实验六 聚合酶链式反应

学院：专业：姓名：学号：实验六聚合酶链式反应(PCR)和PCR产物纯化

实验目的

1、了解PCR反应的基本原理。

2、了解PCR反应的优化条件和PCR的应用。

3、掌握PCR产物纯化的方法。

实验原理

PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的技术。1990年，Kary B.Mullis 发明了PCR技术，并因此在1995年荣获诺贝尔化学奖。PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，并且随着PCR技术的日趋完善，PCR技术在人类生活中的应用也越来越广泛。PCR、分子克隆和DNA序列分析构成了现代分子生物学实验工作的基础。PCR反应包括三个基本步骤：①变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；②退火：两中寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；③Tap DNA聚合酶在最适温度下（72℃），以目的DNA合成。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍。这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25~35轮循环就可使目的DNA片段扩增达106倍。

实验步骤

1、PCR反应

⑴在EP管中依次下列试剂（50μl反应体系）

试剂用量/μl

灭菌H2O 35.5

PCR反应缓冲液 5

DNTP(4种，每种浓度10μmol/L) 2

上游引物 2

下游引物 2

模板DNA 1

Taq 0.5

⑵摇匀后稍离心，在放入PCR仪中

2、将PCR产物全部用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

3、用干净锋利的小刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml

离心管中。

4、按1:3比例加入Extraction Buffer 中。

5、于恒温水浴中50℃温育，直到凝胶融化。

6、将融化后的混合液全部转移到Spin Column内，于6000g离心1分钟，并弃

去接液管内液体

7、将Spin Column内加入500μl Extraction Buffer,于12000g离心60s，并弃去

接液管内液体。

8、向Spin Column内加入750μl Wash Buffer于12000g离心60s，并弃去接液

管内液体。

9、再次于12000g离心1分钟，然后将Spin Column转移到无菌的1.5ml离心

管内。

10、向Spin Column内加入20μl Elution Buffer并于室温静置1分钟。

11、于12000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段

12、取50μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

实验结果与分析

①

②

实验结果：通过PCR三个步骤，解链---退火---延伸，电泳后得到了DNA的片段，如图①，我的实验结果为10号所显示的图像；再经过DNA的纯化，电泳后得到了DNA的片段长度，如图②，我的实验结果为3号所显示的图像，DNA的长度在600bp上。

分析：图①中10号图像比较清晰，说明在操作过程无很大的失误，无污染，为后面的实验做了一个很好的基础。

图②中3号图像的DNA 的片段长度为600bp，可能在操作过程中因操作不当，有些被污染，导致在图像中有些模糊的亮线；

聚合酶链式反应

聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制

端口聚合

实训六端口聚合 实验名称：端口聚合。 实验目的：掌握链路聚合的配置及原理，理解端口聚合的作用和特点。 技术原理：端口聚合（Aggregate-port）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路聚合成一条逻辑链路，形成一个拥有较大宽带的端口，从而形成一条干路，增大链路带宽，可以实现均衡负载，并提供冗余链路。 实现功能：实现链路备份聚合，增加交换机之间的传输带宽，可在冗余链路上实现均衡负载。 实验设备：cisco2960一台，cisco2950一台，PC四台，直连线2根，交叉线2根，配置线2根。 实验拓朴： 1.端口聚合提供冗余备份链路 背景描述： 某企业采用两台交换机组成一个局域网，由于很多数据流量是跨交换机进行转发的，因此需要提高交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份，为此网络管理员在两台交换机之间采用两根网线互连，并将相应的两个端口聚合为一个逻辑端口，现在要在交换机上做适当配置来实现这一目标。 技术原理： 端口聚合（Aggregate-port）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路合成一条逻辑链路。从而增大链路带宽，解决交换网络中因带宽引起的网络瓶颈问题。多条物理链路之间能够相互冗余备份，其中任意一条链路断开，不会影响其他链路的正常转发数据。 实验注意事项： 按照拓扑图连接网络时，两台交换机都配置完端口聚合后，再将两台交换机连接起来，如果先连线再配置会造成广播风暴，影响交换机的正常工作。 实验步骤：

步骤1：switch0的基本配置 Switch0> Switch0>enable Switch0#configure terminal Switch0(config)#vlan 10 Switch0(config-vlan)#name test10 Switch0(config-vlan)#exit Switch0(config)#interface fastethernet 0/5 Switch0(config-if)#switchport access vlan 10 Switch0(config-if)#end Switch0#show vlan VLAN Name Status Ports ---- -------------------------------- --------- -------------------------------1 default active Fa0/1, Fa0/2, Fa0/3, Fa0/4 Fa0/6, Fa0/7, Fa0/8, Fa0/9 Fa0/10, Fa0/11, Fa0/12, Fa0/13 Fa0/14, Fa0/15, Fa0/16, Fa0/17 Fa0/18, Fa0/19, Fa0/20, Fa0/21 Fa0/22, Fa0/23, Fa0/24 10 test10 active Fa0/5 步骤2：switch0上配置聚合端口 Switch0(config)#interface port-channel 1 Switch0(config-if)#switchport mode trunk Switch0(config-if)#exit Switch0(config)#interface range fastethernet 0/1-2 Switch0(config-if-range)#channel-group 1 mode on upSwitch0(config-if-range)#end Switch0#show run //查看端口聚合信息Building configuration...

RNA的聚合酶链式反应

RNA的聚合酶链式反应：目前常用的RNA检测方法有原位杂交，点杂交，Northern印记杂交以及核酸酶保护试验等。这些方法的普遍缺点是难以检测低丰度的信使RNA，并且操作繁琐，将RNA反转录和PCR结合起来建立RNA聚合酶链式反应（RT-PCR）则可以克服上述缺点。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以信使RNA为模板合成cDNA，再以CDNA为模板进行PCR反应。此法快速，简便，并且灵敏度高。此法可以检测单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA。 RT-PCR 应用：分析基因的转录产物 克隆cDNA及合成cDNA探针， 改造cDNA序列等 RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整。并且不含DNA，蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物。而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅ处理反转录产物，消除ＤＮＡ后在进行ＰＣＲ。如果蛋白质未除尽可与ＲＮＡ结合，从而影响反转录和ＰＣＲ反应。 常用的反转录酶有二种，也就是ＡＭＶ，和ＭｏＭＬＶ的反转录酶 ＡＭＶ反转录酶由二个不同亚基组成，具有较强的ＲＮａｓｅＨ活性。可水解ＲＮＡ模板，以ＲＮＡ模板合成单链ＤＮＡ的酶活性最适作用温度为４２摄氏度。ＭｏＭＬＶ反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为３７摄氏度。ＲＮａｓｅＨ活性较低，适于合成大片段

全长ｃＤＮＡ 但是当模板ＲＮＡ的二级结构影响反转录反应时，用ＡＭＶ反转录酶更合适，因为较高的反应温度会消除ＲＮＡ二级结构的影响。此外ｉａ这二种反转录酶的缓冲液有所不同。 最近，从嗜热栖热菌ＨＢ８中分离得到Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，９５摄氏度时该酶的半衰期为２０分钟具有５—３外切酶活性，无３—５外切酶活性，利用Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶同时具有反转录酶的特点，可以简化ＲＴ－ＰＣＲ，并且比Ｔａｑ聚合酶反应敏感度高１００倍。所以更优越。Ｔｔｈ聚合酶作用温度高，可消除ＲＮＡ的二级结构对反转录反应的影响，增加ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的反转录的活性，可增加ＲＴ－ＰＣＲ反应灵敏性。 ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的缺点：反转录酶活性需要二价锰离子，而二价锰离子会降低ＤＮＡ聚合酶的忠实性， ＴｔｈＤＮＡ聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为１／５００

聚合酶链式反应

实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。

ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。

22_端口聚合实验

0分计。 4. 实验报告文件以PDF 格式提交。 【实验题目】端口聚合实验 【实验目的】理解链路聚合的配置及原理。 【实验内容】 (1)完成实验教程第三章实例3-5的实验，回答实验提出的问题及实验思考。（P99-102） (2)端口聚合和生成树都可以实现冗余链路，这两种方式有什么不同？ (3)你认为本实验能实现负载平衡吗？如果不能，请讨论原因并设计方法，进行实验验证。 【实验要求】 一些重要信息信息需给出截图，注意实验步骤的前后对比。 【实验记录】(如有实验拓扑请自行画出,) (1)【实验名称】 端口聚合提供冗余备份链路。 【实验目的】 理解链路聚合的配置及原理。 【背景描述】 假设某企业采用两台交换机组成一个局域网，由于很多数据流量是跨过交换机进行转发的，因此需要提高交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份，为此网络管理员在两台交换机之间采用两根网线互连，并将相应的两个端口聚合为一个逻辑端口，现要在交换机上做适当配置来实现这一目标。 【技术原理】 端口聚合（Aggregate-port ）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路聚合成一条逻辑链路。从而增大链路带宽，解决交换网络中因带宽引起的网络瓶颈问题。多条物理链路之间能够相互冗余备份，其中任意一条链路断开，不会影响其他链路的正常转发数据。 端口聚合遵循IEEE 802.3ad 协议的标准。 【实现功能】 增加交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份。 【实验设备】 S3760（两台）、PC （两台）、直连线（4条） 【实验拓扑】 按照拓扑图连接网络时注意，两台交换机都配置完端口聚合后，再将两台交换机连接起来。如果先连线再配置会造成广播风暴，影响交换机的正常工作。

22_端口聚合实验

1. 实验报告如有雷同，雷同各方当次实验成绩均以0分计。 2. 当次小组成员成绩只计学号、姓名登录在下表中的。 3. 在规定时间内未上交实验报告的，不得以其他方式补交，当次成绩按0分计。 4. 实验报告文件以PDF 格式提交。 【实验目的】理解链路聚合的配置及原理。 【实验内容】 (1)完成实验教程第三章实例3-5的实验，回答实验提出的问题及实验思考。（P99-102） (2)端口聚合和生成树都可以实现冗余链路，这两种方式有什么不同？ (3)你认为本实验能实现负载平衡吗？如果不能，请讨论原因并设计方法，进行实验验证。 【实验要求】 一些重要信息信息需给出截图，注意实验步骤的前后对比。 【实验记录】(如有实验拓扑请自行画出,) (1)【实验名称】 端口聚合提供冗余备份链路。 【实验目的】 理解链路聚合的配置及原理。 【背景描述】 假设某企业采用两台交换机组成一个局域网，由于很多数据流量是跨过交换机进行转发的，因此需要提高交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份，为此网络管理员在两台交换机之间采用两根网线互连，并将相应的两个端口聚合为一个逻辑端口，现要在交换机上做适当配置来实现这一目标。 【技术原理】 端口聚合（Aggregate-port ）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路聚合成一条逻辑链路。从而增大链路带宽，解决交换网络中因带宽引起的网络瓶颈问题。多条物理链路之间能够相互冗余备份，其中任意一条链路断开，不会影响其他链路的正常转发数据。 端口聚合遵循IEEE 802.3ad 协议的标准。 【实现功能】 增加交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份。 【实验设备】 S3760（两台）、PC （两台）、直连线（4条） 【实验拓扑】 按照拓扑图连接网络时注意，两台交换机都配置完端口聚合后，再将两台交换机连接起来。如果先连线再配置会造成广播风暴，影响交换机的正常工作。 院系 软件学院 班 级 电政一班 组长 狄志路 学号 12330072 学生 狄志路 实验分工 狄志路 设计方案，实现操作，撰写 实验报告 警示

PCR(聚合酶链式反应)原理

PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR 已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。 PCR仪介绍及其选购 P CR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量

神码生成树,端口聚合实验

生成树、端口聚合实验2010-05-15 10:29:04| 分类：网络设备| 标签：|字号大 中 小订阅 设备：DCS-3950一台，DCRS-5650一台（两台3950也可，不涉及三层功能），PC两台，Console 线1-2根，直通线4根 初始准备：将PC1连至3950,3950连5650,5650连PC2，配置IP地址，Ping通 实验过程： 拿出另一根网线，连接3950与5650，数秒后交换机3个接口灯狂闪，原本ping通的变为不通 注：有些交换机默认启用生成树，可以先show spanning-tree查看，是否开启，如果开启，先行关闭。 在3950上输入 DCS-3950-26C(config)#spanning-tree MSTP is starting now, please wait............. MSTP is enabled successfully. DCS-3950-26C(config)# 可以看到，端口不再狂闪，数秒后网络恢复正常，再等待数秒后，再次狂闪，网络再次瘫痪 DCS-3950-26C#show spanning-tree -- MSTP Bridge Config Info -- Standard : IEEE 802.1s Bridge MAC : 00:03:0f:13:56:3b Bridge Times : Max Age 20, Hello Time 2, Forward Delay 15 Force Version: 3 ########################### Instance 0 ########################### Self Bridge Id : 32768 - 00:03:0f:13:56:3b Root Id : this switch Ext.RootPathCost : 0 Region Root Id : this switch Int.RootPathCost : 0 Root Port ID : 0 Current port list in Instance 0: Ethernet0/0/1 Ethernet0/0/6 Ethernet0/0/17 (Total 3) PortName ID ExtRPC IntRPC State Role DsgBridge DsgPort

7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr） 逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：（1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA 高效转录系统。 实验材料：组织、细胞 试剂、试剂盒：RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶

STP和端口聚合实验

交换机的生成树协议（STP）和端口聚合的应用 1、实验目的 配置交换机之间的物理冗余备份链路，利用生成树协议消除逻辑上的循环冗余，避免形成数据帧的循环转发和广播风暴。 配置交换机之间的多端口聚合连接，提高交换机之间传输的速度。 2、实验条件 ?华为交换机Quidway S2403H两台、网线若干、微机若干台、专用配置电 缆一条。 ?实验拓扑图：如下图所示。 PCB:VLAN3 PCD:VLAN3 PCA:VLAN2PCC:VLAN2 3、实验内容及步骤 1）STP ?按上图连接交换机SwitchA、SwitchB，在e0/23和e0/24两个端口进行 trunk连接。 ?观察交换机之间形成的数据帧循环转发和广播风暴。（两个S之间只连一 根网线时，跨交换机同VLAN的两个计算机能PING通；两根网线连接一 分钟后，两个S的红灯绿灯都亮，这两个计算机不能PING通） ?两个S之间连两根网线时，运行生成树协议阻断冗余链路，消除桥接网 络中的逻辑路径环路，避免数据帧的循环转发和广播风暴。（两个S的绿 灯亮，红灯偶尔闪，这两个计算机能PING通） 开启生成树功能：[Quidway] stp enable ?当前活动的转发路径发生故障时激活冗余备份链路恢复网络连通性。 分别拔下一根交换机之间的连线，测试交换机两端计算机之间的连通性，仍能保持网络的连通。 ?关闭交换机的生成树功能：[Quidway] stp disable ‘两个S都关闭 一分钟后，就PING不通 （如果确定某个端口连接的部分不存在回路，则可以通过命令关闭该端口的生成树功能：[Quidway-Ethernet0/1] stp disable ） ?通过命令配置网桥优先级（Bridge Priority，默认为32768），将合适 的交换机推举为根桥。 [Quidway] stp priority bridge-priority 比如：[Quidway] stp priority 4096 优先级小的交换机为根桥，如果优先级相同，则MAC地址小的为根桥。 [Quidway] display stp ‘用于显示该交换机的stp 设置

1聚合酶链式反应PCR技术

实验1 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。

ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。

数据通信实验四-交换机链路聚合配置实验

实验四交换机链路聚合配置实验 一、目的要求 1、了解链路聚合控制协议的协商过程； 2、掌握链路聚合配置过程。 二、实验容 背景描述: 假设某企业采用两台交换机组成一个局域网，由于很多数据流量是跨过交换机进行转发的，因此需要提高交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份，为此网络管理员在两台交换机之间采用两根网线互连，并将相应的两个端口聚合为一个逻辑端口，现要在交换机上做适当的配置来实现这一目标。 工作原理: 端口聚合（Aggregate-port）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路聚合成一条逻辑链路。从而增大链路带宽，解决交换网络中因带宽引起的网络瓶颈问题。多条物理链路之间能够相互冗余备份，其中任意一条链路断开，不会影响其它链路的正常转发数据。 ●端口聚合使用的是EtherChannel特性，在交换机到交换机之间提供冗余的高速的连 接方式。将两个设备之间多条FastEthernet或GigabitEthernet物理链路捆在一起组成一条设备间逻辑链路，从而增强带宽，提供冗余。 ●两台交换机到计算机的速率都是100M，SW1和SW2之间虽有两条100M的物理通道相 连，可由于生成树的原因，只有100M可用，交换机之间的链路很容易形成瓶颈，使用端口聚合技术，把两个100M链路聚合成一个200M的逻辑链路，当一条链路出现故障，另一条链路会继续工作。 ●一台S2000系列以太网交换机只能有1个汇聚组，1个汇聚组最多可以有4个端口。 组的端口号必须连续，但对起始端口无特殊要求。 ●在一个端口汇聚组中，端口号最小的作为主端口，其他的作为成员端口。同一个汇 聚组中成员端口的链路类型与主端口的链路类型保持一致，即如果主端口为Trunk 端口，则成员端口也为Trunk端口；如主端口的链路类型改为Access端口，则成员端口的链路类型也变为Access端口。 ●所有参加聚合的端口都必须工作在全双工模式下，且工作速率相同才能进行聚合。 并且聚合功能需要在链路两端同时配置方能生效。 ●端口聚合主要应用的场合： ●交换机与交换机之间的连接：汇聚层交换机到核心层交换机或核心层交换机 之间。 ●交换机与服务器之间的连接：集群服务器采用多网卡与交换机连接提供集中 访问。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 详细 实验方法 ?逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料 ?组织或细胞样品 试剂、试剂盒 ?RNA提取试剂 ?dNTP 混合物 ?Taq DNA聚合酶 ?第一链cDNA合成试剂盒 仪器、耗材 ?离心管 ?离心机 ?水浴锅 ?PCR管 ?电泳仪 ?凝胶图像分析系统 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，R T-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 四、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。

实验八 交换机之间的端口聚合(学生用)

实验八 交换机之间的端口聚合 【场景构建】 学校的1号教学楼内计算机的数量比较多，是一个独立的局域网，上联到校中心机房交换机网络的流量较大，为了提高数据带宽，要求通过增加交换机之间的网线连接数量来实现，并且能够提供冗余链路。 [实验目的] 1、 了解什么交换机之间的端口聚合 2、 熟练掌握端口聚合的的方法与命令。 【知识准备】 端口聚合（Aggregate-port ）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路合成一条逻辑链路。从而增大链路带宽，解决交换网络中因带宽引起的网络瓶颈问题。多条物理链路之间能够相互冗余备份，其中任意一条链路断开，不会影响其他链路的正常转发数据。 思科开发了端口聚合协议（PagP ）。交换机通过支持以太信道的端口交换PagP 分组。它可以将具有相同速度，双工模式，本地vlan ，vlan 范围和中继状态和类型接口组合在一起。PagP 只在配置的静态VLAN 中或中继模式相同的端口上建立以太信道。如果某个被捆绑的端口发生变化，PagP 将动态地修改以太信道参数。 【实验一】 二层交换机之间的端口聚合 1.1 实验设备 1、2950-24交换机2台 2、PC 机2台 3、交叉线、直通线若干。 1.2 组网图 PC1PC2 SW1 SW2 1.3 实验设备IP 地址及要求 PC1连接在交换机SW2的F0/1端口,也属于VLAN 10。两台交换机之间的F0/23和F0/24端口通过交叉线连接，通过端口的聚合，使两条100M 的物理链路能够形成一条200M 的逻辑链路，从而实现提高交换机之间

带宽的目的，同时当一根网线发生故障时，另一根网线仍然可以担负传输功能， 1.4配置步骤 第一步：PC机上的IP地址请自行设置完成。（默认动作） 第二步：配置2950-24交换机SW1上的F0/1，加入VLAN 10 第三步：配置汇聚以太网通道组号及传输模式 第四步：配置需要汇聚的端口及汇聚模式 第五步：配置2950-24交换机SW2上的F0/1，加入VLAN 10 第六步：配置汇聚以太网通道组号及传输模式 第七步：配置需要汇聚的端口及汇聚模式 1.5 实验验证(截图保存在PKT文件中) 1、交换机SW1上端口聚合的情况。 2、交换机SW2上端口聚合的情况。

第五章聚合酶链式反应

第五章聚合酶链反应及其相关技术 PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。 5.1 PCR技术原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。 在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。如此反复进行，DNA片段的数目可以呈

聚合酶链式反应PCR实验报告

实验二聚合酶链式反应（PCR） 一、实验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、器材与试剂 1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料 三、实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板1μl 3．引物T7 1μl 4．引物sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成

1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。

锐捷端口聚合提供冗余备份链路实验

【实验名称】 端口聚合提供冗余备份链路。 【实验目的】 理解链路聚合的配置及原理。 【背景描述】 假设某企业采用两台交换机组成一个局域网，由于很多数据流量是跨过交换机进行转发的，因此需要提高交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份，为此网络管理员在两台交换机之间采用两根网线互连，并将相应的两个端口聚合为一个逻辑端口，现要在交换机上做适当配置来实现这一目标。 【技术原理】 端口聚合（Aggregate-port）又称链路聚合，是指两台交换机之间在物理上将多个端口连接起来，将多条链路聚合成一条逻辑链路。从而增大链路带宽，解决交换网络中因带宽引起的网络瓶颈问题。多条物理链路之间能够相互冗余备份，其中任意一条链路断开，不会影响其他链路的正常转发数据。 端口聚合遵循IEEE 802.3ad协议的标准。 【实现功能】 增加交换机之间的传输带宽，并实现链路冗余备份。 【实验设备】 S2126G（两台）、PC（两台）、直连线（4条） 按照拓扑图连接网络时注意，两台交换机都配置完端口聚合后，再将两台交换机连接起来。如果先连线再配置会造成广播风暴，影响交换机的正常工作。 【注意事项】 1、只有同类型端口才能聚合为一个AG端口。 2、所有物理端口必须属于同一个VLAN。 3、在锐捷交换机上最多支持8个物理端口聚合为一个AG。 4、在锐捷交换机上最多支持6组聚合端口。 【参考配置】 SwitchA#show running-config ! 显示交换机SwitchA的全部配置 Building configuration... Current configuration : 497 bytes version 1.0 ! Vlan 10 name slaes ! hostname SwitchA 1 唐箐整理