半导体量子点在荧光能量共振转移种的应用

半导体量子点在荧光能量共振转移种的应用

摘要

荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。它的基本原理是荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。半导体量子点(quantum dots, QDs)由于其独特的光电性能, 在光电器件、生物标记等领域受到科研工作者的广泛关注，在荧光能量共振转移上也有很好的表现。. CdTe量子点与罗丹明B水溶液体系下的双光子激发荧光共振能量转移，以及铜酞菁复合体系荧光共振能量转移都具有非常好的潜力

关键词：CdTe量子点，罗丹明B水溶液，双光子激发荧光共振能量转移，铜酞菁复合体

1.引言

荧光共振能量转移(fluorescence resonance en-ergy transfer, FRET)是一种非辐射能量传递过程,通过偶极-偶极相互作用, 实现供体的激发态到受体的基态之间的能量传递. FRET的效率主要取决于供体吸收谱和受体荧光谱之间的光谱重叠程度、供体的荧光效率以及供体和受体之间的距离何月娣等对混合量子点器件的电致发光现象中的能量转移机理进行了报道. Wu等研究了以8-羟基喹啉衍生物的金属络合物为受体、M-MTDATA为供体制备成的紫外探测器的能量转移效应.目前, FRET 已经广泛应用在光电器件、金属离子测定、蛋白质分析以及核酸荧光探针等方面.

半导体量子点由于其优异的光化学特性而被广泛地应用于生物标记、荧光成像、光通信等领域. 同时, 相对于传统有机荧光染料分子, 量子点的发射光谱较窄而且不拖尾, 因而对于荧光共振能量转移, 以量子点为供体可减少供体与受体发射光谱的重叠; 量子点的激发光谱范围较宽, 当它作为能量供体时, 可以更自由地选择激发波长, 从而最大限度地避免对受体的直接激发; 量子点的发射光谱可调, 也就是说它可以作为吸收光谱在可见区的任一生色团的能量供体.

如邱柳等对单模腔内两个量子点的自发辐射现象进行了数值模拟;蒋童童等报道了通过将CdSe量子点耦合进Ag纳米立方体和Ag薄膜中, 产生的荧光增强现象等.与CdS和CdSe量子点相比, CdTe量子点具有更大的激子玻尔半径, 因此, 它在相同的尺寸下将具有更强的量子尺寸效应. 而且CdTe量子点具有较大的双光子吸收截面, 通过颗粒尺寸的改变来调节荧光波长, 实现较宽的连续可调的光谱范围. 因此,CdTe量子点在双光子生物成像、光动力疗法等领域具有广阔的应用前景。

2.CdTe量子点与罗丹明B水溶液体系下的双光子激发荧光共振能量转移

通过稳态荧光光谱、双光子激发时间分辨荧光光谱和荧光寿命的测量, 研究水溶液体系下, 以不同激发波长的CdTe量子点作为供体、罗丹明B (Rhodamine B, RhB)作为受体建立的双光子FRET体系的特性. 并通过对FRET效率以及F?rster半径的计算, 探究双光子激发下光谱重叠程度与FRET之间的关系.采用时间分辨荧光光谱技术研究了在双光子激发下不同尺寸的量子点与罗丹明B之间的荧光共振能量转移. 研究结果表明, 在800 nm的双光子激发条件下, 体系间能量转移效率随着供体吸收光谱与受体荧光光谱的光谱重叠程度增加而增加; 理论

分析表明, 供体和受体间的F?rster半径增加是导致其双光子能量转移效率增大的物理原因. 同时, 研究了罗丹明B浓度对荧光共振能量转移效率的影响. 研究结果表明, 量子点的荧光寿命随着罗丹明B浓度的增加而减小; 量子点与罗丹明B之间的荧光共振能量转移效率随着罗丹明B浓度的增加而增加; 当罗丹明B浓度为3.010 5molL 1时, 双光子荧光共振能量转移效率为40.1%.

可以得知双光子激发下QDs-RhB水溶液体系的FRET特性, 并且通过时间分辨荧光分析体系统测得样品的荧光寿命, 得到了样品的FERT效率. 理论计算得到了QDs1&RhB, QDs2&RhB和QDs3&RhB的F?rster半径R分别为7.40, 6.03,5.56 nm. 实验和理论分析揭示了在相同条件下F?rster半径R0和光谱重叠程度的正比关系. 更大的R0意味着在供体-受体对中具有更高的可能性来实现FRET.另外, FRET效率随着A/D浓度比的提高而有所增加, 并达到了40.1%的水平. 未来QDs-RhB体系将在生物医学、光电器件等领域具有光明的前景.

3. CdTe量子点-铜酞菁复合体系荧光共振能量转移

半导体量子点荧光能量共振转移中，酞菁因为其中心的两个氢原子可以被大部分金属原子取代, 外围酞菁环上可以连接上不同的取代基而较容易合成各种类型的酞菁, 已逐渐成为一种新型的“功能性染料”.

基于光诱导量子点-有机染料之间能量转移机理和转移效率的研究在生物医学中有着特别重要的作用. 例如, 2003年, 美国凯斯西储大学Samia等。发现CdSe量子点受到激发后发出568 nm的光, 通过荧光共振能量转移过程, 有效地激发硅酞菁, 进而产生单线态的氧; 同时也通过激发态三线态能量转移, 与临近的O2作用, 产生三线态的氧, 率先拉开了量子点酞菁体系荧光共振能量转移研究的序幕. 随后, Shi等、Chou研究小组、Ma等、Nyk等就不同的量子点酞菁材料和激发波长对量子点酞菁复合体系荧光共振能量转移进行了研究, 但对于量子点酞菁体系荧光共振能量转移的具体机理和原理并未明确阐释. 以上研究工作都是基于单光子吸收过程的能量转移过程, 采用的激发光源都是低于700 nm的紫外-可见波长, 而基于双光子吸收过程的光动力疗法(PDT)应用的研究引起了人们的极大兴趣. 这主要是因为紫外-可见波段的光只能穿透皮肤几个毫米深度, 这就限制了用PDT治疗人体内的局部病灶.而基于双光子吸收过程的PDT对应的吸收频率在700—1100 nm波段, 该波段的光对人体组织有更好的透过性, 可以对更深的病灶进行成像和治疗;另一方面, 双光子吸收效率与光强的二次方成正比, 因此该过程被集中在焦点附近更小的体积内,从而可以有效提高空间分辨率, 避免损伤正常的细胞组织.所以, 研究双光子激发量子点-铜酞菁复合体系之间荧光共振能量转移的过程具有重要意义. 本文采用波长为780 nm、脉宽为130 fs的激光作为激发光源, 利用稳态荧光和时间分辨光谱法研究了CdTe量子点-铜酞菁复合体系之间的荧光共振能量转移过程.

采用超快时间分辨光谱技术研究了CdTe量子点-铜酞菁复合体系的荧光共振能量转移, 分析了铜酞菁溶液浓度和激发光功率对复合体系荧光共振能量转移效率的影响. 实验结果表明: 复合体系中CdTe量子点的荧光寿命随着铜酞菁溶液浓度的增加而减少, 荧光共振能量转移效率增加; 当激发光功率增加时, 复合体系中CdTe量子点的荧光寿命增加, 荧光共振能量转移效率减少, 这是由热效应引起的电子交换和双光子诱导的高阶激发态跃迁所引起的. 当CdTe量子点-铜酞菁复合体系中CuPc浓度为1:510 4mol/L,激发光功率为200 mW时, 荧光共振能量转移效率为43.8%.结果表明CdTe量子点-铜酞菁复合体系是非常有潜力的第三代光敏剂.

4.总结

CdTe量子点与罗丹明B水溶液体系下的双光子激发荧光共振能量转移效率随着A/D浓度比的提高而有所增加, 并达到了40.1%的水平. CdTe量子点-铜酞菁复合体系中CuPc浓度为1:510 4mol/L,激发光功率为200 mW时, 荧光共振能量转移效率为43.8%.两种荧光共振能量转移效率都达到了40%，在将来生物医学、光电器件等领域都将有非常大的应用潜力。

5.参考文献

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1荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个

1.荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。 优点 1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子, 2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像, 3.准确度高，操作简便 4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息, 缺点 首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变; 其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰; 另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。

2.蛋白质双杂交技术 原理 以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。 酵母双杂交系统的优点及局限 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用

荧光共振能量转移技术的基 本原理和应用 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量

荧光共振能量转移(FRET)技术在生物研究探究中的运用资料精

荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用 高裕锋分析化学B200425012 摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。 关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。 生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。其中对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2]。本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。 一、FRET基本原理[3] FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster[4,5]创立了理论原理。FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10 nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。 图1 产生FRET条件示意图

FRET 的效率用E 表示，E 用式（1）计算：其中R 0为Foster 距离，表示某一给定给体与受 60660R E R R =+ （1） 240D DA R const n J κφ?=???? （2） 体间能量转移效率为50％时的距离；R 为给体与受体的实际距离。R 0可由式（2）计算：其中κ2 是方向因素,n 是溶剂的反射系数,φD 是供体探针结合到蛋白的量子效率, J DA 是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。 由式（2）可看出R 0对于给定的给－受体是一个特征值，因此，式（1）中E 值与 R 的关系紧密，这也成为了FRET 用于测定分子间或基团间距离的重要理论依据。 E 值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（ E=1- I DA / I D ，I DA 表示A 存在时D 的荧光强度）；用量子产率表征（ E=1-φDA /φD ）；用荧光寿命表征（E=1-τDA /τD ）。这表示研究FRET 可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。 随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测FRET 地发生。 二、FRET 探针 FRET 需要两个探针，即荧光给体与荧光受体，要求是给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定交叠，而与受体的发射光谱尽量无交叠。 常用的探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。 荧光蛋白[6]是一类能发射荧光的 天然蛋白及其突变体，常见的有绿色荧光蛋白（GFP ）、蓝色荧光蛋白（BFP ）、 青色荧光蛋白（CFP ）和黄色荧光蛋白（YFP ）等。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可 根据需要组成不同的探针对。荧光蛋白的突出优点是自身为生物分子，可有效地与目标分子融 合，更易于在生物环境中使用，且其种类多，可满足不同光谱需要。其缺陷是分子体积大， 空间分辨率较低，且可能与目标分子作用产生化学发光，需要较长地时间来确定荧光形式， 不利于动力学研究。为克服这些缺陷，常使用荧光蛋白与其他染料联用或用其他染料对来研究。 传统有机染料是指一些具有特征吸收和发射光谱地有机化合物组成地染料对。常见的有荧光素、罗丹明类化合物和 青色染料Cy3、Cy5等。该类染料分子体积较小，种类较多且大部分为商品化的分子探针染料，因此应用较为广泛。 镧系染料[7]一般与有机染料联用分 别作为FRET 的给－受体，其主要优点是：测量量可

荧光共振能量转移

FRET技术研究PEDF和目标蛋白 之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的 相互作用 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。） 以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构 建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白 质b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。）

荧光漂白恢复_荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI 于 淼① 高 建① [文章编号] 1672-8270(2009)06-0008-02 [中图分类号] R 197 [文献标识码] B Characteristics of application and technology on FRAP , FRET and FCS/Yu Miao , Gao Jian//China Medical Equipment,2009,6(6):8-9. [Abstract] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) are three experimental techniques based on the fluorescence analysis that are commonly used to study molecular interaction. In this article, we will discuss and compare the application and technical specifications for FRAP , FRET and FCS.[Key words] FRAP; FRET; FCS; Fluorescence Analysis [First-author's address] Laboratory Center, China Medical University, Shenyang 110001, China. 荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点 [摘要] 荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术，常用来研究分子间相互作用。对三种技术的特点做以比较和讨论。 [关键词] 荧光漂白恢复；荧光共振能量转移；荧光相关光谱；荧光检测 作者简介 于淼,女,(1980- )，硕士，助教。现就职于中国医科大学实验技术中心，主要从事激光扫描共聚焦显微镜工作。 FRAP：经荧光素标记的某一区域被光照射后，荧光物质的光化学结构被破坏，荧光强度下降，但随之此处荧光强度会逐渐恢复，荧光强度与恢复强弱及快慢代表周围分子扩散的速率或分子运动速度[1]。 FRET：受激态荧光素（供体）将其能量向另一个荧光素（受体）传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。测定FRET程度的参数，包括供体淬灭、受体发射、供体荧光寿命、供体荧光去极化等[2]。 FCS：是一种通过检测微区内（共焦体积）分子 的荧光信息（强度、波动、波长等）来分析样品特性的检测 技术，类似于传统的荧光分光光度计，主要用于液态样品的成份分析[3]。 以上三种技术的主要参数有： 扩散率：测量扩散的速率，通常表现在分子和分子络合物的扩散系数。 多组分扩散：用来检测和区别单个和多组分之间扩散的能力。 运动分量：检测能够自由扩散的组分。 ①中国医科大学实验技术中心 辽宁 沈阳 110001

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。

单分子荧光共振能量转移技术

研究生光谱 技术与应用课程 作业 河南大学 单分子荧光共振能量转移技术 学生：郭爱宇 学号：104753120870 学院：物理与电子学院 年级专业：2012级光学工程 课程名称：光谱技术及应用

指导老师：郭立俊教授

单分子荧光共振能量转移技术 摘要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。 关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团 1 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性（single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动(rotational motions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(single pair

荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展

＊［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０９７１０８１；３０８７０９３２； ８１０７０９６１）；山东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ． ＺＲ２０１１ＣＭ０２７；ＺＲ２００９ＤＺ００４）；山东省泰山学者专 项基金 △［通信作者］陈京，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｃｈｅｎ＠ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋＪ　Ｊｉｎｉｎｇ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１２，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９７６０．２０１２．０１．０２０·综述·荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展 王　宏１　蔡　欣１　白　波２　陈　京２Δ （１泰山医学院基础医学院，山东泰安２７１０１６；２济宁医学院神经生物学研究所，山东济宁２７２０６７） 摘　要　荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术是近１０年来出现的一种新的检测蛋白质－蛋白质相互作用的技术。它的最大优势是能从“时间、空间、动态、连续”对活细胞中蛋白质之间的相互作用进行检测，该技术不但可以与其他技术结合来研究细胞膜上蛋白质之间的相互作用；而且还可用于分析细胞膜－细胞质－细胞核中所发生的信号转导途径。资料显示，ＦＲＥＴ技术所发挥作用是最近出现的几种技术所无法企及的，这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有深远意义。 关键词　荧光共振能量转移；蛋白质－蛋白质相互作用；信号转导 中图分类号：Ｑ２７４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－９７６０（２０１２）０２－０６０－０４ 机体细胞中种类繁多的蛋白质各具不同的生理功能，从而使细胞对胞外信号做出不同的生物学反应。蛋白质的功能作用经常受不同条件下与不同配体间相互作用的调节。蛋白质之间的相互作用能够整合来自不同信号通路的信号并协调细胞内部的调节机制［１］。因此，研究蛋白质之间相互作用能够给这些研究提供新的见解。在过去的２０年中，已经开发了很多用于探测蛋白质相互作用的技术和方法，这些技术一般分为两部分，１）体外方法，例如免疫共沉淀、ｆａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ、ＧＳＴ融合蛋白沉降技术等；２）体内方法，例如酵母双杂交系统，但是这些方法都具有一定的局限性。一方面，基于机械的、离心力高的或去垢剂的细胞裂解，上述方法都可能会改变蛋白质－蛋白质相互作用的自然状态；另一方面，上述技术无法提供活细胞内的特定蛋白间相互作用的时空信息［２］。近年来研究开发的荧光共振能量转移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎ－ｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）却能克服以上缺点，可以在活细胞中实时动态观测蛋白质之间的相互作用。更重要的是，ＦＲＥＴ还可以与其他技术结合［３］，如生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）、蛋白互补技术（ＰＣＡｓ）等，既能研究两个蛋白之间的相互作用，还能用来研究３个或更多蛋白之间的相互作用，甚至是对信号网络的研究。本文就ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ与其他一些技术的结合及其应用做一简要综述。１　荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术的原理 ＦＲＥＴ理论描述的是两个荧光团之间的能量转移（图１）。在能量传输过程中，其中的一个荧光团作为能量供体（Ｄ），另一荧光团作为能量受体（Ａ）。以适当的激发光照射Ｄ，将会产生振荡偶极子，如果Ｄ的基态和Ａ的第一激发态的振动能量差相当，或者Ｄ的发射光谱与Ａ的吸收光谱能有效重叠时，当Ｄ与Ａ靠近时，或者说Ｄ与Ａ的偶极子之间的距离足够近时即能产生共振，通过偶极－偶极耦合作用将能量从Ｄ向Ａ转移，即发生非放射能量共振转移；Ａ接受能量从而发射出特异性荧光。在此共振能量转移过程当中，Ｄ特异性荧光的衰减或者Ａ特异性荧光的增强即可被检测到，从而实现ＦＲＥＴ检测［４］。 ＦＲＥＴ中两个常用的荧光蛋白为青色荧光蛋白（ｃｙａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦＰ）和黄色荧光蛋白（ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＹＦＰ）。ＦＲＥＴ具有广泛的应用前景，在蛋白质、ＤＮＡ等复合物的研究方面发挥重要作用。Ｋｈａｎ等［５］用ＦＲＥＴ检测出溶血磷脂胆碱能够通过迅速磷酸化和内化来快速激活Ｇ２Ａ，Ｇ２Ａ的活化能促使Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１和Ｇβγ的释放，Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１会使胞质内的Ｃａ２＋浓度升高及Ｇ２Ａ的激活促使ＧＲＫ６和β－ａｒ－ｒｅｓｔｉｎ的循环利用；而Ｇβγ能够与激活的Ｈｃｋ相互作用。Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等［６］构建了一对融合的锌指结构蛋白，它们是一种具有Ｎ端二聚化序列和Ｃ端ＧＦＰ突变体的荧光传感蛋白。他们分别在锌指结构的末端标记ＧＦＰ的突变体ＣＦＰ和ＹＦＰ，将这一对锌指结构蛋白混合，并且加入特异 ０６

单分子对荧光共振能量转移(spFRET)

单分子对荧光共振能量转移（spFRET）
生物物理学系 郑晓惠 学号 10281034 一 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在 单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS） 探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的 综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个 整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效 应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体 系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程 的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。 2002 年美国第 46 届生物物理年会表明单分子仍是 生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主 要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子 荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分 子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行 单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子 轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重 要的地位。 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特 性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、 反应动力学、构象动力学、分子运动自由度 (molecular freedom of motion)及在化学和静电环境 下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研 究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构 象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光 偏 振 的 各 向 异 性 （ single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的 构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动 (rotational motions)。 另一个是单分子对荧光共振能 量转移(single pair fluorescence resonance energy transfer, spFRET)，在单分子水平测量一个分子内 或两个不同分子间的距离变化和相互作用。本文 主要就后者做简要介绍。 二 原理 荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团 离的较近，且其中一种生色团（供体, donor）的发 射谱与另一种生色团 （受体, acceptor） 的激发谱有 相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因 供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供 体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而 受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光 寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生 色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃 迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系， 其经典公式为 E=R06/(R6+ R06), R0 为能量传递达到 50%的距离。选定供、受体对之后，可将 R0 看作 恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振 程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值 就可得出 E。利用 R0 和实验测得的 E 就可测得供 受体间的距离 R。 用此方法测量生色团距离的方法 被称为光谱尺，可测量 1.0-10.0nm 之间的距离。 spFRET 是在一个生物大分子或两个相互作用的分 子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的 发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振 能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两 点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不 确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可 通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间 变化推测生物大分子在生命活动中的构象变化。 该技术不仅有非常好的静态定位能力，也能提供 分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的 动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统， 因此能在毫秒时间尺度内观察这些变化，从而将 具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法 扩展， 可用于研究生物多聚体的组成动力学、 DNA 限制性内切酶酶切反应，以及 DNA 发夹结构的去 折叠等。 三 方法 1 设备 单分子荧光探测必须满足两个基本要求，一是在 被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作 用；二是要确保单分子的信号大于背景的干扰信 号。背景信号来自于 Raman 散射、Rayleigh 散射、 溶剂中杂质、盖玻片产生的荧光和探测器的暗电 流。因此，进行单分子探测要求 (1) 激发容积要 小，因为背景的吸收与激发体积成正比，尽量减 小激发体积可降低背景干扰， （2）高效的收集光 学系统， （3）灵敏的探测器， （4）采用针孔装置， 或将溶剂中杂质预漂白以及用低荧光光学材料等 方法清除背景荧光。 常 用 的 装 置 是 近 场 光 学 扫 描 显 微 镜 (near-field scanning optical microscope NSOM)，其最小激发 体积小于 10-2m3。该方法在单分子荧光的探测中 发挥了很重要的作用。可监测单个生物大分子的 构造变化，例如旋转和纳米水平上的距离变化。 其不足是扫描时需要通过复杂的控制系统来保持 适当的样品与探针之间的距离，并且其近场激发

生物发光共振能量转移

BRET 生物发光共振能量转移 技术简介： 生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP 融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP 之间距离比较近的时候 (10-100?)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm 的发射光，BRET 量化的程度以发射光530nm 和480nm 的比率表示。 实验流程 1、用于BRET的表达质粒构建； 2、融合蛋白表达检测； 3、BRET实验； 4、实验结果分析及提交实验报告 客户提供 1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆） 2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供） 公司提供 详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。 服务周期和价格 具体咨询本公司 荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移-FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer） 指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。

（1）FRET发生条件： 能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（>30%）； 作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm； FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R 偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。 （2）FRET的应用： 通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。 （3）FRET常见的供体-受体荧光分子对： 荧光蛋白 类： 染料类：