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5种杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭_范鑫丽

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5种杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭

范鑫丽1，李南薇1*，高苏娟1，刘佳2，刘功良1，于丽梅1

1. 仲恺农业工程学院轻工食品学院（广州 510225）；

2. 仲恺农业工程学院信息科学与技术学院（广州 510225）

摘要以常见食源性致病菌蜡样芽孢杆菌为研究对象, 比较研究了5种常用杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果。结果表明, 过氧乙酸对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果最好, 其次是苯扎溴铵, 随后是过氧化氢和碘消灵, 次氯酸钠的杀灭效果最差。过氧乙酸及苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果均随杀菌剂浓度和杀灭时间的增大而增强。不锈钢片上的蜡样芽孢杆菌生物被膜经100和1 000 mg/L过氧乙酸分别作用30和15 min或100和

1 000 mg/L苯扎溴铵分别作用30和20 min后, 被膜活菌数均低于检测限。

关键词蜡样芽孢杆菌; 生物被膜; 杀菌剂

Inactivation of 5 Sanitizers on Bacillus cereus Biofilm

Fan Xin-li1, Li Nan-wei1*, Gao Su-juan1, Liu Jia2, Liu Gong-liang1, Yu Li-mei1

1. College of Light Industry and Food Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering (Guangzhou 510225);

2. College of Information Science and Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering (Guangzhou 510225)

Abstract With a common foodborne pathogen (Bacillus cereus) as the research objective, 5 sanitizers were used for inactivation of the B. cereus bio? lm. The results showed that the ef? cacies of the 5 sanitizers in the inactivation of B. cereus bio? lms appeared to decrease in the following order: peracetic acid, benzalkonium bromide, hydrogen peroxide approximate iodophor and sodium hypochlorite. In addition, the inactivation ef? ciencies of peracetic acid and benzalkonium bromide against B.

cereus bio? lms increased with the increasing concentrations of the disinfectants as well as the prolongation of the inactivation time. The population of B. cereus bio? lm cells on stainless steel surface was less than the detection limit after inactivation by peracetic acid at 100 mg/L for 30 min and 1 000 mg/L for 15 min, or by benzalkonium bromide at 100 mg/L for 30 min and

1 000 mg/L for 20 min.

Keywords　Bacillus cereus; bio? lm; sanitizers

生物被膜是由附着于惰性或活性实体表面的细菌细胞和包裹细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落[1-2]。生物被膜态细菌与常见的浮状态细菌有着显著的不同，其抗性更强、危害更严重，且更难清除[3]。食品加工原辅料营养丰富，各种食源性病原菌和腐败菌易粘附于富含营养物质的食品原料、各种加工及非

较理想的，虽然已有不少压差膨化果蔬脆片的研究，但市场上极少有产品的销售，这可能是因为压差膨化果蔬脆片的品质不太理想，如果对果蔬的组织特性充分的研究，可能会发现解决的方法。

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加工接触面等处形成生物被膜。一旦形成生物被膜，不仅会污染食品，增加设备清洗难度，还会给食品加工、贮运设备带来严重危害[4-5]。此外，生物被膜还可能成为其他腐败微生物及致病菌的藏身之所，众多细菌间存在的群体感应使它们协同共生，使设备内外表面成为传播食源性疾病的隐性生物危害源，导致食品质量与安全问题[6-7]。

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）是一种能引起食物中毒的病原菌，在自然界广泛存在，极易污染食物，特别是蛋白质和碳水化合物含量丰富的米饭、乳制品、肉制品、豆类食品及焙烤食品等，引起的食物中毒包括呕吐和腹泻2种[8-9]。该菌引起的食品中毒案例在中国细菌性食物中毒中位居前列[10-11]。蜡样芽孢杆菌生物被膜一旦形成，就必须使用各种方法清除并杀灭，从而保证食品安全和人们健康。到目前为止，在国内尚未见利用杀菌剂杀灭蜡样芽孢杆菌生物被膜的报道，在国外这方面的报道也较少，仅涉及到Cl 2、ClO 2、Fit、碘消灵及Tsunami 200等[12-15]。因此，试验对比研究了5种常规杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

蜡样芽孢杆菌（CMCC63303）购自广东省微生物研究所菌种保藏中心；不锈钢片（304型，规格1.2 cm×1.2 cm）由广州南联实业有限公司提供；过氧乙酸、过氧化氢、次氯酸钠、碘消灵、苯扎溴铵、硫酸、碘化钾、淀粉、硫代硫酸钠、乙醇、丙酮、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨、琼脂等均为分析纯试剂。1.2　仪器与设备

PYX-250S-A型生化培养箱：上海悦丰仪器仪表有限公司；SB32000超声仪：上海第三分析仪器厂；SW-CJ-2FD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；ALC-210.4型电子分析天平：德国Sartorius- ACCULAB公司；HWS12型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。1.3　试验方法

1.3.1　蜡样芽孢杆菌生物被膜制备

载体的清洗[6]：将不锈钢片用洗涤剂清洗，置于丙酮中超声15 min，除去表面油脂，再用蒸馏水冲洗干净后置于75%的乙醇浸泡30 min，蒸馏水冲净，烘干，然后放入装有10 mL 0.2%液体营养培养基的15 mm×150 mm试管中，灭菌备用。

生物被膜的培养：在10 mL含0.2%液体培养基和不锈钢片的无菌试管中，接入1%密度为108 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌菌液，混合均匀，37 ℃培养，平行试验三次。

1.3.2　杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的作用

将载有培养24 h生物被膜的不锈钢片用无菌PBS （0.05 mol/L，pH 7.2）漂洗3次，除去浮游菌和粘附不牢的菌，加入10 mL质量浓度为10，100和1 000 mg/L的杀菌剂（其中，次氯酸钠浓度按有效氯浓度计算，有效氯浓度采用间接碘量法测定）分别作用5，10，15，20，25和30 min后，迅速将不锈钢片转入10 mL中和剂（0.5%硫代硫酸钠溶于0.05 mol/L，pH 7.2的PBS，灭菌备用）中作用10 min，然后用无菌PBS漂洗3次，再将不锈钢片置于无菌试管中，加入10 mL无菌PBS，超声处理15 min（250 W），对菌悬液进行平板菌落计数，平行试验3次。超声平板菌落计数法的检测限均为0.54 log CFU/cm 2（即10 CFU/平板），用ND 表示试验结果低于检测限。

2　结果与分析

2.1　过氧化氢对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果

图1为过氧化氢对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果。由图可以看出，当过氧化氢质量浓度为10 mg/L时，在初始作用时间内（0~10 min），生物被膜中的活菌数随时间的延长显著下降（p ＜0.05）。作用5 min后，生物被膜中的活菌数下降至3.50 log CFU/cm 2，杀菌率为92.2%；作用10 min后，生物被膜中的活菌数下降至2.83 log CFU/cm 2，杀菌率为98.5%。当作用时间大于10 min时，生物被膜中的活菌数变化甚微，作用30 min后，生物被膜中的活菌数为2.20 log CFU/cm 2。质量浓度分别为100和1 000 mg/L的过氧化氢对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果相当。例如，作用5 min，蜡样芽孢杆菌生物被膜的活菌数分别下降1.82和1.85 log CFU/cm 2；作用20 min后，被膜活菌数分别下降2.40和2.41 log CFU/cm 2。提高过氧化氢质量对增强其对生物被膜的灭活效果不明显。例如，用于灭活生物被膜的过氧化氢质量浓度即使高达1 000 mg/L，灭活时间长达30 min，在不锈钢片上仍能检测到生物被膜活菌的存在，活菌数达1.14 log CFU/cm 2。由上述结果可知，过氧化氢对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭活性仅为中等水平，这与Lee等报道的结果类似[12]

。

图1　过氧化氢质量浓度对蜡样芽孢杆菌生物

被膜灭活的影响2.2　碘消灵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果

*通讯作者；基金项目：广东高校2014年度创新强校工程青年创新人才项目，广州市科技计划项目（201509010005），广州

市科信局-科技惠民专项（2014Y2-00187）

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图2为碘消灵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果。由图可知，利用10 mg/L碘消灵处理蜡样芽孢杆菌生物被膜5 min后，生物被膜的活菌数仅下降0.25 log CFU/cm 2，杀菌率为43.1%；生物被膜的活菌数随处理时间的延长而减少，处理30 min后，不锈钢片上的生物被膜活菌数下降至2.50 log CFU/cm 2。与过氧化氢类似，质量浓度分别为100和1 000 mg/L的碘消灵杀灭生物被膜的效果接近。利用10，100和1 000 mg/L碘消灵处理蜡样芽孢杆菌生物被膜30 min后，不锈钢片上生物被膜活菌数分别为2.50，1.65和1.14 log CFU/cm 2。由此可知，碘消灵杀灭蜡样芽孢杆菌生物被膜的效果不是很理想，这与Lee等报道的结果相差较大[12]，其原因可能是蜡样芽孢杆菌菌株来源不同，故对碘消灵

的抗性不同。

图2　碘消灵质量浓度对蜡样芽孢杆菌生物被

膜灭活的影响

2.3　次氯酸钠对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果

图3　次氯酸钠质量浓度对蜡样芽孢杆菌生物被

膜灭活的影响图3为次氯酸钠对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果。由图可知，利用ACC为10 mg/L的次氯酸钠处理蜡样芽孢杆菌生物被膜10 min后，其中的活菌数下降至3.94 log CFU/cm 2，杀菌率为88.5%；并且随处理时间的进一步延长，生物被膜中的活菌数下降不明显（p ＞0.05），处理30 min后，不锈钢片上的生物被膜活菌数下降至3.17 log CFU/cm 2，杀菌率为98.0%。当ACC为1 000 mg/L时，作用5 min后，生物被膜活菌数下降至3.18 log CFU/cm 2；作用30 min后，不锈钢片上仍有1.84 log CFU/cm 2被膜菌幸存。上述结果说明次氯酸钠对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果较差，这可

能是因为在中性条件下，次氯酸钠水解产生的HOCl 量很少，故杀菌效力大幅度下降。

2.4　过氧乙酸对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果

上述三种杀菌剂（过氧化氢、碘消灵和次氯酸钠）对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果均不甚理想，即使在高浓度下处理蜡样芽孢杆菌生物被膜较长时间（1 000 mg/L，30 min），在不锈钢片上仍有1.14~1.84 log CFU/cm 2的被膜态菌存活。在食品加工中，若生物被膜未被完全杀灭，幸存的被膜态菌将成为二次污染源，从而引发食品安全问题。因此，试验进一步探索了过氧乙酸对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果（图4）。从图4可以看出，在所研究的过氧乙酸浓度范围内，蜡样芽孢杆菌生物被膜中活菌数随杀灭时间的延长和过氧乙酸浓度的增加迅速降低（p ＜0.05）。当过氧乙酸的质量浓度为10 mg/L时，杀灭5 min后，生物被膜中的活菌数由杀灭前的4.64 log CFU/cm 2快速降至2.84 log CFU/cm 2；杀灭30 min后，被膜中的活菌数接近试验的检测限。利用100 mg/L过氧乙酸作为杀菌剂，杀灭25 min后，被膜中的活菌数就降至0.84 log CFU/cm 2，接近检测限，继续延长杀灭时间5 min，被膜中的活菌数低于检测限，故可以认为此时不锈钢片上的生物被膜全部被杀灭。利用高浓度过氧乙酸（1 000 mg/L）对生物被膜进行杀灭时，效果更显著，处理10 min后，被膜中的活菌数降至1.32 log CFU/cm 2，处理15 min后，被膜中的活菌数降至检测限以下。上述研究结果表明过氧乙酸对蜡样芽孢杆菌生物被膜有很强

的杀灭效果。

注：ND表示低于检测限（0.54 log CFU/cm 2为检测限），图5同

图4　过氧乙酸质量浓度对蜡样芽孢杆菌生物被

膜灭活的影响2.5　苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果

受上述过氧乙酸高效杀灭生物被膜结果的激励，试验探索了温和低毒的表面活性剂型杀菌剂——苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果（图5），以期为食品加工中高效杀灭抗性强、危害大的蜡样芽孢杆菌生物被膜提供更多的选择。从图5可以看出，类似于过氧乙酸、苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果随浓度和杀灭时间的增大而显著增强（p ＜0.05）。当苯扎溴铵的质量浓度为10 mg/L时，

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作用5 min后，蜡样芽孢杆菌生物被膜的活菌数下降1.22 log CFU/cm 2，杀菌率达到94.0%；作用20 min后，不锈钢片上的生物被膜活菌数下降2.20 log CFU/cm 2，杀菌率达到99.4%。当以100 mg/L苯扎溴铵为杀菌剂时，作用5 min后，蜡样芽孢杆菌生物被膜的活菌数下降2.30 log CFU/cm 2，杀菌率达到99.5%；作用30 min 后，被膜活菌数低于检测限。当质量浓度为1 000 mg/L时，苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭活性更高，作用5 min后，生物被膜活菌数就下降至1.58 log CFU/cm 2，杀菌率大于99.9%；作用20 min后，被膜活菌数即低于检测限。图5中的结果说明苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌生物被膜也具有很强的杀灭效果。但是，这种阳离子表面活性剂型杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭活性略逊于过氧乙酸，尤其是在低浓度时，两者的灭菌活性差别更明显。例如，蜡样芽孢杆菌生物被膜受10 mg/L过氧乙酸灭活30 min后，被膜活菌数降至0.84 log CFU/cm 2，而以10 mg/L苯扎溴铵为灭活剂时，作用相同时间后，被膜活菌数仅降至2.31 log CFU/cm 2

。

图5　苯扎溴铵质量浓度对蜡样芽孢杆菌生物被

膜灭活的影响

3　结论

1) 在所选用的5种杀菌剂中，过氧乙酸对蜡样

芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果最好，其次是苯扎溴铵，随后是过氧化氢和碘消灵，次氯酸钠的杀灭效果最差。

2) 杀菌剂对蜡样芽孢杆菌生物被膜的杀灭效果随杀菌剂浓度和杀灭时间的增大而增强。过氧乙酸质量浓度为100和1 000 mg/L时分别作用30和15 min或苯扎溴铵质量浓度为100和1 000 mg/L时分别作用30和20 min均能使不锈钢片上的蜡样芽孢杆生物被膜活菌数低于检测限。

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微生物清防蜡技术研究及应用

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/0c9009740.html, 微生物清防蜡技术研究及应用作者：刘江红贾云鹏徐瑞丹陈逸桐王鉴来源：《湖南大学学报·自然科学版》2013年第05期摘要：利用从大庆含蜡原油中分离、纯化得到的微生物清防蜡菌种和高产表活剂菌种，经鉴定清防蜡菌种和高产表活剂菌种均为芽孢杆菌属.以菌种对固体石蜡的降解率为指标，按照不同的比例将清防蜡菌种和高产表活剂菌种混合接种.当清防蜡菌种与高产表活剂菌种的复配比例是5∶3时，培养7 d后，清蜡率达到59%，防蜡率达到57.4%，原油粘度降粘率为44.7%，原油凝固点降低了3.4 ℃，培养液表面张力降低46.5%.采用微生物清防蜡技术对大庆外围榆树林油田的3口井进行现场试验，井12-36日产油增长41.2%，洗井周期由40 d延长至149 d，减少洗井次数4次；井13-39日产油增长33.3%，洗井周期由45 d延长至158 d，减少洗井次数5次；井14-43日产油增长37.5%，洗井周期由30 d延长至122 d，减少洗井次数5次. 关键词：微生物；芽孢杆菌属；蜡；降解；原油中图分类号：TE357 文献标识码：A 1材料与方法 1.1设备与材料主要设备：高速离心机，长沙英泰仪器有限公司；电子天平，岛津国际贸易有限公司；NDS8S旋转粘度计，上海精天电子仪器有限公司；XZD3型界面张力仪，上海平轩科学仪器有限公司；恒温振荡培养箱，上海森信实验仪器有限公司. 菌株来源：从大庆含蜡原油中筛选得到清防蜡和高产表活剂纯菌种.清防蜡、高产表活剂菌种扫描电镜图如图1～2所示.经实验室生理、生化鉴定清防蜡菌种和高产表活剂菌种均为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）. 1.2室内实验 1.2.1微生物清蜡、防蜡效果测定 1）微生物清蜡效果测定：在100 mL无机盐培养基中加入3.00 g固体石蜡，121 ℃灭菌20 min，接入不同比例复配混合的清防蜡菌种和高产表活剂菌种，45 ℃摇床培养7 d，同时接种单一的清防蜡菌种作为对比实验，清水洗净残留的固体，加热溶化后至冷却，风干称重，记录

蜡样芽胞杆菌及检验

蜡样芽胞杆菌及检验在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8版中，蜡样芽胞杆菌的分类地位为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。 1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。一、生物学特性 1、形态特性蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。 2、培养特性蜡样芽胞杆菌生长温度为25-37℃，最佳温度30-32℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇��卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。 3、生化特性

b+/-，50-50% 菌株是阳性； c-， 90-100% 菌株是阴性； d-，绝大多数菌株是阴性。 4、耐热性蜡杆芽胞杆菌耐热，其37℃16小时的肉汤培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90%所需的时间）约为10-15分钟；使肉汤中细菌（2.4×107/mL）转为阴性需100℃20分钟。其游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。二、流行病学 1、细菌分布蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。 2、流行情况蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。 3、临床症状当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中

一起由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒调查报告

一起由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒调查报告摘要 2007年8月29日，东丰县某中学食堂发生一起由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件，共有患者45人，其中男学生20人、女学生25人；年龄13～15岁；其中33人恶心、29人腹痛、19人腹泻、12人头晕、7人呕吐，最短潜伏期约3小时，最长潜伏期13小时，发病呈单峰型分布。中毒餐次确定为2007年8月28日晚餐。根据现场流行病学调查，结合患者临床表现及实验室检测，依据食物中毒诊断标准及处理原则，确定本次食物中毒为蜡样芽孢杆菌食物中毒。关键词蜡样芽孢杆菌食物中毒蜡样芽孢杆菌是食物中毒中较常见的致病菌，在我国细菌性食物中毒中居第3位，蜡样芽孢杆菌食物中毒的发生季节性明显，通常以夏、秋季6～10月最高，引起食物中毒所涉及的食品种类较多，主要以剩米饭、米粉最常见。基本情况 2007年8月29日晚21：00，东丰县某中学4名住宿生在本校食堂吃过晚饭3小时后，相继出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕等症状，值班老师当即将此4名学生送往东丰县医院就诊，于30日凌晨5时出院回学校正常上课。在30日上午学校将45名有轻微症状的学生分三批陆续送往县中医院、县医院就诊（其中包括29日晚到县医院就诊的4名学生），在县医院就诊6人、在县中医院就

诊39人，两医院均初步诊断为疑似食物中毒。卫生学调查情况该中学食堂取得了“卫生许可证”，食品生产经营环境、场所基本符合卫生要求、食品从业人员共7人。 8月29日晚餐食谱：主食为米饭、副食为蒜泥茄子、尖椒土豆片、尖椒干豆付、排骨白菜汤。据卫生监督员现场对发病学生调查反映说：当晚米饭有异味、副食有中午所剩的排骨白菜汤、鱼炖豆腐、熘鱼段等。卫生监督员现场检查中学食堂，发现存在下列问题：食品从业人员2名未取得健康证明；厨房内无封闭式餐饮具保洁柜；冰箱内食品生、熟混乱堆放在一起；厨房内四个菜板无生、熟标识；厨房内无防蝇设施（纱窗、纱门）。卫生监督人员现场采集剩余食品样品4种，有浸过的大米、大米饭、酱茄子、小白菜粉条大骨头汤；采集餐饮具样品四种，有刀、切生和熟食品的菜板、餐盘、饭盆；采集当日晚饭留在冰箱内的剩余食品两种，有酱茄子、小白菜粉条大骨头汤。流行病学调查截至8月30日上午11：00，东丰县医院和县中医院共收治四中学生45人，其中男学生20人，女学生25人；年龄13～15岁；其中33人恶心，29人腹痛，19人腹泻，12人头晕，7人呕吐；其中45人进食米饭（有异味、发黏），28人进食蒜茄子，19人进食鱼炖

一起蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的报告

一起蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的报告目的调查分析一起食物中毒的原因，为控制突发公共卫生事件提供科学依据。方法根据流行病学调查和临床症状，选择需要鉴定的致病茵，依据GB4789.10-2010、GB 4789.10-2003，对采集的标本进行致病菌的分离和鉴定。结果从可疑食物中分离出蜡样芽胞杆菌。说明这是一起由蜡样芽胞杆菌污染而引起的食物中毒。结论建议加强饮服行业的监管，严格贯彻执行各项卫生管理制度，是减少食物中毒发生的有效前提。标签：食物中毒；蜡样芽胞杆菌；检测 2011年9月3日，乌鲁木齐市疾病预防控制中心接到某博览会监测点一起可疑食物中毒的报告，经现场流行病学调查和实验室微生物学检验，确认为是一起由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒，现报告如下。 1资料与方法 1.1一般资料2011年9月3日下午14时，在某博览会服务的志愿者10余人在会馆内临时就餐点轮班吃盒饭，饭后约2～3h，5例出现不同程度的腹痛症状。截止当日18时30分，共发患者数5例。因患者自觉症状未进行性加重，未就诊。无住院及死亡病例。事发后外送单位相关负责人失踪，根据上述情况卫生监督部门及时终止餐馆营业。 1.2标本采集依据《中华人民共和国国家标准》《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》GB/T 4789.1-2003[1]、GB 4789.1-2010[2]、遵循无菌操作方法采集当天剩余食物样品立即送实验室进行病原微生物学检测。采集的可疑食物样品分别为米饭、卤鸡腿、西兰花、西红柿炒鸡蛋、蒜苔炒肉5种，均为加工烹制熟食。 1.3检验项目菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、致泻性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌。 1.4诊断依据对采集样本全部按照食品卫生微生物学检测标准GB 4789.2-2010、GB 4789.3-2010、GB 4789.4-2010、GB/T 4789.5-2003、GB 4789.7-2010、WS/T 9-1996、GB/T 4789.6-2003、GB 4789.10-2010、GB/T 4789.14-2003进行菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、致泻性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌。 1.5检验试剂及培养基增菌液：BPW、SC、TTB、7.5%氯化钠肉汤、肠道菌增茵肉汤、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤、PCA琼脂、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）等均由北京陆桥公司提供；沙门氏菌显色平板、金黄色葡萄球菌显色平板、弧菌显色平板由法国科玛嘉提供。所有试剂盒培养基均在有效期内使用。

蜡样芽孢杆菌试纸说明书

商品名称：蜡样芽孢杆菌测试片规格：24批次/盒检测项目：用于乳制品、肉类、淀粉类食品、各种甜点等的蜡样芽孢杆菌检测产品简介：蜡样芽孢杆菌测试片(FilmplateTM Bacillus cereus BL210)是一种商品化的一次性培养基产品，由选择性培养基、高分子吸水凝胶和专一性酶指示剂等构成，一步培养显色就可确认是否有病原菌的存在，大大地简化了检测程序，对于提高细菌性食物中毒突发事件的反应能力具有重要的作用，同时也可在食品生产企业使用。本产品适用于乳制品、肉类、淀粉类食品、各种甜点等的快速检测。执行标准：食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验（GB/T 4789.14-2003）。技术参数 1、样品处理：取样品25mL（g）放入含有225mL灭菌磷酸缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液。 2、接种：将蜡样芽孢杆菌测试片(BL210)置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管每个梯度各取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右，使培养基凝固，每个稀释度接种两片，同时做一片空白对照。 3 、培养：将测试片叠在一起放回原自封袋中，并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃，培养15～24h。 4、结果判读：对测试片进行观察，呈蓝绿色的菌落为蜡样芽孢杆菌。对于出现阳性菌落的样品，最好用其他方法作进一步的鉴定。品牌：天迈生物产地：杭州

附加说明 1、本产品具有很好的特异性，接种蜡样芽孢杆菌纯菌株产生典型的蓝绿色点，而大部分非目标菌如大肠杆菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和阪崎肠杆菌等均被抑制。 2、初步试验表明，蜡样芽孢杆菌测试片对纯菌的最低检测限为1cfu/mL。用蜡样芽孢杆菌测试片检测了23种食品样品，同时接种平皿做对比试验。测试片检出阳性样品7个，检出率为30.4％；用平皿法检出阳性样品6个，检出率为26.1％，测试片法比平皿法高了4.3％。 3、注意使用过的测试片上带有活菌，需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理。 4、保存条件：本产品需存放在4℃～10℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后,未用完的纸片要放回铝箔袋中封好，放到冰箱中，一个月内用完。在高湿度的环境中可能出现冷凝水，最好在拆封前将整包回温至室温。

微生物清防蜡技术优势

油井微生物清防蜡技术的特点与优势 1.油井结蜡的原因及其危害通常把C16H34-C63H128正构烷烃称为蜡。蜡在地层条件下通常以液体存在，然而在开采过程中，随着温度和压力下降以及轻质组分不断逸出，原油溶蜡能力降低，蜡开始结晶、析出、聚集，并不断沉积而使油井结蜡。如果蜡沉积在管杆上，导致油流通道减小，油流阻力增加，悬点载荷加重，电耗、材耗增大，进而出现蜡卡；如果蜡沉积到油层的孔道中，就会堵塞油层孔隙；蜡沉积到油管内壁及井筒设备上，会影响油井产量，还可能造成抽油泵失效和损坏；如果蜡沉积在地面管线上则会减小管线的有效直径，增加井口回压，输油能耗增加甚至地面管线堵塞，结蜡严重的井一旦停井就无法正常开井生产，需热洗或上下解卡。因此，结蜡井需要定期清防蜡维护，第页（共11 页） 1

否则会造成蜡卡。 2.目前的处理方法及其弊端常规清防蜡措施主要有：（1）机械清蜡机械清蜡就是用专门的刮蜡工具（清蜡工具)，把附着于油井中的蜡刮掉，这是一种既简单又直观的清蜡方法，在自喷井和抽油井中广泛应用。机械清蜡方法的主要优点是操作简便、有效、成本低，缺点是清下来的蜡容易落入井底，堵塞射孔孔眼或近井地层，有时对设备的磨损严重。（2）热洗热洗的目的是清洗油管中的蜡堵。这是现场常用的方法，但在循环处理过程中，由于井筒热损失，到达井底的温度已大大降低，如温度低于初始结晶温度时，溶于热油中的蜡又重新析出，沉积在射孔孔眼造成堵塞。而且热洗水柱大于地层压力，热洗留在油井中的洗井水需要经过3d～7d时间返排后，第页（共11 页） 2

油井才能恢复正常生产。热洗包括热水洗和热油洗。热水洗不能用于水敏油井；热油洗存在安全环保和劳动条件差等问题。热洗只具有清蜡作用而无防蜡作用。（3）化学清防蜡剂这是目前采用的主要方式。化学清蜡剂(主要化学成分为有机溶剂如混苯等)清除蜡堵较为有效，但价格昂贵，加药频繁，加药量大，药剂易燃易爆，毒性强，对人体健康危害较大，同时由于加入的药剂不可能均匀溶于原油，所以难以获得好的效果，而且也不能阻止井口附近结蜡，另外采用油套连通循环的方式，会造成压差改变，含水上升。（4）强磁防蜡器下入井下管柱，利用磁性改变分子极性分布，从而防止蜡颗粒的生成。但从现场应用看，效果不甚理想，因此此法不常用。（5）加热法主要是采用油管电加热器为油管内的油流加第页（共11 页） 3

MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

MM_FS_CNJ_0158出口食品蜡样芽孢杆菌微生物法 MM_FS_CNJ_0158 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 1.适用范围本方法适用于出口食品的检验。 2.培养基和仪器 2.1.培养基甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂； l-酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良V-P培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)； Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂； V-P试剂；碱性复红染色液。 2.2.仪器吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器； L形玻璃棒；恒温培养箱：30℃及36±1℃。 3.样品的保存和送检待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4 ℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。脱水食品可在常温下送检和储存。 4.样品的制备 4.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。 4.2.加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r/min均质2min。制成1∶10样品稀释液。 4.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。 4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10－6。

5.检验步骤 5.1.平板计数法取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。将平板置于30℃培养24h。选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型，可继续培养24h再计数。计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g 样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×104×10＝2×106。 5.2.最近似值(MPN)法适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个/g的食品。选用三管法MPN系列。取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。置于30℃培养48±2h。从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。置30℃培养24～48h。从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30℃培养24h，供作证实试验。根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表〔附录C(补充件)〕计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g，并作出报告。 6.证实试验 6.1.形态观察取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。 6.2.生化学性状葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35 ℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。硝酸盐还原试验：接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。 V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃培养48h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应(伊红色)。 L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35 ℃培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72h再观察。溶菌酶试验：

食物中毒、食品中常见污染细菌

食物中毒 1、概念摄入含生物性、化学性有毒有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后所出现的非传染性急性、亚急性疾病。是最典型、最常见的食源性疾病 2. 食物中毒发病特征：（1）潜伏期短，来势急剧，呈暴发性。（2）临床表现基本类似：大多为急性胃肠炎症状，即恶心、呕吐、腹痛、腹泻。（3）发病与特定的食物有关（4）人与人之间一般无直接传染：发病曲线呈突然上升、又迅速下降的趋势，无传染病流行过后的余波。 3 食物中毒的分类细菌性食物中毒、真菌性食物中毒、有毒动植物食物中毒、化学性食物中毒 6 食物中毒处理的总则 ?1）及时报告当地卫生行政部门。 ?2）对病人采取紧急处理（1）停止食用中毒食品（2）采取病人血液、尿液、吐泻物等样本，以备送检；（3）进行急救处理，包括催吐、洗胃和清肠（4）对症治疗和特殊治疗。 ?3）对中毒食品控制处理（1）保护现场，封存中毒食品或疑似食品（2）采集剩余可疑中毒食品，以备送检。（3）追回已售出的中毒食品或疑似食品（4）对中毒食品进行无害化处理或销毁。 ?4）根据不同的中毒食品，对中毒场所采取相应的消毒处理。 ?5）判定方法结合卫生学调查资料和实验室检查结果以及临床表现、流行病学资料、按各类食物中毒诊断标准确定的判定依据和原则作出综合判定。二细菌性食物中毒 1、细菌的特点单细胞原核微生物种类：球菌、杆菌、螺旋菌等假单胞菌属：G- 需氧、嗜冷、pH 5.0-5.2 微球菌（需氧）、葡萄球菌属（厌氧）：G+ 、嗜中温芽孢杆菌属（需氧、兼性厌氧）与梭菌属（厌氧）肠杆菌科各属：G- 、嗜中温 2、细菌性食物中毒的流行病学特征 1）发病率高、群体暴发 2）好发季节：夏秋季 3）好发食品：动物性食品为主，如肉鱼奶蛋及制品 4）症状重、发病率高、病死率低、抢救及时预后好。

抽油井微生物清防蜡作业指导书

抽油井微生物清防蜡作业指导书克拉玛依科力新手技术实业开发公司 2005年2月

抽油井微生物清防蜡作业指导书 1范围本作业指导书规定了抽油井微生物清防蜡选井、室内评价、现场施工、应急措施及效果监测等技术要求及操作规程；本作业书适用于新疆油田公司采油厂或作业区抽油井微生物清防蜡。 2引用标准 Q/XJ 0444-91 井下作业安全施工规定 Q/XJ 0492－1995油水井水力压裂施工规程 3微生物防蜡选井条件 ⑴热洗周期：小于50天，热洗周期越短则效果对比越明显； ⑵含蜡量：大于3%，最佳范围：8%~25%； ⑶含水量：小于90%，最佳范围：小于50%； ⑷日产量： 2～40吨/天； ⑸井温： 25～100℃，最佳范围：30~70℃ ⑹原油密度：大于0.80,最佳范围:0.83～0.93 ⑺ H2S含量：小于2% ⑻矿化度：小于8% ⑼沉没度：大于100m，200～500m时投入产出比较经济 ⑽气油比：小于300，最好小于100 ⑾油井环空畅通，无杀菌剂等化学物质. 4室内微生物清防蜡评价具备大量的基本菌量是基础，正确的性能评价是关键，在对每个区块进行微生物入井前，应先取代表性油样主要从以下几个方面进行微生物适应性室内评价：

①微生物生长特性分析：将菌量加入用 NH4H2PO4或（NH4）2HPO4或 NH4NO3和NH4CL或（NH4）2SO4各0.5%的培养液中，配成浓度为10％的菌液，在油层中部温度至井口处温度之间选取一定的间隔温度，在恒温箱中(或回旋振荡摇床)培养24～72h，在显微镜下用血小板计数器对比前后细菌数量的变化。可以判断出微生物适应的最佳温度及繁殖时间。有条件时还可进行微生物耐盐性试验 ②微生物在原油中生长特性分析：将菌量加入油样中，根据微生物生长的最佳温度及时间，在恒温箱中(或回旋振荡摇床)培养48h后，进行原油物性变化分析。根据原油特性变化可基本判断出微生物对原油的适应性。 ③原油特性变化:对比加入微生物前后，油样中蜡、胶质、沥青质、20～70℃原油粘温曲线、凝固点、界面张力等的变化。 ④对油样加入微生物后进行动、静态防蜡率的测定。 ⑤室内静态防蜡率试验方法:在100ml广口瓶中先加入30g原油，取2ml室内培养的菌液，再加入30g原油，盖紧瓶盖，在45±1℃的恒温水浴中恒温30min，用手振荡200次，使药剂在油中混合均匀，再放回45±1℃恒温水浴中恒温10min 后取出，放入35±1℃的恒温箱中恒温10h。在恒温箱中把广口瓶倒扣入一接收器中，恒温60min使广口瓶不再滴油，然后取出结蜡广口瓶，称取油蜡粘壁的总重量，计算防蜡率（%）。 5单井基础资料收集及水质稳定性试验在进行微生物注入前，必须对该区块的地层资料进行了解，掌握该区块地层水水质资料（主要是钙离子等成垢阳离子含量），根据水质资料数据对微生物注入液进行配方调整。在必要时必须选取有代表性单井样进行水质稳定性试验。试验方法为：采用自来水配制微生物营养液与单井采出液水样按比例混合中，充分混合后在一定温度下（泵挂处大致温度）恒温12小时后，观察试验状况，根据试验结果最终确定微生物注入液配方。 6微生物现场施工根据每口井的具体生产状况，完成单井微生物防蜡施工方案，一式三份(甲方一份、施工人员一份、存档一份)，建立单井施工档案及生产参数数据库，及时进行防蜡效果分析。 (1) 洗井：在注入微生物前一定周期内必须对该井进行洗井作业，将井筒及油

出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

MM_FS_CNJ_0340出口食品蜡样芽孢杆菌平板计数法 MM_FS_CNJ_0340 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 1.与适用范围本方法适用于出口食品的检验。 2.主要试剂和仪器 2.1.主要试剂（包括培养基）甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂； L－酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良V－P培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）； Betterfield氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂； V－P试剂；碱性复红染色液。 2.2.仪器吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器； L形玻璃棒；恒温培养箱：30℃及36±1℃。 3.样品的保存和送检待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。脱水食品可在常温下送检和储存。 4.过程简述 4.1.样品的制备 4.1.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。 4.1.2.加450ml无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r／min均质2min。制成1∶10样品稀释液。 4.1.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。 4.1.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀

释直至10－6。 4.2.检验步骤 4.2.1.平板计数法 4.2.1.1.取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。 4.2.1.2.将平板置于30℃培养24h。 4.2.1.3.选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型，可继续培养24h再计数。 4.2.1.4.计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。 4.2.1. 5.根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g 样品中蜡样芽孢杆菌数为（25×4／5）×104×10＝106。 4.2.2.最近似值（MPN）法适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个／g的食品。 4.2.2.1.选用三管法MPN系列。取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。 4.2.2.2.置于30℃培养48±2h。 4.2.2.3.从长菌的试管取培养物划线接种于MYP琼脂平板上。 4.2.2.4.置30℃培养24～48h。 4.2.2. 5.从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30℃培养24h，供作证实试验。 4.2.2.6.根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表［附录C（补充件）］计算蜡样芽孢杆菌的MPN值／g，并作出报告。 4.3.证实试验 4.3.1.形态观察取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。 4.3.2.生化学性状 4.3.2.1.葡萄糖发酵试验接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变为黄色（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）。 4.3.2.2.硝酸盐还原试验接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应（红色）。 4.3.2.3.V－P试验接种于改良V－P培养基中，35℃培养48h。加V－P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应（伊红色）。 4.3.2.4.L－酪氨酸分解试验接种于L－酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培养72h再观察。

VITEK_2全自动微生物鉴定系统在蜡样芽孢杆菌检测中应用

V ITE K 22全自动微生物鉴定系统在蜡样芽孢杆菌检测中应用刘水,杜志刚作者单位:北京市怀柔区疾病预防控制中心101400 【摘要】　目的　分析V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌检测的可靠性。方法　将蜡样芽孢杆菌的标准菌株及阳性菌株应用标准方法进行检测,同时应用V ITEK 全自动微生物鉴定系统检测,比较两种方法的检出率及检测时间。结果　两种方法检测16株蜡样芽孢杆菌符合率100%,缩短检测时间6～48h 。结论　V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的鉴定简便、快速、准确,适合食源性疾病监测及食物中毒检测工作中应用。【主题词】　微生物学技术;食物中毒;芽孢杆菌,蜡状/分离和提纯【中图分类号】　R446.5 【文献标识码】　A 【文章编号】　100926647(2010)2425854202 本实验采用标准方法与V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌阳性菌株的检测,评估V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的鉴定检测,现报告如下。 1　材料与方法1.1　材料 1.1.1　菌株来源　本单位日常工作中分离的蜡样芽孢杆菌11 株,平谷疾控中心提供蜡样芽孢杆菌4株,中国药品生物制品检定所提供蜡样芽孢杆菌标准菌株(63301)1株,中国普通微生物菌种保藏中心提供苏云金芽孢杆菌(22945)1株。 1.1.2　检测仪器和培养基　VITEK 22全自动微生物鉴定仪、BAC 芽孢杆菌鉴定卡、浊度仪等购自法国生物梅里埃公司,其他培养基购自北京陆桥公司。 1.2　方法 1.2.1　标准方法　按照G B/T4789.1422003中的方法进行检测[1]。 1.2.2　V ITEK 22全自动微生物鉴定仪检测　对16株蜡样芽孢杆菌阳性菌株及1株苏云金芽孢杆菌菌株(用于类似菌鉴别),进行复苏后接种于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基上32℃培养13h ,挑选典型菌落划线分离于添加多粘菌素B 的营养琼脂平板上[2]和血琼脂平板上,32℃培养13h 做纯培养和溶血试验。将纯培养分离出的菌株,用无菌棉签擦脱部分菌苔与 0.9%氯化钠溶液充分振荡混匀,将菌悬液调至013～015麦氏度,在鉴定卡架上将菌液管与BAC 鉴定卡连接,将鉴定卡上信息输入V ITEK 22全自动微生物鉴定系统工作站,后将鉴定卡放入仪器充填室进行自动充填,充填结束后取出鉴定卡放入孵育室进行自动培养检测。15～18h 后仪器工作站给出最终结果。 2　结果 2.1　检测结果　16株蜡样芽孢杆菌在添加多粘菌素B 的营养琼脂平板上菌落形态为灰白色,不透明,边缘不整,具融蜡状。 2.2　标准方法对蜡样芽孢杆菌检测 2.2.1　证实试验　革兰阳性杆菌,芽胞全部位于菌体内。动力(+),明胶液化(+),硝酸盐还原(+),过氧化氢酶(+),厌氧下葡萄糖发酵(+),甘露醇(-)。 2.2.2　与苏云金芽孢杆菌鉴别试验　无红色结晶小体,无游离芽胞。结果为阴性。 2.3　V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌检测　16株菌株V ITEK 22的鉴定结果:怀柔7#、8#菌株99%蜡样芽孢杆菌;怀柔1#、5#、6#、9#、10#、11#菌株,平谷2#～4#菌株 98%蜡样芽孢杆菌;怀柔2#～4#菌株,平谷1#菌株92%蜡样芽孢杆菌。标准1#菌株100%蜡样芽孢杆菌;标准2#菌株 100%苏云金芽孢杆菌。鉴定时间为16h 。3　讨论蜡样芽孢杆菌的标准检验方法中,病原菌鉴定采用形态观察、生化性状及培养特性等证实试验来判定[3],在实际工作中,由于检测样品的复杂性和蜡样芽孢杆菌引起中毒症状的非特征性,其病原菌的鉴定工作难度相当大,往往要求采用多项技术进行综合判断和验证。而且标准方法中对与蜡样芽孢杆菌培养形态、生化特性相似的苏云金芽孢杆菌的鉴别,也比较繁琐并大大增加了鉴定的时间。 V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌检测是采用V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对纯培养出的菌落进行生化鉴定。生化反应项目达三十几项,远远多于标准方法生化反应项目。从本试验可看出16株蜡样芽孢杆菌V ITEK 鉴定仪检测可信度为97%,阳性标准菌株可信度为100%,结合纯培养菌落的典型特征及强溶血、有动力特征性反应[4],可证实 V ITEK 鉴定仪的鉴定结果。在与类似菌苏云金芽孢杆菌鉴别试验可同时完成。因此采用V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的鉴定简化了实验步骤,减少人为误差对实验的影响,缩短了检测报告时间,比标准方法节省检测时间6～48 h 。 V ITEK 全自动微生物鉴定系统,具有高度的特异性、敏感性和重复性,系统可联机孵育、定时扫描、自动分析,操作简便,人为误差小。本实验利用V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的快速鉴别,得到了形态学和标准方法的验证,表明V ITEK 鉴定仪的可靠性和准确性。因此,使用VITEK 全自动微生物鉴定系统可实现对食品中蜡样芽孢杆菌的快速鉴