器官移植排斥反应检测新进展

文章编号:100122087(2006)0520547204 中图分类号:R446.62 文献标识码:A

器官移植排斥反应检测新进展

李向东

(山东大学齐鲁医院检验科,山东济南250012)

关键词:指标检测;排斥反应;器官移植

作者简介:李向东,男,1971年生,硕士,主治医师,主要从事肿瘤标志物的研究。

器官和组织移植是20世纪最重要的医学成就之一,目前移植术已成为组织、器官功能衰竭终末阶段最有效的治疗措施。移植术可分为自体移植、同种同基因移植、同种异基因移植和异种移植,同种异基因移植是临床最常见的移植类型,无论何种移植,只要移植物表达与受者不同的蛋白质或其他分子,移植物就会排斥。如何早期诊断排斥反应,是临床医生面临的重要问题。目前诊断急性排斥反应主要依靠创伤性的穿刺移植器官,例如心脏移植后进行心肌、心内膜穿刺活检。当前研究的热点是与排斥反应有关的非创伤性检测指标,现将近年的进展综述如下。

一、细胞因子的检测

器官移植排斥的发生和多种细胞因子的参与有关,由于供受者之间组织相容性抗原不同,器官植入后异种抗原刺激活化受者循环中的T 细胞,活化的CD8+T 细胞直接攻击移植物,而CD4+T 细胞通过释放多种细胞因子直接或间接损伤靶细胞,在以上过程中,细胞因子与细胞因子受体结合并刺激T 细胞克隆增殖是急性排斥反应的关键步骤和中心环节,因此细胞因子检测在器官移植排斥反应中极为重要。

器官移植发生排斥反应时,多种细胞因子水平会增高;一是移植器官局部细胞因子水平,二是血清细胞因子,二者往往是同步的。肝脏移植后,发生移植排斥时,移植肝脏单核-巨噬细胞内表达肿瘤坏死因子(T NF )2α增加[1]。肠移植后,发生早期排斥反应时,移植肠黏液素MUC2、MUC4表达增高,干扰素(I F N )2γ和T NF 2α表达也增高[2]。而移植肾脏纤维生长因子(FGF 21)和纤维生长因子受体(FGFR )增高提示慢性排斥反应[3]。心脏移植后撤掉免疫抑制剂发生实验性排斥反应时,心肌C D4+细

胞、CD8+

细胞、白细胞介素(I L )22、I L 22受体和T NF 2

βmRNA 水平升高,与传统的辅助性T (Th )细胞、细胞毒性T (Tc )细胞介导的免疫反应是一致的。但在发生临床排

斥的心脏移植患者,I L 22和I L 22受体mRNA 没有明显变化[4]。肾脏移植患者,发生急性排斥反应时,移植肾脏显示I L 22受体表达增加。

细胞因子与移植排斥的关系不仅表现为细胞因子表

达量的变化,其基因多态性与患者急性排斥反应的发生及程度有一定的相关性。I L 210基因在21082位置上的多态性,已被确定为急性肝移植排斥反应的遗传危险因素。肝移植患者携带I L 21021082A 等位基因发生排斥的比例较小,T NF 、I L 26和转化生长因子(TGF )的基因多态性没有发现和急性肝移植排斥反应有联系[5]。I L 22和I F N 2γ水平是与急性排斥反应移植血管疾病(G VD )密切联系的,I L 22基因启动子区T 2330G 和I F N 2γ基因第1内含子重复CA 多态性影响这些细胞因子的产物水平。心脏移植后,分析患者I L 22和I F N 2γ的基因多态性,没有发现同急性排斥反应移植血管疾病有密切联系[6]。由于血清细胞因子容易受细菌、病毒感染等因素影响,器官移植受者感染发生时,某些细胞因子水平也升高,因此血清细胞因子水平不宜单独作为判断排斥的依据,而局部直接测定细胞因子基因表达的变化,可证实和弥补不足。

细胞因子的检测在临床排斥反应的诊断中有重要作用。目前检测的种类主要有I L 22、I L 26和T NF 等,检测方法有免疫学检测法[如免疫斑点法、酶联免疫吸附试验

(E L I S A )、放射免疫法(R I A )和免疫印迹法等]、生物学测

定法、分子生物学测定法等。

二、淋巴细胞检测

移植排斥反应主要由受者T 细胞所介导。受者体内存在大量的反应性T 细胞,他们能识别移植物中过客白细胞表面的异型抗原,因此淋巴细胞特别是T 细胞的检测在器官移植中起到重要的作用。急性排斥反应时,外周血T 淋巴细胞CD4/C D8比值升高,可比临床诊断早3～5d 。抗排斥治疗有效后,该比值下降。感染时,C D4/

C D8比值会倒置。检测肾移植患儿尿中移植渗透淋巴细

胞和Tc 细胞产物可用来诊断急性排斥反应[7]。现在已从基因表达水平观察各种分子的表达,大鼠小肠移植后,移植小肠C D45RO 基因表达可做为检测移植排斥的指标[8]。用基因芯片技术分析超过12000个基因,在胰岛移植耐受小鼠中发现57个基因的表达水平较高。在发生胰岛移植排斥小鼠中发现524个基因的表达水平较高,在这524个基因中,较多数量的是T 细胞表面标记分子和细胞毒性相关的基因,还有一些是细胞因子、趋化因子及

其受体基因[9]。检测方法一般为流式细胞术。

三、补体和粘附分子检测

当移植物抗原与受者抗体结合后,可使补体活化。补体激活同急性排斥反应有关。细胞粘附分子可通过抗原呈递、介导白细胞在内皮粘附及外渗、以及介导效应细胞和靶细胞识别参与排斥反应发生。

移植排斥反应时发生变化的补体主要是补体降解产物C4d,粘附分子主要是细胞间粘附分子21(I C AM21)和血管细胞粘附分子21(VC AM21)。抗体介导的移植排斥反应在肾移植患者中比较重要,主要包括针对人白细胞抗原(HLA)的抗体和抗体反应。抗体反应主要表现在补体激活产物C4d升高,用E L I S A检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中补体激活产物C4d,C4d浓度升高可预测抗体介导的肺移植排斥反应,但需排除由于感染导致的C4d 浓度升高[10]。心脏移植后,心肌膜活检后补体降解产物C4d免疫组化染色显示含量增加[11]。用E L I S A测定尿可溶性粘附分子(sI CAM21、s VCAM21)和补体降解产物C4d,发生排斥反应的肾移植患者尿中C4d水平较正常对照明显升高。在急性类固醇耐受移植排斥组,s VCAM21和sI2 C AM21浓度明显升高,肾移植功能稳定组sI C AM21浓度明显降低[12]。肾脏移植患者伴随着T细胞和巨噬细胞的浸润,肾小管和上皮级织相容性复合物(MHC)抗原HLA2 DR,粘附分子I C AM21、VC AM21、极晚期抗原24(VLA24)和淋巴细胞功能相关抗原21(LF A21)α/β表达增加。用放射性示踪剂锢21112抗2I CAM21单克隆抗体来显示大鼠移植肺中的I C AM21,当发生轻微和中度肺移植排斥反应时, I C AM21含量增加[13]。

相对于补体,粘附分子特别是I C AM21目前在临床中应用较多。检测肾移植后肾组织或血液中的I C AM21可用来诊断急性排斥反应,但在其他大器官如肺、心脏、肝脏等排斥反应诊断中I CAM21的应用较少。

四、蛋白质和酶类检测

用于检测器官移植排斥的蛋白质和酶较多,其中应用较广的是C2反应蛋白(CRP)。CRP是第1次被认识的急性时相反应蛋白,作为急性时相反应的一个极灵敏指标,可用来监测移植后的排斥反应,目前临床主要是应用免疫比浊法来测定CRP。用蛋白质谱分析的方法分析急性肾移植排斥患者的尿标本,可以发现3个明显的蛋白峰,而急性肾小管坏死、肾小球病、轻微的输尿管炎症和巨细胞病毒感染则没有发现相对应的3个明显的蛋白峰,鉴别这些蛋白成分可作为肾移植排斥的无损伤检测指标[14]。CRP不仅同炎症反应有关,而且同移植排斥也有关。小肠或肝移植患者,血清人骨髓相关蛋白复合体(MRP8/14)浓度有明显增高,1～7d后,CRP也增高[15]。在心脏移植患者心肌活检证实发生排斥反应时,用E L I S A 检测显示患者血清中热休克蛋白、αβ2晶状体球蛋白、原肌球蛋白水平明显升高[16]。急性肾小管损伤患者尿pH 值降低,在pH值<6条件下,患者尿中天门冬氨酸蛋白酶和β22微球蛋白升高,β22微球蛋白可以作为提示肾小管损伤而用于检测肾移植排斥的指标[17]。用组织化学的方法检测大鼠移植物壁三磷酸腺苷酶(ATPase)、碱性磷酸酶(ALP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、一氧化氮合酶(NOS)、单胺氧化酶(MAO),在只进行小肠移植(S BT)的大鼠以上酶的活性消失,而进行肝/小肠移植(LS BT)大鼠在术后以上多种酶的活性仍然保持,LS BT大鼠可预防或延迟肠移植排斥反应,提示ATPase、ALP、AchE、NOS、MAO的活性变化均可作为诊断移植物排斥的指标。另外血α2谷胱甘肽S2转移酶免疫测定也可诊断肝脏移植后的移植排斥[18]。

五、MHC分子

现已确定,器官移植排斥反应所识别的靶抗原主要是表达于移植物细胞表面的MHC分子。MHC分子可通过直接途径和间接途径被受者T细胞识别,它在器官移植排斥反应中有重要的作用。

MHC分子在体内广泛分布,人体中MHC有2种形式:一是以膜抗原形式存在于几乎所有组织细胞表面,二是以可溶形式存在于血清、尿液、精液、乳汁、唾液等多种体液与分泌液中。血清可溶性MHC分子检测比较方便,用E L I S A检测血清可溶性HLA2Ⅰ抗原水平,可提示排斥反应[19]。犬心脏移植后用放射性同位素标记单克隆抗体的方法检测血循环中MHC2Ⅱ水平,心肌活检证实排斥反应发生时,MHC2Ⅱ水平增高到基础水平的2倍[20]。但是血清可溶性MHC分子不稳定,MHC分子的增多,可能是排斥反应时产生增多,也可能是MHC分子与细胞膜结合不牢固脱落较多之故。

相对于血清可溶性MHC分子,外周血单个核细胞表面MHC分子受到外界影响较小。外周血单个核细胞在移植术后发生排斥时,表面表达MHC分子水平增高,目前研究的主要是MHC2Ⅱ分子。Davenport等[21]研究同种异基因大鼠肝移植术后,未用免疫抑制剂的存活大鼠T 淋巴细胞MHC2Ⅱ表达从(3.4±0.4)%(2/3d)增加到(4.9±1.1)%(7d),并证实肝移植存活大鼠经过一段时期的排斥后,MHC2Ⅱ表达也确实增加。环孢霉素A (Cs A)(5mg?kg-1?d-1)口服17d后停服,诱导排斥耐受,在2/3、7、17、30、40和100d时测定T细胞MHC2Ⅱ分子,T细胞MHC2Ⅱ表达降低[(2.3±0.4)%,7d]。停服Cs A后表达增高[(8.2±0.7)%,100d],而同种同基因大鼠肝移植后,没有这种变化。Knoop等[22]研究临床稳定的心肺移植、双肺和单肺移植患者,术后均用免疫抑制剂Cs A或FK506等药物治疗,检测的血样平均浓度为Cs A:236ng/m l,FK506:11ng/m l,患者外周血单个核细胞体外用抗C D3单抗刺激,流式细胞术检测患者组单核细胞表达的HLA2DR显著降低,平均荧光强度从对照组的999±105降低到227±137。分析单核细胞MHC2Ⅱ表达降低可能一方面由免疫抑制药物尤其是皮质类固醇的直接作用,另一方面也可能是I L210的作用,患者组外周血

单个核细胞分泌较高水平的I L210,I L210下调单核细胞表面的MHC2Ⅱ表达。

目前血清可溶性MHC分子检测在国内应用较多。细胞表面MHC分子的检测还不成熟,流式细胞术是应用较早的方法,最近分子生物学方法特别是荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)的应用使细胞表面MHC分子的检测应用日渐广泛。

六、其他

一氧化氮(NO)有多种生理功能,在细胞毒性宿主防御机制及免疫调节上起重要作用,并能抑制活化T细胞的增殖,抑制免疫细胞浸润。大鼠胰腺移植后,发生急性移植排斥反应时,胰腺腺泡细胞表达较高水平的诱导NO 合酶(i N OS)[23]。

肝移植患者经肝穿刺活检证实发生早期排斥反应时,血清胆汁酸浓度是不发生排斥时的3倍,经药物治疗排斥反应消失后,血清胆汁酸浓度降至正常水平。感染不会导致血清胆汁酸浓度升高,而血清胆红素和转氨酶与排斥反应没有明显联系[24]。

女性肾移植患者接受男性供体肾脏后,用实时定量PCR从肾移植患者尿液细胞中检测出了Y染色体特殊序列的基因片段。在发生排斥反应时,这些因移植获得的序列量值升高,说明移植患者尿液细胞DNA检测可作为肾移植排斥的指标[25]。

综上所述,目前已进行了大量有关排斥反应与测定指标的相关性研究,且在检测的种类和方法上有了很大进展。由于器官移植排斥反应涉及范围广泛,情况复杂,现仍未找到公认的、无创伤性的、敏感性和特异性均足以应用于临床监测的指标。探索、建立敏感特异的检查方法和客观指标,对于诊断和预测排斥反应及其转归,制定个体化免疫抑制方案均具有重要意义,因此如何有效监测排斥反应仍是一个重要的研究课题。

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(收稿日期:2005209219)(本文编辑:姜　敏)

文章编号:100122087(2006)0520550202 中图分类号:R446.11 文献标识码:A

加强同分子遗传学的联系,进一步提升血液形态学的诊断水平

卢兴国

(浙江大学医学院附属第二医院血液科,浙江杭州300009)

关键词:分子遗传学;血液形态学;诊断水平

作者简介:卢兴国,男,1953年生,学士,主管技师,主要从事血液形态学和病理学检验及其诊断研究。

分子遗传学是传统细胞遗传学结合分子生物学技术而发展起来的一个分支。近十余年来已经发现和证明许多造血和淋巴组织肿瘤有一定特征的分子遗传学异常,加深了临床诸多方面的理解,也影响到我们对细胞形态学的认知和诊断的思路。因此,在血液形态学检验中加强同分子遗传学的联系,将会进一步提升血液形态学的整体水平。

一、重现性染色体异常急性髓细胞白血病(AML )与形态学

许多AML 患者伴有髓系成熟和增殖的细胞信号转导途径相关遗传学异常,分子遗传学检查比形态学能更好地反映临床行为和生物学特性。至今公认的这类异常有t (8;21)、AML12MTG8的AML,inv/del (16)/t (16;16)、CBF β2M YH11的AML,t (15;17)、P ML 2RARa 的AML,

11q23异常AML 4个类型,相应的典型形态学为AML 2M2(我国的亚急性粒细胞白血病M2b )、伴嗜酸粒细胞增多

的M3、M4和M5。前三型有良好的化疗效果和预后,后一型化疗效果和预后均差。因此,这4型被视为真正独立的临床病理遗传学病种[1]。

二、多系病态造血AML 与分子遗传学

AML 确诊前有无骨髓增生异常综合征(MDS )病史可

明显影响疾病的临床行为,与分子细胞遗传学检查反映的异常分子事件有关。多系病态造血AML,通常发生于老年患者,常有不良的细胞遗传学证据,常常累及染色体大片段的缺失或增长,如-5/del (5q )、-7/del (7q )。患者常有严重的全血细胞减少,化疗不易缓解,预后不良,发病率随年龄而增长,是由于造血干细胞遗传物质长时间多次受损所致。-7/7q -、-5/5q -也见于烷化剂治疗相关AML 和MDS,有相同的病态造血和临床行为。由于上述2种白血病各有形态学、分子遗传学和临床之间的相关特征,均被世界卫生组织(WHO )作为独立而重要的

AML 类型

[1]

。

三、Ph 染色体及BCR 2ABL 融合基因与形态学

Ph 染色体是慢性粒细胞白血病(CG L )的标记,为位

于22q11上的BCR 基因和9q34上的ABL 基因融合。融合基因编码P210融合蛋白,有较强的酪氨酸蛋白激酶活性,有转化细胞和致白血病作用,是CG L 发病的分子基础。由于融合蛋白抗凋亡和Fas 介导的凋亡都受ABL 凋节,故又是CG L 不按程序化死亡、细胞寿命延长堆积于骨髓等器官的原因。形态学表现为各期粒细胞增多,嗜酸