜过快,一般为0.5~1.0ml/min 。

2.系统适用性试验

高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n )、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法,在一般情况下,同高效液相色谱法项下方法,但在高分子杂质检查时,某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时,其分离度的计算公式为:

单体与二聚体之间的谷二聚体的峰高 R 除另有规定外,分离度应大于2.0。

3.测定法

(1)分子量测定法 一般适用于蛋白质和多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法,选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品,除另有规定外,对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT )和十二烷基硫酸钠(SDS )处理,以打开分子内和分子间的二硫键,并使分子的构型与构象趋于一致,经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离,以对照品分子量(M W )的对数值对相应的保留时间(t R )制得标准曲线的线性回归方程lgM W =a +bt R ,供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。

(2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法 生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的特点,故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子聚合物分子量和分子量分布时,选用与供试品分子结构与性质相同或相似的对照品十分重要。

按各品种项下规定的方法,除另有规定外,同样采用分子量对照品和适宜的GPC 软件,以对照品重均分子量(M w )的对数值对相应的保留时间(t R )制得标准曲线的线性回归方程lgM w =a +bt R ,供试品采用适宜的GPC 软件处理结果,并按下列公式计算出供试品的分子量和分子量分布。

M n =∑RI i /∑(RI i /M i )

M w =∑(RI i M i )/∑RI i

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