AKTA蛋白纯化系统操作指导

AKTA蛋白纯化系统操作

AKTA蛋白纯化系统操作 AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。 1、认识AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是： FIG 1、AKTA EXPLORER主机 ? Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer 100，流速范围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。在AKTA explore10，流速范围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。 ? Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）? Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图

AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。 分离装置由UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。 2、一般操作 2.1 开机 按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig 3） Fig 3、Unicorn的操作界面 2.2准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过0.45μm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。 2.3清洗及管道准备 首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在system control窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pump wash explorer，选中A1,B1管道为ON，execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4) Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作 2.4安装层析柱

纯化水系统操作、维护保养标准操作规程

1 目的 建立纯化水系统使用的标准操作规程及维护保养标准操作规程。 2 范围 纯化水系统的操作及维护保养。 3 职责 纯化水系统操作人员、维护人员按本规程操作，设备办对本规程有效执行承担监督检查责任。 4 内容 4.1 纯化水系统工作流程 4.1.1 本系统采用反渗透系统生产纯化水,其工作流程如下图表示 4.1.2 水质要求 4.2 标准操作规程 4.2.1 打开原水进水按钮，观察原水罐中是否有半桶以上的水，如果没有达到半桶以上，待其水位达到后，在进行下面操作

4.2.2 检查砂罐是否按照要求进行定期反洗（三天/次）。 4.2.3 检查炭罐是否按照要求进行定期反洗（三天/次）。 4.2.4检查混床是否按照要求进行定期维护（每周/次），将混床的“上进水”开，“下排水”开。 4.2.5制水前，检查各阀门的位置、管道是否正常，确定无异常后可以两种方案开启纯水系统： 4.2. 5.1将纯化水机开关钮（自动/停止/手动）调节至“自动”状态，纯水机自动运行。 4.2. 5.2将纯化水机开关钮（自动/停止/手动）调节至“手动”状态，开启原水泵启动按钮、一级高压泵启动按钮、二级高压泵启动按钮。 4.2.6观察仪器上RO 电导率的变化情况，直至电导率到达10μs/cm 以下，数值稳定后，计时10min.时间到后关闭中转水箱下排水。当RO 电导率大于10μs/cm 需更换反渗透膜； 4.2.7在RO 水位超过1/3时，开启EDI 启动按钮。观察仪器上EDI 电导率的变化情况，直至电导率到达3μs/cm 以下，数值稳定后，计时10min.时间到后关闭中转水箱下排水。当RO 电导率大于3μs/cm 需更换反渗透膜； 4.2.8观察压力表和流量计是否在合格范围内

纯化水系统管理规程

文件内容： 一. 目的： (2) 二. 适用范围： (2) 三. 职责： (2) 四.定义 (2) 五. 内容：............................................................................................................................ * 1 ................................................................................................................................................. * 2 ................................................................................................................................................. * 3 ................................................................................................................................................. * 4 ................................................................................................................................................. * 六. 附录：........................................................................................................ . * 七. 变更记载及原因：.. .......................................................................................................颁发部门：质量保证部 分发清单： ■生产技术部■质量保证部■质量控制部■工程部■固体车间■人事行政部□计划财务部■注册研发部■营销部■提取车间

蛋白纯化的基本思路

蛋白质的提取和纯化-- 选择分离材料及预处理蛋白质的提取和纯化-- 选择分离材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。 蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（ 1 ）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体 含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处， 开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料， 用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100 毫克菌体/毫升浓度，在1KG 至10KG 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破 坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物 降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以

GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程

蛋白纯化系统操作流程 一、蛋白的诱导：蛋白原核表达 1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中（分区划线），37℃培养过夜； 2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中，37℃振摇过夜； 3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中，振摇2h（留样1ml）； 4、加入一定终浓度IPTG，37℃诱导表达4h（留样1ml），离心，弃上清收集细菌。 存入4℃。 二、蛋白表达状态分析（可溶性or包涵体表达） 取少量（1ml）诱导菌体沉淀，加入不含变性剂（如盐酸胍，尿素等）PBS（150μl），超声裂解。分离上清和沉淀，分别SDS-PAGE电泳。 三、蛋白的纯化 纯化前准备 1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液， Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。 2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂 3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素 注： 1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则 需先用含有尿素的buffer进行透析 2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH 值法等可被应用，详见说明书 Bingding buffer 中咪唑的浓度 在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。 Buffer 的准备

所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤 所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低 推荐buffer Bingding buffer：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 20- 40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！） 样品准备 样品需被充分溶解。过柱前经0.45 μm滤膜过滤。样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。 重力纯化法Ni-NTA Column 准备 1. 温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。 2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。 3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。 4. 用bingding buffer 重复第3步。 5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurry 样品与Ni 柱结合 1.每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白 2.将混合物室温，低速振荡孵育1h Buffer 洗涤及洗脱 1.离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4℃for SDS-PAGE

纯化水系统运行管理规程

纯化水系统运行管理规程 一、目的：制订纯化水系统运行管理规程，规范系统运行监控、维护及使用管理。 二、范围：本规程适用于公司制剂车间纯化水系统的运行管理。 三、职责：生产技术部、产品质量部、工程设备部、纯化水操作工及纯化水检验员对本规程的实施负责。 四、定义： 4.1饮用水：是指以天然水经净化处理所得并由当地市政供水管网集中供给作为纯化水制备原水的生活用水，其质量标准应符合现行中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的有关要求； 4.2纯化水：是指以饮用水为原水经二级反渗透法制得的制药工艺用水，其质量标准应符合现行《中国药典》2010年版二部纯化水项下的有关规定。 五、内容： 5.1 纯化水设备的选型与购买管理： 5.1.1 纯水设备的购买须遵循本公司关于设备选型与购置的管理规程执行。 5.1.2 在选择生产厂家时宜选用有较多设计、制造经验和良好声誉的厂家。 5.2 纯化水设备的设计与安装： 5.2.1 纯水设备、管道的设计应避免死角、盲管，横向管道要有一定角度防止可能产生的残水积存，储罐的通气口应安装不脱落纤维的疏水性除菌滤器。 5.2.2 在纯水设备中与水接触的所有储罐、管道、管接头、阀、泵的材质应使用物理和化学性质稳定的无毒耐腐蚀的材料，如304、316、316L不锈钢。 5.2.3 纯化水设备及其输送系统的设计、安装、运行和维护应确保制纯化水达到其设定的质量标准，设备的运行产能不得超出其设计能力。 5.2.4 纯化水的制备、贮存和分配应采用循环方式或其他有效方式能防止微生物的滋生。 5.3 纯化水系统设备的清洁和使用： 5.3.1纯化水设备的操作人员，必须经过培训考核合格后才能上岗，其操作应能充分发挥制水设备的性能和产能。 5.3.2 纯化水岗位操作人须按标准操作规程和清洁消毒规程，对系统设备进行操作和定期的清洁、清洗和消毒，并有相关记录。发现纯化水微生物污染达到警戒限度、纠偏限度时，应按相关操作规程予以处理。 5.3.3对纯化水的储存和输送分配应保持封闭和循环，各用水车间不得自行储存纯化水，且纯化水箱内的纯化水储存时间不得超过24小时。超时没有能使用完时，则应放掉这箱水重新制备。

蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明

蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明 Biologic-LP是蛋白质层析纯化系统, 其原理是利用不同蛋白分子所具有的特性（如等电点、分子量及亲水或疏水性）与层析柱中的介质产生的吸附作用后，再用相应的洗脱液来对吸附在层析柱上的蛋白进行洗脱。根据目标蛋白及不同层析柱介质的特性，设计相应的洗脱程序可以使目标蛋白与其他杂蛋白先后从层析柱上洗脱下来。通过观察紫外光的吸收峰，可分别收集不同时段洗脱下来的蛋白液。蛋白混合物通过这样的程序可被分离至单个蛋白。通常分布在混合物中的目标蛋白需要通过组合而不是单一的层析路线来进行分离操作。常规的分离路线如通过疏水层析—离子交换—疏水层析的技术路线来有效分离目标蛋白。 本层析系统使用主要分为三个部分。首先在使用前确认分离的技术路线和使用的层析柱。其次根据层析柱使用的要求配制相关试剂和确定层析过程的参数。最后通过层析操作分离纯化目标蛋白，并清洗层析柱和管道以确保仪器能长期有效使用。 一设计蛋白的纯化路线及选择不同的层析柱及层析方法根据目标蛋白的特性及来源，设计纯化的路线并确定每一步操作所需要的层析柱及层析方法。根据不同层析方法的要求，准备蛋白样品及洗脱液及洗脱方式（如线形洗脱或梯度洗脱）。而后确认层析操作中的主要参数。

二层析系统的操作 以下是对所有层析操作中共同的步骤进行的描述。特别注意的是不同的分离方式如离子交换和疏水层析它们的原理和参数设置完全不同。这里仅就相同的操作进行描述，具体的参数设置见使用说明书并咨询负责本仪器的老师，切不可擅自操作，以免破坏仪器。 1、确定目标蛋白层析柱的选择，不同的分离方式选择不同的层析柱。 2、样品制备。根据层析柱介质对蛋白样品的要求，制备样品和洗脱 液。所有用于层析的溶液及样品均要通过0.45μm膜过滤，以免堵塞层析柱。 3、打开层析仪电源，按照显示屏的提示，分别设置好A液、B液、 流速、时间等相关参数，并将接样管插入接样仪。 4、打开电脑及Biologic-LP Data View软件，观察层析过程是否正常 或是否需要调整，做好接样前的准备。 三、层析系统的维护 操作结束后，按仪器使用说明，清洗层析柱及管道，将层析柱保存好，备用。特别注意不同的层析柱要求的清洗方式不同，对管道的清洗也不同，层析柱的保存方式也不同。清洗和保存时一定要按照使用说明书的要求进行操作，不能出现错误以免对层析系统造成破坏。

纯化水系统运行标准操作规程

1 目的建立0.5t/h纯化水系统标准操作规程，规范该设备操作程序，保证该设备的正常运行 2 范围适用于本公司0.5t/h纯化水系统的运行操作。 3 责任者0.5t/h纯化水系统的运行操作人员、设备管理人员。 4内容 4.1 设备简介 4.1.2 型号：ROT 0.5m3/h型。 4.1.3 生产能力：0.5吨/小时。 4.1.4 纯化水箱容量：0.5m3 4.1.4 数量：1套。 4.1.5 生产厂家：江阴宏博水处理设备有限公司。 4.1.6 工艺流程：饮用水→ 原水箱→原水泵→石英砂过滤器→活性炭过滤器→自动加药系统→自动加压泵→精密过滤器→高压泵→反渗透装置→中间水箱→增压泵→EDI装置→纯化水箱→ 纯化水泵→紫外线灭菌→微孔过滤器→各使用点 臭氧发生器 4.2 操作前的准备 4.2.1 确认设备状态是否处于完好已清洁状态。 4.2.2 取下完好已清洁状态标识卡，挂上运行中状态标识卡，检查加药系统中的药液是否满足该班次的生产。 4.2.3 送上控制柜总电源，控制面板，观察各显示器是否正常。 4.2.4 打开控制面板上原水进水阀开关，加满原水箱的水。 纯化水系统示意图

4.3 操作 4.3.1 石英砂过滤器的清洗， 4.3.1.1 关闭活性碳过滤器上进正洗阀和下进反洗阀。 4.3.1.2 滤料的正洗-首先打开上进正洗阀和下排正排阀，再关闭上排反排阀和下进反洗阀。 4.3.1.3 打开原水泵，洗5～10分钟，直至出水澄清肉眼观察不出颗粒。 4.3.1.4 滤料的反洗-首先关闭上进正洗阀和下排正排阀，再开上排反排阀和下进反洗阀。 4.3.1.5 打开原水泵，洗10～15分钟，直至出水澄清肉眼观察不出颗粒。 4.3.1.6 正、反清洗完毕后，开上进正洗阀，关上排反排阀、下进反洗阀、下排正排阀。 4.3.2 活性碳过滤器的清洗 4.3.2.1 关闭出水阀 4.3.2.2 滤料的正洗-首先打开上进正洗阀和下排正排阀，再关闭上排反排阀和下进反洗阀。 4.3.2.3 打开原水泵，洗5～10分钟，直至出水澄清肉眼观察不出颗粒。 4.3.2.4 滤料的反洗-首先关闭上进正洗阀和下排正排阀，再开上排反排阀和下进反洗阀。 4.3.2.5 打开原水泵，洗10～15分钟，直至出水澄清肉眼观察不出颗粒。 4.3.2.6 正、反清洗完毕后，开上进正洗阀和出水阀，关上排反排阀、下进反洗阀、下排正排阀。 4.3.3 RO装置手动操作 4.3.3.1 打开进水阀V1，将浓水排放阀V3、V6打向开位置。

蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和

GMP纯化水系统维护保养标准操作规程

* * * * 制药厂操作标准----设备管理 文件名称 纯化水系统维护 保养操作规程编码SOP-SB-048-00 页数2-1 实施日期 制订人审核 人 批准人 制订日期审核日 期 批准日 期 制订部门工程 部 分发部 门 动力车间 目的：规范纯化水系统维护保养操作，保障纯化水系统正常运行。适用范围：纯化水系统主要装置的维护保养。 责任：纯化水操作人员执行本规程，工程部管理人员、动力车间主任检查督促本规程实施。 程序： 1.为保障本系统的正常运转、操作人员应勤观察、勤记录，发现设备技术参数不正常时，应及时报告车间主任，经同意后进行维修。 2.发现砂过滤器出水的浊度大于3时，按《纯化水系统清洁标准操作规程》进行清洗。 3.发现炭纤维过滤器，精密过滤器、微孔过滤器进出水的相关大时，须更换滤芯。

4.反渗透装置须在制纯水结束前清洗，按《纯化水系统清洁标准操作规程》进行清洗。当淡水电导率不正常时，须更换反渗透膜。 5.当从混合床出来的纯化水电阻率<1MΩ·cm时，应及时再生混合床的树脂。 5.1配酸碱液：先开淡水泵，再开配酸碱进液阀，酸箱进约容积50%，碱箱进约容积80%，关酸碱进液阀及淡水泵，启动酸、碱泵之前应先开泵的进水阀、开循环阀，让酸碱浓度均匀，浓度分别为4%、3%左右，不超过5%，关酸碱泵和所有阀门。 5.2分层：先检查设备上所有阀门有无关闭。先启动纯水泵，开下进阀及上排阀，再开清洗水阀，慢慢加大流量至树脂层顶托至混合床顶部，关清洗水阀让树脂自动落下，直至分层，如分不开应重复上述操作，如还分不开，应进碱。 5.3进碱分层：先开碱泵的进出水阀，开碱泵，开混合床的进碱阀，开下排阀，下排阀不能开太大，到碱液进完，关泵和所有阀，泡浸树脂5～10min，再重复上述操作，直至分层彻底为止。 5.4清洗和进酸 当树脂进碱分层后，先启动纯水泵，开混合床的中排阀，不要开启过大，开上进阀及清洗水阀，调节上进流量至250L/h，再开下进阀流量为200L/h洗约5分钟后，关下进阀，其它不变。开始进酸，先启动酸泵、开泵的进出水阀，开混合床的进酸阀，流量为200L/h，酸液进完后，关泵及所有阀，再开下进阀，流量为200L/h，洗至中排出水的pH值为中性(时间约1小时)清洗完毕，关纯水泵和所有阀门。

AKTA层析仪使用操作规程(AKTA蛋白纯化系统经典培训资料)

?KTApurifier层析仪使用操作规程 1、开机 打开仪器的主电源，打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。 2、准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过0.45μm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。 3、清洗及管道准备 首先将A1管道放入缓冲液或平衡液，binding buffer中，将B1管道放入高盐溶液中或elution buffer，在system control窗口点击工具栏内的manual，选择 pump→pump wash basic，选中A1,B1管道为ON， execute。泵清洗将自动结束。 4、安装层析柱 在manual里选择pump→flow rate，输入流速1ml/ml，insert；选择Alarm&mon→alarm pressure，设置high alarm（输入填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），insert，execute。待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。 5、开始纯化： 1）等待柱子平衡好了（观察电导COND，pH的数值和变化趋势）就准备上样了。此时将紫外调零，选择Alarm&mon→autozero，exectue。 2）用样品环上：将样品吸进注射器，推掉气泡，从injectionValve的3号位推入（进样量不得低于样品环的体积的2倍）推好后不要取下注射器。在manual里选择flowpath→injectionValve→inject，execute。 3）用泵上样：点击pause，将A1放入样品中，点击countine，待样品上完后，再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子。 2),3)选择一种方式 4）洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在manual里选择pump→gradient，按照自己的工艺选择targetB（100％）和length（10CV）。 5）设定收集：选择Frac→fractionation_900,输入每管收集体积，exectue。结束固定体积收集选择Frac→fractionation_stop_900，exectue。 6、清洗泵及卸下层析柱： 将A1和B1入口放入纯水中，启动pump wash purifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后再将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。系统给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程防止气泡进入。 7、关闭电源： 从软件控制系统的第一个窗口unicorn manager点击退出，其他窗口不能单独关闭。 然后关闭AKTA主机电源，关闭电脑电源。

纯化水制水操作规程教学教材

纯化水系统工艺操作规程 1、总则 确保纯化水系统正确安全操作，为生产提供性能稳定，质量合格的纯化水。制水工序的操作人员和设备管理人员要遵守本操作规程。 2、内容 2.1. 纯化水系统工艺流程图 原水→原水泵→砂碳过滤→软水机→ RO系统 ↓ 纯水箱←精密过滤器←混床系统←中间水箱 2.2. 纯化水制造原理 原水箱中的水经过砂碳过滤处理后除去水中的杂志、余氯、胶体和悬浮物。再经过软 化机组初步将水中的钙、镁等离子除去后进入过滤水箱，再经过保安过滤器和反渗透 系统脱盐处理进入RO水箱，然后经混床去离子处理产生的纯化水进入纯水箱。 2.3. 工艺说明 2.3.1前处理系统设备包括： 原水→原水箱→原水泵→砂碳过滤器→软水机组 a．多介质过滤器： 多介质过滤器是内装两种或以上过滤介质，其主要作用是除去粒度大的杂质，当水 通过颗粒物料滤床后可以除去水中的悬浮物和胶体杂质，这是有效净化水质的主要 处理过程。 b．活性碳过滤器： 活性碳过滤器主要用来吸收原水中的游离氯，以避免在水处理系统中RO膜受到 游离氯的氧化。 c．软水机组： 通过软水机组内的离子交换树脂去除水中的钙、镁离子，降低水的硬度，防止反渗透膜表面由于钙、镁盐结垢，延长反渗透膜的使用寿命。 2.3.2 RO系统 5μm保安过滤器→ RO反渗透→中间水箱 本装置包含保安过滤系统、反渗透高压泵及反渗透脱盐装置。 a．由5μm保安过滤器用以截留水中5μm以上的颗粒，胶体、悬浮物，以保护反渗透 膜，确保RO系统的正常运行。 b．反渗透好比水处理系统的“心脏”，对提高和稳定出水水质起着关键的作用。RO 膜的孔径只有 3 ×10-10m，是离子级的分离设备，分离对象是溶液中的离子和大分子量的 有机物。

纯化操作规程

纯化操作规程 1 纯化内容及目的 纯化前，详细咨询合成人员，并记录下列内容： 1.1 样品名称 纯化命名时严格承接合成名称。详见《技术部产品批号编制》。 1.2 样品重量 此处指经裂解后直接上机前样品重量。无论对于已抽干样品（多呈粉末状，与实际重量相近）或某些尚未抽干或者未进行抽干处理的样品（多呈粘稠溶液状或胶状，其重量与实际重量相差可能较远），都需详细记录。 1.3 预计目的肽含量 指样品中含有目的肽的大致mg数，由合成人员提供。 1.4 要求的目的肽数量及纯度 即产品指标，如不同纯度（如仅脱盐、或80%、90%、95%等）以及相应的mg数。1.5 后处理方法 样品在合成过程中，后处理方法的不同，可能对纯化方法与结果判断有一定影响。此时应详细咨询合成人员并记录。 2 样品溶解性能的预备实验 鉴于肽类样品的等电点（pI）、溶解性能将直接影响到纯化工作。为谨慎起见，在处理新样品前，必须对其溶解性能进行预备实验。 2.1 理化性质分析 首先利用蛋白分析软件对目的肽的理化性质进行序列分析，主要包括：分子量、pI、疏水性与亲水性、最大吸收峰等，并记录。 2.2 粗肽成分分析 合成时的不同处理方法对于样品所含组分也有很大影响，应详细咨询合成人员该样品合成与裂解过程中是否有特殊处理、合成过程中对该样品的性质有何体会等。 2.3 实验程序 理化性质对于样品纯化仅具有部分指导意义，对于粗肽而言，其许多性质在盐溶液中都会发生变化，一切均以实际验证为准。

2.3.1 取少量样品（10mg左右）加入到洁净试管； 2.3.2 加入2ml过滤无热源水，置于旋涡混合器快速混合2~3min，观察是否完全溶解。如溶 解，则视为易溶样品（>5mg/ml），可进行大量溶解。否则进行下一步。 2.3.3 以pH试纸粗略测定样品溶液pH值（多显酸性），结合pI值，以0.1M NaOH或0.1M HCl 逐滴加入，并不断混合或搅拌，直至样品溶解，此时测定溶液pH值（需控制在pH2~10之间为宜，视不同类型柱子而定）。如不溶则进行下一步处理。 2.3.4 振荡或搅拌下，逐滴加入ACN，至浓度为5~10%，混合，观察是否溶解。 2.3.5 一般样品通过上述处理均可溶解，如最后仍观察到不完全溶解，则选取最佳条件，仍按 大量溶解方法处理。 3 样品大量溶解 3.1 操作要求 粗肽溶解时体积应尽量小，因而溶解液浓度一般很大,此时即使溶液极小的损失也意味着整个样品较大的损失，所以要求一定操作严格，手法熟练，回收细心。 3.2 操作程序 3.2.1 选取合适的溶解液 如已确定方法的样品，一般以初始洗脱液（或其它已证实有效的溶液）；对于新样品，采用预备实验确定的最适宜的溶解条件。 3.2.2 溶解 首先将样品仔细称重，注意记录样品名、称取数量、剩余瓶重等。 对于易溶样品,以一次性注射器吸取适量溶解液,加入，适当超声振荡，使之完全溶解； 对于部分溶解样品,转入试管中,加5ml溶解液,在旋涡混合器上快速混合5min(注意混合均匀、不可洒出)。离心(注意平衡)10min(3000rpm)。取出上清液,将底部沉淀以溶解液复溶。再次离心,复溶,直至试管内无沉淀。经反复溶解后,仍存在的不溶性颗粒,必须收集待查,不应轻易弃去，必须收集留用。 对于整瓶溶解的样品，以一次性注射器吸取溶解液，仔细冲洗杯壁附着的样品，并回收。 注意：在此过程中，以及以下的整个纯化实验过程中，均采用经高温灭菌的玻璃器皿。 3.2.3 过滤 装滤器。选择合适大小的滤器及水相滤膜，将滤膜在溶解液中浸润后安装，以注射器打入空气检验是否泄露。 过滤。以一次性注射器吸取少量样品溶液（2ml）进行过滤。注意用力均匀，力过大会使液体由滤器接缝处挤出甚至使滤膜破裂损失样品。滤液应澄清。多次过滤后，如滤膜堵塞，换新膜。取下的滤膜置于烧杯中备用，最后以溶解液超声波处理，回收。样品溶液应仔细回收，滤膜最后吸取溶解液进行过滤以冲下滤器中样品溶液，回收。 滤器处理：滤器用后，取下滤膜，置于盛有1M NaOH的容器中，集中处理（煮沸15min，无热源水洗净，测pH接近中性后，再加入无热源水，煮沸5min，继续以无热源水冲洗，至

蛋白质纯化仪的使用 (1)

蛋 白 质 纯 化 仪 使 用 说 明 1.认识机器 本机器常规流程图： 使用机器前所有端口请按如图所示连接，将“A 泵溶液进口线”“B 泵溶液进口线”放进超纯水中。按如图所示先不要连接柱子。 建议一般使用A 泵进液，如需梯度洗脱时才用B 泵。 ***除上样样品（14000 rpm/12000 rpm 离心30min ）外，所有在此机器上要用的溶液必须要经过0.22 μm 滤膜过滤。*** 样品泵 A 泵 B 泵 多波长检测器 pH 计 混合池 层析柱 切换阀 进样环 溶液由A/B 泵进 入仪器 进样阀 层析柱切换阀 多波长检测处 自动收集器 废 液 出 口 A 泵溶液进口线 B 泵溶液进口线 整合电导检测

2.开机 打开计算机、蛋白质纯化仪（电源在右侧下角）、自动收集器（电源在后面右侧）。此时蛋白质纯化仪上部分指示灯会亮，有黄色的、有蓝色的，开机较慢，请稍等，当蛋白质纯化仪上所有指示灯不亮时，才可进行操作。 3.启动电脑“ChromLab”软件 双击电脑“ChromLab”应用程序，进入如下界面： 4.洗泵 单击“Manual Run”进入： 我们主要看右下方这块（图中所示模块均可双击设置参数）： 双击“样品泵”模块出现如图所示对话框：

双击“层析柱切换阀”模块如下图所示： 此步骤主要是洗泵工作，请确保层析柱不在程序中，点击“Bypass ” 点击此处可让可更改溶液的流动方向。 点击1-5可设置连接不同的层析柱端口 设置流速 设置压力，小于选择的柱子承受最 大压力。在下面“控制流速以防止 超压”前面打对勾，以保护柱子。 不特殊设置，默认A 泵工作 此处可控制机器的运行与停止。

纯化水系统操作规程

文件目录 一.目的: (3) 二.范围: (3) 三.职责: (3) 四.工艺流程图: (4) 五.术语及定义: (5) 六.系统说明: (6) 七.系统操作: (7) 八.系统监控: (8) 九.注意事项: (9) 十.附表: (11) 十一.变更记载及原因: (12)

文本编号 一.目的： 建立纯化水系统操作规程，确保纯化水系统正确操作，为生产提供性能稳定、质量合格的纯化水。 二.范围： 本标准适用于广宁制药厂原料药、食品添加剂生产所用15T/H纯化水系统操作规定。 三.职责： 1、纯化水系统操作人员：按本规程要求，负责对纯化水系统进行正确操作、规定监控和纠偏，并及时报告异常情况。 2、纯化水系统维护人员：按本规程要求，负责配合操作人员对系统必要的维护和保养。 3、工段长、车间主任：确保本规程的正确实施，并实行监督管理。 四.工艺流程图： 五.术语和定义： 1、纯化水：本品为蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其它适宜的方法制得供药用的水，不含任何附加剂。本纯化水是用二级反渗透法制备。 2、反渗透膜：用特定的高分子材料制成的，具有选择性半透性能的薄膜。它能够在外加压力作用下，使水溶液中水和某些组分选择性透过，从而达到纯化或浓缩、分离的目的。 3、反渗透：在膜的原水一侧施加比溶液渗透压高的外界压力，只允许溶液中水和某些组分选择性透过，其他物质不能透过而被截留在膜表面的过程。 4、电导率：电阻率为某一温度下（一般为25℃）边长为一厘米的立方体水柱的相对两侧

文本编号 面间的电阻值，其单位为欧姆·厘米。电导率为电阻率的倒数，单位为西门子/厘米（us/cm），理论的纯水应无任何杂质离子，不导电，电阻率为18.24欧姆·厘米,电导率为0.054 us/cm。 5、脱盐率：表明设备除盐能力的指数，一般通过电导率测定计算。电导率测定是用电导率仪测定原水电导和渗透水电导率，根据下列公式计算，保留三位数字。 脱盐率％=（原水电导率us/cm-渗透水电导率us/cm）÷原水电导率us/cm×100% 6、渗透水：经设备处理后所得的含盐量较低的水。在一级反渗透中的渗透水称为一级淡水，二级反渗透中的渗透水称为二级淡水或纯化水。 7、浓缩水：经设备处理后的含盐量被浓缩的水。在一级反渗透中的浓缩水称为一级浓水，二级反渗透中的浓缩水称为二级浓水。 8、水回收率：表明设备对进水利用能力的指数。水回收率可用进水流量、渗透水流量、浓缩水流量进行计算。 水回收率％=渗透水流量m3/h÷（渗透水流量m3/h+浓缩水流量m3/h）×100% 9、流量（LMP）:流量单位，为每分钟流过多少L，单位为L/分钟。一二级反渗透的浓水和淡水都安装LMP流量计。 10、产水量：指水温为25℃的进水在规定的运行压力下，单位时间内经反渗透水处理装置处理后所得含盐量较低的水的体积，单位为m3/h。 11、级：在反渗透水处理装置中，反渗透膜组件按淡水的流程串联的阶数，表示对水利用反渗透膜进行重复脱盐的次数。 12、膜通量：指单位面积反渗透膜在单位时间内透过的水量，单位为L/m2.h。 六.系统说明： 1、系统描述： 1.1广宁制药厂纯化水系统为襄樊净远水处理设备有限公司生产的JIIRO-15二级反渗透制水系统，纯水产水量15m3/h。由原水预处理单元、一二级反渗透单元、清洗/消毒单元、纯水输送单元构成。 1.2预处理单元是由原水箱、原水泵、絮凝剂加药装置、多介质过滤器、活性碳过滤器、阻垢剂加药装置、5um保安过滤器组成，是为一级反渗透单元提供符合要求的进水。其功能如下： 1.2.1将符合饮用水标准的原水利用絮凝剂和原水中悬浮杂质、胶体物质、颗粒和大分子有机物絮凝结合后沉降，通过多介质过滤器截留，以除去水中的悬浮杂质和泥沙、胶体等大颗粒不溶性物质。 1.2.2经过多介质过滤的水再通过活性炭过滤器的活性炭吸附作用，以除去水中的有机物、微生物、游离氯、铁、色度等，以防止水中的氧化性物质（游离氯、铁）对反渗透

蛋白表达纯化流程

第一章蛋白表达纯化 一、诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜; 2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜; 3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时; 4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。 二、蛋白纯化 2.1重组蛋白的提取 2.1.1 提取缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。 2.1.2 方法 1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬； 3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。 4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。 5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分 析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。 6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。

纯化水设备的操作规程

一.工艺简介 清洗装置 原水→原水箱→原水泵→机械过滤器→活性碳过滤器→软化器→精密过滤器→一级 加药装置（NaOH） 高压泵→一级反渗透装置→淡水箱→淡水泵→二级高压泵→二级反透渗装置→纯水箱→纯水泵→紫外线杀菌器→用水点 清洗装置 预处理：原水→原水箱→原水泵→机械过滤器→活性碳过滤器→软化器→精密过滤器 二.操作 （一）预处理+一级反渗透 A.开机 1.检查原水箱是否有充足的水； 2.打开原水泵前控制阀； 3.打开机械过滤器、活性碳过滤器、软化器、精密过滤器的进水阀以及软化器出水阀； 4.完全打开浓水调节阀； 5.打开膜前进水调节阀（正常情况下不要调节）； 6.启动原水泵，打开精密过滤器的排气阀排完气后，启动一级高压泵； 7. 2分钟后调节浓、淡水流量至适当位置； 8.调节原水泵前控制阀使压力≤。 B.停机 1.完全打开浓水调节阀，低压冲洗膜2分钟左右； 2.关闭一级高压泵、原水泵； 3.关闭原水泵前控制阀、精滤进水阀； 4.关闭自来水阀。 C.清洗再生 a.石英砂的清洗 1.打开机械过滤器的反冲阀、排空阀； 2.关闭机械过滤器的进水阀、排污阀、活性碳过滤器的进水阀、反冲阀； 3.打开原水泵前控制阀，启动原水泵，反冲石英砂15分钟左右； 4.打开机械过滤器的进水阀、排污阀，.关闭机械过滤器的反冲阀、排空

阀正洗至出水澄清。 b.活性碳的清洗（用机械过滤器的出水清洗） 1.打开活性碳过滤器的反冲阀、排空阀； 2.关闭活性碳过滤器的进水阀、排污阀、软化器的进水阀、反冲阀； 3.关闭机械过滤器的排污阀，反冲活性碳15分钟左右； 4.打开活性碳过滤器的进水阀、排污阀，关闭其反冲阀、排空阀，正洗至出水澄清； 5.关闭原水泵，活性碳过滤器的排污阀。 c.软化器的再生 1.配制10%的食盐溶液待用； 2.打开软化器的排空阀、排污阀，排完柱体中的水； 3.关闭软化器的进水阀、反冲阀、排污阀、精滤进水阀，打开软化器出水阀、清洗阀，启动清洗泵，进盐后关闭清洗泵，清洗阀、软化器出水阀，浸泡树脂2～4小时； 4.打开软化器的反冲阀、排空阀，打开机械过滤器、活性碳过滤器进水阀、原水泵前控制阀启动原水泵，反洗树脂15分钟左右。再打开软化器的进水阀、排污阀，关闭其反冲阀、排空阀，正洗至出水无咸度。 d.一级反渗透膜清洗 1.关闭软化器出水阀,打开精密过滤器进水阀； 2.完全打开一级浓水调节阀、淡水取样阀； 3.打开清洗阀，启动清洗泵，将从浓水口排出的清洗液回收至清洗箱，循环冲洗膜30分钟左右，再关闭清洗泵、清洗阀，浸泡膜2～4小时； 4.打开预处理系统，启动一级高压泵，清洗膜至出水呈中性； e.精密过滤器的清洗 定期（10天左右）拆开精密过滤器，取出滤芯，清洗滤芯外部。也可用5%盐酸先浸泡几个小时，再用水冲洗。 D.注意事项 1.一级反渗透膜后压力〈，机械过滤器压力≤； 2.每操作一步必须先理顺水的流向，若有进无出会使柱体内部承受过大压力； 3.石英砂、活性碳的清洗周期，根据用水量而定。正常情况下，一个星期左右清洗一次； 4.软化器的再生周期，需检查Ca2+、Mg2+是否符合要求，正常情况下，1个月左右清洗一次；