GB4789.38-2012卫生部标准大肠埃希菌检验方法
前言
本标准代替GB/T 4789.38-2008 《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。
本标准与GB/T 4789.38-2008 相比，主要变化如下：
——修改了标准的中文名称；
——修改了培养基和试剂；
——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm TM 测试片计数法”；
——修改了附录A。
GB 4789.38-2012
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食品安全国家标准
食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产
品。
2 术语和定义
2.1 大肠埃希氏菌Escherichia coli
大肠杆菌
广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP
试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品
的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。
2.2 最可能数
基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b）冰箱：2 ℃～5 ℃；
c）恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃；
d）天平：感量为0.1 g；
c）均质器；
d）振荡器；
e）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500 mL；
g）无菌培养皿：直径90 mm；
h） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸；
i）菌落计数器；
j）紫外灯：波长360 nm～366 nm，功率≤6 W。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见附录A 中A.1。
4.2 EC 肉汤（E.coli broth）：见附录A 中A.2。
4.3 蛋白胨水：见附录A 中A.3。
GB 4789.38-2012
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4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P 试验用]：见附录A 中A.4。
4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A 中A.5。
4.6 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.6。
4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂：见附录A 中A.7。
4.8 营养琼脂斜面：见附录A 中A.8。
4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见附录A 中A.9。
4.10 结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）：见附录A 中A.10。
4.11 革兰氏染色液：见附录A 中A.11。
4.12 Kovacs 靛基质试剂：见附录A 中A.12。
4.13 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.13。
4.14 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.14。
GB 4789.38-2012
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5 大肠埃希氏菌MPN 计数（第一法）
5.1 检验程序
大肠埃希氏菌MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序
不产气
36℃±1℃ 18h～24h
36℃±1℃ 18h～24h
36℃±1℃ 48h±2h
44.5℃±0.2℃ 48 h±2 h
检样
25g（mL）样品+ 225ml 稀释液，均质
10 倍系列稀释
选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种LST 肉汤管
产气
EC 肉汤
不产气产气
EMB 平板划线
可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板
IMViC 生化试验，革兰氏染色
阴性管阳性管
查MPN 表
报告
GB 4789.38-2012
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5.2 操作步骤
5.2.1 样品的稀释
5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品，放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000
r/min～10 000 r/min 均质1 min～2 min，制成1:10 样品匀液，或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质
袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适
当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
5.2.1.3 样品匀液的pH 值应在
6.5～
7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。
5.2.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液
的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头反复
吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
5.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1
次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
5.2.2 初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST 肉汤），36 ℃±1
℃培养24 h±2 h，观察小倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养
48 h±2 h。产气者进行复发酵试验。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果。
5.2.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST 肉汤管中分别取培养物1 环，移种于已提前预温至45 ℃的EC 肉汤管中，放
入带盖的44.5 ℃±0.2 ℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24 h±2 h，检查小倒管内是否
有气泡产生，如未有产气则继续培养至48 h±2 h。记录在24 h 和48 h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC
肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。
5.2.4 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB 平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。观察
平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
5.2.5 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到
营养琼脂斜面或平板上，36 ℃±1 ℃，培养18 h～24 h。取培养物进行革兰氏染色和生化
试验。
5.2.6 鉴定
取培养物进行靛基质试验、MR-VP 试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生
化鉴别见表1。
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表1 大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别
靛基质（I）甲基红（MR） VP试验（VP）柠檬酸盐（C）鉴定（型别）
＋
－
＋
＋
－
－
－
－
典型大肠埃希氏菌
非典型大肠埃希氏菌
＋
－
＋
＋
－
－
＋
＋
典型中间型
非典型中间型
－
＋
－
－
＋
＋
＋
＋
典型产气肠杆菌
非典型产气肠杆菌
注1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
注2：生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作。
5.3 大肠埃希氏菌MPN 计数的报告
大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋――或－＋
－－。只要有1 个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST 肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST
肉汤阳性管数查MPN 表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN 值。
6 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）
6.1 检验程序
大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠埃希氏菌平板计数法检验程序
6.2 操作步骤
6.2.1 样品的稀释
按5.2.1进行。
6.2.2 平板计数
检样
25g（ml）样品+225ml 稀释液，均质
选择2 个～3 个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRBA-MUG 平板
10 倍系列稀释
紫外灯照射，计数发荧光菌落
报告结果
36 ℃±1 ℃ 18 h～24 h
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6.2.2.1 选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2 个无菌平皿，每皿1 mL。同时
取1 mL 稀释液加入无菌平皿做空白对照。
6.2.2.2 将10 mL～15 mL 冷至45 ℃±0.5 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心
旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。
凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
6.3 平板菌落数的选择
选择菌落数在10 CFU～100 CFU之间的平板，暗室中360 nm～366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板
上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC 25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳性
和阴性对照。
6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)
表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。__
GB4789.38-2012卫生部标准大肠埃希菌检验方法
前言 本标准代替GB/T 4789.38-2008 《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。 本标准与GB/T 4789.38-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中文名称； ——修改了培养基和试剂； ——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm TM 测试片计数法”； ——修改了附录A。 GB 4789.38-2012 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产 品。 2 术语和定义 2.1 大肠埃希氏菌Escherichia coli 大肠杆菌 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP 试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 2.2 最可能数 基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b）冰箱：2 ℃～5 ℃； c）恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃； d）天平：感量为0.1 g； c）均质器； d）振荡器； e）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500 mL； g）无菌培养皿：直径90 mm； h） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸； i）菌落计数器； j）紫外灯：波长360 nm～366 nm，功率≤6 W。
致泻大肠埃希氏菌与大肠杆菌
一、大肠菌群是指：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 二、大肠杆菌是大肠菌群众多细菌的一个种类而已。大肠杆菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。 三、致泻大肠埃希氏菌生物学特性 大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，统称为致泻性大肠杆菌，一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。 大肠埃希氏菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：光滑型、粗糙型、粘液型。大肠埃希氏菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。 大肠埃希氏菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，分解蔗糖因菌株而异，录素酶试验阴性，IMVi试验++--，有些菌株如碱性异型菌群，微产碱，不产气，无动力，易与志贺菌混淆。大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。现巳知有171个O抗原、99个K抗原和56个H抗原。 此菌对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但是在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。加热60℃，30分钟，此菌可灭活。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用 三、肠致泻性大肠埃希菌： 大肠杆菌是人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。本菌为革兰阴性的短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原(O抗原)、包膜抗原(K抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。O抗原是血清分型的基础，目前已发现有170多种，其中一些特殊的血清型具有病原性，能引起人类腹泻，故称为致泻性大肠杆菌，而由其引起之肠炎称致泻性大肠杆菌肠炎。世界各地广泛存在本菌感染，婴儿腹泻中检出率较高，在成人中亦可呈散在或暴发流行。临床表现为旅游者腹泻或食物中毒。新生儿病房及托儿机构可引起交叉感染而发生流行。 大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，一般认为是非致病菌。但一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性、发病机制、临床特征、流行病学特征、O 抗原血清型及细菌的毒力测定可将致泻性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)和肠集聚粘附性大
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程 1. 概述 致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。 2. 标本类型 粪便标本。 3. 鉴定 3.1 形态染色与一般大肠埃希菌相同。 3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。 3.3 生化反应与普通大肠埃希菌相似。 3.4 鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。IMViC++--， 3.5 不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。 3.6 操作步骤 3.6.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。 3.6.2 致病型大肠埃希菌的鉴定 肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。
肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA 探针）检测。 肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。 肠出血型大肠埃希菌(EHEC) 早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。 4. 药敏 参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。 5. 质量控制 参见质量管理程序。 6. 检验结果解释与分析 疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。 7. 临床意义
五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒...
五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒 研发背景 大部分的大肠杆菌是人或动物倡导的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病。致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发。根据发病机制、临床特征、流行病学特征、O抗原血清及细菌的毒力测定，可将致泻大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌（EPEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、粘附性大肠杆菌（EAEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）。目前针对致泻大肠杆菌的常规实验室检测方法仍然较为薄弱，需要研究快速、简便、准确的分子生物学方法。 【检验原理】 五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，天津生物芯片试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。 【使用方法】 1.试剂配制（试剂准备区） 从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。 2.PCR扩增（扩增和产物分析区）
将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时： Step 1 94℃ 5min Step 2 94℃ 30s Step 3 63℃ 30s 30 个循环 Step 4 72℃ 90s Step 5 72℃ 5min 3.结果判断（扩增和产物分析区） 从PCR管中取出2μl PCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。 样品观察到1487bp、910bp、544bp条带即为毒力基因uidA、bfpB和escV阳性，即为典型EPEC菌株。 观察到1487bp、544bp、324bp、244bp条带即为毒力基因uidA、escV、stx2A和stx1A 阳性，即为典型的EHEC菌株。 观察到1487bp、655bp和171bp条带即为毒力基因uidA、elt和estlb阳性，即为典型的ETEC菌株。 观察到1487bp和766bp条带即为毒力基因uidA和invE阳性，即为典型的EIEC菌株。 观察到1487bp、1111bp、400bp和102bp条带即为毒力基因uidA、pic、aggR和astA 阳性，即为典型的EAEC菌株。 阴性对照品结果应为阴性。 产品特点
微生物原始记录(大肠杆菌)
微生物检验原始记录 受理编号检（）号第页/共页 检验依据GB15979—2002 《一次性使用卫生用品卫生标准》 一、实验器材 1. 试验菌株名称：大肠杆菌，菌株号：8099，培养代数代，琼脂斜面培养基培养，培养条件： 2. 试剂及培养基配制、灭菌见《试剂及培养基配制记录C》： 第1次； 第2次； 第3次。 3．恒温水浴箱：编号。 4. 恒温培养箱：编号。 5.秒表：编号 6．样品名称：。 有效成份：，含量：，批号：。 二、方法 1. 操作步骤：按GB15979—2002 附录C4溶出性抗（抑）菌产品抑菌性能试验方法操作程序进行。受理编号：（）号第页/共页
三、结果 1. 第1次试验对大肠杆菌的抑菌效果 作用时间接种稀释倍数平皿生长菌数菌药管菌数抑菌率（min）（cfu/皿）（cfu/ml）（%） 2 5 10 20 阳性对照：接种稀释倍数： 平皿生长菌数： cfu/皿 菌液浓度： cfu/ml。 阴性对照：阴性对照：菌生长。 受理编号：检（）号第页/共页
2. 第2次试验对大肠杆菌的抑菌效果 作用时间接种稀释倍数平皿生长菌数菌药管菌数抑菌率（min）（cfu/皿）（cfu/ml）（%） 2 5 10 20 阳性对照：接种稀释倍数： 平皿生长菌数： cfu/皿 菌液浓度： cfu/ml。 阴性对照：阴性对照：菌生长。 3. 第3次试验对大肠杆菌的抑菌效果 作用时间接种稀释倍数平皿生长菌数菌药管菌数抑菌率（min）（cfu/皿）（cfu/ml）（%）2 5 10 20 阳性对照：接种稀释倍数： 平皿生长菌数： cfu/皿 菌液浓度： cfu/ml。 阴性对照：阴性对照：菌生长。 受理编号：检（）号第页/共页
大肠埃希菌
大肠埃希菌 1.概况：大肠埃希菌是肠道中重要的正常菌群，婴儿出生数小时后就进入肠道中并终生伴随，能为宿主提供一些营养作用的合成代谢产物，宿主免疫能力下降或细菌侵入肠道外组织或器官，即可成为条件致病菌，引起肠外感染，以化脓性感染和泌尿道感染最为常见，某些血清型大肠埃希菌具有致病性，能导致人类腹泻。 2.形态：中等大小的革兰阴性杆菌无芽孢，多数菌株有周身鞭毛，能运动；有菌毛包括普通菌毛和性菌毛 3.体内分布：大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下（如侵入肠外组织或器官）可致病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关，它们是病原性大肠杆菌，正常情况下极少存在于健康机体。 4.培养：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通的琼脂平板37℃培养24小时后，埃希菌形成圆形凸起灰白色S型菌落。在液体培养基中均匀浑浊的生长。 5.生化反应：能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸并产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，可与沙门菌，志贺菌等区别。吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为++--，IMViC试验为此结果，可判断为典型的大肠埃希菌，表明被检物已被粪便污染，有传播肠道传染病的危险 6.抗原构造：大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种，已确定的大肠杆菌菌体（O）抗原有173种，表面（K）抗原有80种，鞭毛（H）抗原
有56种。O抗原凝聚相对较慢，呈颗粒状。H抗原刺激机体主要产生IgG类抗体，H抗原的凝集出现较快，呈絮状。K抗原位于O抗原外层，为多糖，与细菌侵袭力有关。 7.生物学特性：本属细菌对干燥、腐败、日光等因素具有一定的抵抗力，在外界条件下可以生存数周或数月。对化学消毒剂的抵抗力不强，一般常用消毒剂和消毒方法均能达到消毒目的。通常情况下，对多种抗菌药物敏感。但由于长期滥用抗生素，对常用抗生素耐药现象普遍，不仅影响该病防制效果，而且亦成为公共卫生关注的问题。 8.致病物质 定植因子：又称黏附素（adhesin），可与黏膜表面细胞的特异性受体相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，最为人所知的是ETEC产生的由质粒编码的不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。LT有抗原性，分子量大，65℃经30min即被灭活，可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，增加环腺苷酸（cAMP）产生，使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST无抗原性，分子量小，100℃加热30min而不失活，可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性的鸟苷环化酶，增加环鸟苷酸（cGMP）产生，同样引起分泌性腹泻。 K抗原：具有吞噬作用 9.肠道外感染： 败血症：由大肠埃希菌尿道和肠道感染引起的。 新生儿脑膜炎：大肠埃希菌和B组链球菌是婴儿中枢神经系统感染的
大肠埃希菌的检查
药品中大肠埃希菌的检验 (1)按细菌总数测定方法制备供试液。 (2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 (3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。 (4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。 (5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。 (6)生化试验 ①乳糖发酵试验。将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～ 48 h。凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。 ②靛基质试验。将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。 ③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。呈鲜红色或橘红色为阳性反应。呈黄色为阴性反应。 ④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。 ⑤枸橼酸盐利用试验。将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。 (7)判断结果。经染色镜检证实为G–无芽孢短杆菌，乳糖发酵试验产酸产气，IMVC试验结果为++––或–+––的，可确认供试品中含有大肠埃希菌。
细菌性痢疾诊断标准GB 106002
细菌性痢疾诊断标准GB 106002-1995 前言 细菌性痢疾(以下简称菌痢)是由志贺菌(又称痢疾杆菌)引起的急性肠道传染病，是常见多发病，其发病率在我国法定报告的甲、乙类传染病中居首位，而且往往引起暴发或流行，对劳动力影响很大。根据《中华人民共和国传染病法》及《中华人民共和国传染病法实施细则》，特制定本标准。 本标准的附录A、附录B是标准的附录。 本标准的附录C、附录D是提示的附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出。 1 范围 本标准规定了细菌性痢疾和阿米巴痢疾的诊断标准及防治原则。 本标准适用于各级医疗、卫生防疫机构作为细菌性痢疾和阿米巴痢疾的诊断及防治依据。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB 4789.4—94 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 GB 4789.5—94 食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验 GB 4789.6—94 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 3 细菌性痢疾诊断标准及处理原则 3.1 诊断原则 须依据流行病学史，症状体征及实验室检查进行综合诊断。确诊则须依赖于病原学的检查。 3.2 诊断标准 3.2.1 流行病学史：病人有不洁饮食或与菌痢病人接触史。 3.2.2 症状体征 3.2.2.1 急性非典型菌痢 症状轻，可仅有腹泻、稀便。 3.2.2.2 急性普通型(典型)菌痢 急性起病、腹泻(除外其他原因的腹泻)、腹痛、里急后重、可伴发热、脓血便或粘液便、左下腹部压痛。 3.2.2.3 急性中毒型菌痢 发病急、高热、呈严重毒血症症状，小儿起病时可无明显腹痛腹泻症状，常需经灌肠或肛拭做粪检，才发现是菌痢。根据主要临床表现有以下类型：
大肠埃希菌检查法.docx
大肠埃希菌检查法 ESCheriChia COliTeSt MethOd 1. 目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2. 范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3. 责任者 QC化验员。 4. 程序： 4.1. 简述 4.1.1. 大肠埃希菌(ESCheriChia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属 的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠 埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大 肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MethylumbelliferyI- β -D-glucuronide , MUG和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应 作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase ，GUD) 约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUGS GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUGf靛基质试验结合，比单用MU可提高大肠埃希菌的检出率。如MUGf Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。 如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2. 仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(36 ± 1C ) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2. 5. 显微镜(1500X)
大肠杆菌实验报告
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌
大肠杆菌及其检验
大肠杆菌及其检验 大肠杆菌的生物学特性 ?简介： 大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。 附：肠杆菌科各属 大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。 ?形态与染色 大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。 有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 附：有动力是什么意思？请看动力试验。 革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。 大肠杆菌扫描电镜照片 大肠杆菌透射电镜照片 大肠杆菌分裂照片 最新：大肠杆菌革兰氏染色照片 ?培养特性 由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。 最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为 15-46℃。 在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：
（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。 （2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。 （3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。 此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。 附：菌落形态有什么用处？菌落形态学 生化反应 大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。 IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。 ?抗原构造 比较复杂，主要由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。 ?抵抗力 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。 致泻性大肠杆菌简介 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道 外感染。 某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（enterovirulent E. coli ）。 一般包括四种： 肠毒素性大肠杆菌（ETEC） 致病性大肠杆菌（EPEC）
大肠埃希菌
Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠埃希菌，检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole 试验为阳性或阴性即可报告结果。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶（GUD）。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色的反应强，易于观察。通常将MUG与靛基质试验结合，来检测大肠杆菌。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。 2．仪器、设备及用具 2.1无菌室微生物检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。 2.2 净化工作台 2.3 培养箱（36℃±1℃）。 2.4 高压蒸汽灭菌器。 2.5 显微镜（1500×）。 2.6 恒温水浴（45℃±1℃）。 2.8 离心机（500~4000r/min）。 2.9 电冰箱。 2.10 匀浆仪。 2.11 366nm紫外灯。 2.12 玻璃器皿、器具[参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2]。 3．试液、指示液。 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液。 3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 3.3 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液。 3.4 靛基质（Kovacs）试液。 3.5甲基红试液。
大肠杆菌检测方法(借鉴材料)
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC 化验员。 4.程序： 4.1.简述 4.1.1.大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等 5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2.用 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种 MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如 MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约 10 ％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG 被 GUD 水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达 6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用 EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用 IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1.无菌室 4.2.2.净化工作台 4.2.3.培养箱(36±1℃) 4.2.4.高压蒸汽灭菌器
大肠埃希氏菌鉴定试剂盒
大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒 E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒用途：用于大肠埃希氏菌的IMViC生化鉴定。大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒组成: 干制生化鉴定试剂:4种/盒×10 盒; 0.5麦氏浊度比浊管:1支; 配套试剂:Kovacs氏靛基质试剂1瓶、甲基红试剂1瓶、V-P甲、乙液试剂各1瓶; 使用说明书:1份 实验操作步骤: 1. 从铝箔袋中取出试剂盒,打开盒盖,在试剂盒的长条槽中加入0.5mL无菌水; 2. 用接种环从平板上挑取新鲜培养的单个纯菌落至适量无菌水中,制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液; 3. 接种菌悬液分别至试剂盒的4个圆孔中,每孔接种量0.2mL,盖上盒盖,36℃±1℃培养24h。 结果判定:
注:菌悬液浓度不宜过大,否则可能产生假阳性结果。保存条件和保质期:室温避光保存1年。 其他相关试剂盒： 名称用途及用法 大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒 E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 用于大肠杆菌的IMVC 生化系统鉴定(GB4789.38-2012)，包括蛋白胨水、MR、VP和西蒙氏枸橼酸盐共 4 种生化鉴定试验和配套试剂(靛基质、甲基红、VP甲乙液) 阪崎肠杆菌干制生化鉴定试剂盒Enterobacter sakazakii Dehydration Biochemical Identification Kit 用于阪崎肠杆菌的生化鉴定(GB4789.40-2010)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、西蒙氏柠檬酸盐、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蜜二糖、D-蔗糖和苦杏仁苷共10种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡) 志贺氏菌干制生化鉴定试剂盒Shigella Dehydration Biochemical Identification Kit 用于志贺氏菌的生化鉴定(GB4789.5-2012)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、靛基质、尿素、水杨苷、七叶苷、甘露醇、棉子糖、ONPG、甘油、葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸对照、粘液酸、三糖铁、半固体共17 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)
肠致泻性大肠埃希氏菌实验活动风险评估报告
肠致泻性大肠埃希氏菌 实验活动风险评估报告 一、生物学特性 (一)种类和细菌分型 大肠埃希氏菌是人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。本菌为革兰阴性的短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原（O抗原）、包膜抗原（K抗原）和鞭毛抗原（H抗原）。O抗原是血清分型的基础，目前已发现有170多种，其中一些特殊的血清型具有病原性，能引起人类腹泻，故称为肠致泻性大肠埃希氏菌。根据发病机制、临床特征、流行病学特征、抗原血清型及细菌的毒力测定可将肠致泻性大肠埃希氏菌分为5类：肠致病性大肠埃希氏菌（EnteropahogenicE.Coli,EPEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌（Enterotoxingen-icE.Coli,ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EnteroinvasiveE.Coli,EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌（EnterohemorrhagicE.Coli,EHEC)和肠集聚黏附性大肠埃希氏菌（Entero-aggregativeE.coli,EAggEC)。 (二)来源 大肠埃希氏菌属包括多种细菌，临床上以大肠埃希氏菌最为常见。大肠埃希氏菌(E.coli通称大肠杆菌，是所有哺乳动物大肠中的正常寄生菌，一方面能合成维生素B及维生素K供机体吸收利用，另一方面能抑制腐败菌及病原菌和真菌的过度增殖。但当它们离开肠道的寄生部位，进人到机体其他部位时，能感染发病。有些菌型有致病性，引起肠道或尿路感染性疾患。肠致泻性大肠埃希氏菌是指能使人、动物（尤其是婴儿和幼龄动物）感染及人食物中毒的一群大肠埃希氏菌。在自然界中，本菌分布广泛，主要的寄居场所是人和其他恒温动物的肠道中，是一类条件性致病菌。 (三）传染性 大肠埃希氏菌所引起的食源性疾病主要由食人被污染的食物和水而引起，可以导致肠道外感染，如泌尿系感染、菌血症、胆囊炎、肺炎及新生儿脑膜炎等，也会造成从轻微股泻到霍乱样严重腹泻，乃至引起致死性的并发症。肠侵袭性大肠杆菌由人一人传染而致病，推测为粪一口途径感染。 (四)传播途径 肠道内感染以粪一口途径为主，可通过食用污染的食品、水而传播，引起食源性细菌性腹泻。人与动物的密切接触也可传播。苍蝇、蟑螂等昆虫因其生活习性特殊，在一些细菌性腹泻的传播中发挥了重要作用。通过医务人员的手或污染公共物品可造成医院内感染从而引起医院内腹泻传播。多数大肠埃希氏菌在肠道内不致病，但如移位至肠道外的组织，则可引起感染，即肠道外感染。 (五)易感性
埃希氏大肠菌及检验
埃希氏大肠菌及检验 一、定义： 大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达 80-87%。与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。 二、生物学特性： 基本形态特征： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 培养特征： 由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为 15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为 6.8-8.0，所用培养基pH为 7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于 8.0则生长缓慢。 生化反应与血清学反应 大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC 生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。生化反应是鉴定大肠杆菌的主要方法之一，然而，大肠杆菌之间生化反应的差异非常常见，象：许多菌种非/迟发酵乳糖，但并不说明它们遗传上有明显不同，生化反应非典型的大肠杆菌菌株与典型菌株的DNA相关性在85%-100%。附表1为大肠杆菌生化反应特性表。其中H2S、脲酶、阿糖酸、吲哚、ONPG试验常为首选生化反应，其
控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程 1.目的 建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。 2.范围 适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。 3.责任者 QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部 4.内容 4.1检测准备 4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。 4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。 4.2 供试液的制备 4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。 4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。 4.2.2.1 可溶性液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 4.2.2.2 非水溶性液体供试品 油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。 4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品 称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 4.2.2.4 非水溶性供试品 取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。 4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。 4.2.2.7具抑菌成分供试品 当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每1ml分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每1ml的菌落数，共得2组数据，再以2组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。 4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。