应用PCR法检测生物制品中支原体污染

细胞培养中支原体污染

细胞培养中的支原体污染的预防及处理 Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.wendangku.net/doc/0212766666.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养

解脲支原体检查方法

如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 解脲支原体检查方法 导语：解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会 解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会表现出来的，而解脲支原体的检查方法有是有很多的，一般在做这个检查的时候都是很多男性出现了尿多尿急尿频繁的现象，所以才到医院做检查，那么解脲支原体检查方法有哪些？ 解脲支原体的检查方法主要有三种，第一种检查方法就是血液检查，主要是通过抽血化验。第二种检查方法就是通过口腔的涂片的培养来进行检查。第三种检查方式就是PCR的技术检测，这种检查方式可以检查出igm的抗体情况，然后再判断感染的情况。这种疾病的治疗可以使用四环素，比如米诺环素、多西环素等等，但是建议最好两种到三种的抗生素结合一起使用，治疗效果更好。 支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。 男性支原体检查方法有哪些？男性支原体检查方法如下： 1、血常规：周围血白细胞计数一般正常嗜酸性粒细胞增多。 2、血清学检全：采用补体结合试验着恢复期血清抗体效价比急性预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏

1医学检验毕业论文 (三种肺炎支原体检测法的临床应用分析)

毕业论文 题目：三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 地市: 学校: 准考证号: 考生姓名: 王莹 指导老师: 二〇一八年八月十四日

三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 摘要 目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。 关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究

目录 前言 (4) 第一章文献综述 (5) §1.1 肺炎支原体的定义 (5) §1.2 肺炎支原体的发病机制 (5) §1.3 肺炎支原体的分类 (5) §1.4 肺炎支原体的临床表现 (5) §1.5 肺炎支原体的临床诊断 (5) §1.6 肺炎支原体的实验室检查 (6) 第二章材料和方法 (7) §2.1 样本 (7) §2.2方法概述 (7) §2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (7) §2.4实验方法 (7) §2.5统计学方法 .................................................................... .. (8) 第三章结果 (9) 第四章讨论 (10) 结论 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 错误！未定义书签。

细胞支原体污染相关知识简介

细胞支原体污染相关知识简介 （2016年10月16日） （1）支原体简介： 支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.1 - 0.6微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。其中，有近20种曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的（注：具体的支原体种类，上海易色的《一步法恒温支原体检测试剂盒》说明书中有详细介绍）。而且同一种细胞经常被多种支原体污染。 （2）支原体污染细胞的途径： 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。 细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等。 （3）细胞支原体污染的隐蔽性： 由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达107-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。 而且，轻度到中度的支原体污染并不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。 以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培

表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]

3. Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC?). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma? Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18 4. John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. p. 24.

支原体检查

附录XIIB支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基

内。每个稀释度接种3支试管，置36℃ 士1℃ 培养7～14天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 )应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。 检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃ ；超过24小时应置一20℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 )，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃ 士1℃ ）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃ 士1℃ 培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃ 士l℃ 培养21天，每隔3天观察1次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank 's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank ' s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol / L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。 培养墓及指示细胞（1） DMEM完全培养基。 ( 2 ) DMEM无抗生素培养基。

男性解脲支原体阳性怎样检查和治疗

男性解脲支原体阳性怎样检查和治疗 男性解脲支原体发病率越来越高，要治疗，我们得先了解它，支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，4种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体，在泌尿生殖系统感染中，男性解脲支原体感染相对高发。那么男性解脲支原体检查方法有哪些？解脲支原体的检查方法主要有三种： 第一种、血液检查，主要是通过抽血化验。 第二种、通过口腔的涂片的培养来进行检查。 第三种、PCR的技术检测，这种检查方式可以检查出抗体情况，然后再判断感染的情况。 男性解脲支原体的治疗 1、西药治疗 西药抗生素是西医治疗支原体、衣原体感染的主要方法，但由于支原体、衣原体对作用于细胞壁的抗生素耐药，所以西医只能用抑制膜蛋白和胞浆蛋白合成药物，如喹诺酮类、四环素和红霉素等抗生素来治疗。然而虽然支原体、衣原体对这类抗生素敏感，但由于抗生素具有抗药性、耐药性等副作用，所以患者如果长期服的话容易导致体内的菌群失调，因此在治疗时要注意治疗时长和用量。一般服用2~3

个疗程后即可治愈，否则就要及时更换治疗方法。 2、中药治疗 中药在治疗支原体、衣原体感染时，主要是通过改变支原体、衣原体在患者体内的生存环境和提高患者自身的抵抗力，来达到去病固本的效果。多年来专利中药利尿消炎丸就对支原体、衣原体的治疗取得了显著地效果。 中药利尿消炎丸的配方中含有滑石、桃仁、赤芍、红花、瞿麦、当归、萹蓄、鱼腥草、车前子、王不留行等五十几味中药成分，这些中药成分不但使利尿消炎丸具有极强的杀菌作用，能够有效的杀灭各种细菌、病毒、病原体、使支原体、衣原体、淋病转阴，而且还使其具备了清热解毒、活血行气止痛和利尿通淋的功效，因此不但能够针对性地治疗支原体、衣原体感染，而且还可以同时治疗由支原体、衣原体感染引发的其他并发症。 此外中药治疗还有一个最大的优势，就是不会产生任何的副作用。但需要提醒大家的是由于中药主要是通过对患者进行全面的调理来达到治疗的效果，所以治疗时间上就会比西药长一点，因此患者在治疗时一定要有耐心，千万不可操之过急，半途而废。 以上就是对男性解脲支原体怎么检查和治疗的详细介绍，希望能够帮助到大家，祝大家早日康复。

儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较

儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较 发表时间：2016-05-09T11:40:39.230Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2016年1月第2期作者：王玉琪 [导读] 比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 王玉琪 浙江大学医学院附属儿童医院浙江杭州 310052 【摘要】目前：通过对肺炎支原体（MP）RNA检测及抗炎支原体抗体（MP-IgM）的研究，探讨两种检测方法在临床中的应用。方法：对208例肺炎住院患儿行呼吸道分泌物MP-RNA及血清MP-IgM测定，比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 【关键词】肺炎支原体；抗体检测；RNA检测 肺炎支原体是（MP）是小儿呼吸道感染常见的病原体之一，可引起上呼吸道及下呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原[1]。MP的实验室检测方法有很多，血清学检测是目前MP感染的常规实验室手段[1]，利用酶联免疫吸附试验，如检测持续高滴度MP-IgM或恢复期抗体滴度较急性期4倍或4倍以上变化可诊断。近年随着分子生物学技术的发展，RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT）技术应用于临床，为MP感染的早期诊断提供了新的检测方法。本研究对本院208例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集呼吸道分泌物及血清同时检测患儿的MP RNA及MP-IgM，现将结果报告如下。 1资料与方法 1.1 一般资料 选择2015年6月1日~2015年12月1日在本院住院的疑似MP呼吸道感染的患儿208例，其中男性106例，女性102例，年龄1个月~13岁。根据年龄分为两组，A组（0~3岁，n=128），B组（3~12岁，n=80）。两组患者的一般资料具有可比性（P<0.05）。 1.2 仪器与试剂 杭州……………… 1.3方法 采集患静脉全血，常规分离血清后检测肺炎支原体抗体（MP-IgM），同时用灭菌棉签采集受试者咽部样本（大于1岁患儿）或痰液（小于1岁）行MP RNA检测。操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。 1.4 肺炎支原体肺炎临床诊断标准：持续咳嗽，可伴有发热，白细胞计数正常或稍高，X线提示两肺均匀一致改变的片状阴影或大叶性肺炎改变。 1.5 统计学处理采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 208例患中，MP-IgM阳性率34.1%（71/208），MP RNA检测结果阳性共率31.2%（65/208），两者比较差异无统计学意义 （P>0.05）。 3 讨论 肺炎支原体（MP）是引起儿童呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎的常见病原体之一，临床表现为干咳、发热，部分患儿可出现胸腔积液、肺纤维化，肺外损害，如皮肤、胃肠道、血液系统损害、骨关节肌肉、中枢神经系统、心血管系统等[2-4]。MP感染症状可持续或迁延数周或数月，常可引起慢性咳嗽和反复呼吸道感染，还可能引起喘息。MP感染患儿临床表现常不典型，常规抗生素治疗效果欠佳，因此，早期诊断对临床治疗有着重要意义。目前，多种检测方法针对MP-IgM，具有灵敏度高，特异性强，操作简便快速的特点，已作为早期诊断MP感染的客观指标而应用于临床。本研究结果显示，208例患儿中，痰液标本或咽拭子SAT法，MP RNA阳性率34.6%，ELASA法测定MP-IgM阳性率29.3%，两者比较有统计学意义（P<0.05），这可能与血清标本留取时间有关，MP感染后约7d可在血清中检测出MP-DNA抗体，疾病早期可呈假阴性[5]。同时，在组内两种检测手段也呈现了不同结果。A组中的MP RNA的阳性率高于MP-IgM的检测 （P<0.01），这可能由于婴儿免疫系统发育不完善，当MP感染后不能产生或产生效价较低的抗体而导致漏诊，提示MP RNA方法更适于年幼儿和免疫损害患儿的MP感染的早期诊断[5]；而核酸检测受年龄影响较小，故阳性率较高。B组中，两种检测方法阳性率分别相比较无统计学意义（P>0.05），说明咽拭子MP RNA检测方法同样具有较高的敏感性，但同时需结合MP-IgM检测结果，以除外假阳性结果。综上所述，MP-IgM检测及MP RNA检测在诊断MP感染均有较高的价值，二者联合应用可提高检测的准确性，为临床诊断提供有力的依据。 参考文献： [1]Vervloet LA，Marguet C，Camargos PA．Infection byMycoplasma pneumoniae and its importance as an etiologicalagent in childhoodcommunity-acquired pneumonias[J]．Braz J Infect Dis，2007，11（5）：507—514． [2]Gaillat J，Elahault A，deBarbeyrac B，et https://www.wendangku.net/doc/0212766666.html,munity epidemiology of Chlamydiaand Mycoplasma pneumoniae in LRTI in France over 29 months[J].Eur JEpidemiol，2005，20（7）：643-651. [3]Blasi F．Atypical pathogens and respiratory tract infee—tions[J]．Eur Respir J，2004，24（1）：171—181． [4]Hansbro PM，Beagley KW，Horvat JC，et a1．Role ofatypical bacterial infection of the lung in predisposition／protection ofasthma[J]．Pharnlaeol Ther，2004，101（3）：193-210． [5] Kim NH，Lee JA，Eun BW，et a1．Comparison of poly-merase chain reaction and the indirect particle agglutinationantibody test for

PCR法支原体检测

PCR法支原体测定PROTOCOL 生效日期（年-月-日） 有效期至（年-月-日） 分发部门：质量部

1.目的 规范PCR法支原体检测的操作方法。 2.范围 适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。 3.责任 质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。 4.定义 N/A 5.设备、材料和试剂 5.1设备、材料 设备名生产商型号/货号备注PCR仪Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A 小型台式冷冻离心 机Thermo HERAEUS Fresco 21 N/A 单道移液器 (10ul,20ul,100ul) Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽Tanon HE-120 N/A 凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc? XRS+ System N/A 5.2试剂 试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq? TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产N/A

10×Loading Buffer TaKaRa 9157 DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A 内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司 6.溶液配制 6.1 50× TAE Buffer 称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml 超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。 6.2 1× TAE Buffer 量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。 7.操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR 反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。 7.1 1st PCR反应 7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系） 试剂用量（ul） 内毒素检查用水37.75~38.75 10× PCR Buffer 5 dNTP Mixture 4 MCGp F1 Primer 0.5 MCGp R1 Primer 0.5

肺炎支原体检测方法的选择

肺炎支原体检测方法选择的几个注意点 肺炎支原体（MP ），主要引起咽炎及支气管炎，少数累及肺。以其顶端结构与宿主细胞上受体结合粘附于上皮细胞上，一般为表面感染，除穿透支原体外（艾滋病人感染）大多不侵入血液。产生有毒代谢产物如外毒素或过氧化氢等引起发热及局部细胞损伤。 选择检测方法的注意事项： 1.临床常用全血（指尖血）或血清（橘黄管）检测IgM 来判定肺炎支原体的感染，但是，抗体检测只是各种实验室方法的一种，尚有其他方法可用，如培养及DNA 检测，每种方法各有利弊，对不同病程各有针对性。 2.每一种实验结果都需要另外一种实验结果来验证，正常人咽部或支气管可携带MP ，所以不能用一种实验数据来下诊断。 3.初次感染时， IgM 、IgG 都会产生，再次感染时，有时IgM 不产生。 4.儿童由于初次感染几率大，常能产生IgM ，成人由于机体可能感染过多次，常不产生IgM 。 5. 检测方法的选择需要根据病程确定： <6个月 6-12个月 1-9岁 IgM + IgM — 年龄对IgM 抗体产生的影响

抗体 抗原 MP感染不同时段产物的比较 由此图可以看出： a.感染早期，7天之内以检测抗原为主，宜培养或DNA检测： 培养为“金标准”，据国内文献显示，快速培养法阳性率为24%；PCR--DNA检测为96%。美国一篇文献显示，培养阳性率为5%，DNA为57%。 b.早期未产生抗体，导致延误治疗，后期抗体阳性，病原体消失，导致过用抗生素。 c.7天之后可检测IgM抗体； d.IgM可持续较长时间，感染后三个月抗体浓度依然较高，有的可以终生阳性，如果短时间内检测抗体，常不能分辨是否为MP现症感染或其他感染。 e.感染早期宜病原体筛查，此时抗体尚未产生，可导致延误治疗；中后期适宜抗体检测，主要用于回顾性验证试验，此时病原体消失，可导致过用抗生素。

细胞支原体污染一般情况及预防措施

细胞支原体污染一般情况及预防措施 细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。 各国细胞库支原体污染的统计表，如下： 国家受支原体污染(%) 报告年度 USA－FDA 15 1993(past 30 years) USA－ATCC 15-20 1992 Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998 Germany－DSM 36 1990-1994 Argentina 65 1987 Israel 32 1986-1993 China 95 1990 造成支原体高污染率的原因为： 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 5、研究或操作人员忽略污染问题 支原体污染了来源： 1、已受污染的细胞 2、操作人员的疏失 3、已受污染的培养基、血清 4、操作环境不良、实验器具不洁等 由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。 去除支原体污染： 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（B ayer），Enrofloxacin（Bayer） 2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 3、Anti-sera 预防与控制方面可从以下各点加强注意： 设备方面： 1、使用已作支原体测试ok之细胞株

女性泌尿生殖道解脲支原体检测及药敏分析

女性泌尿生殖道解脲支原体检测及药敏分析【摘要】目的了解解脲支原体(Uu)的感染情况及对抗菌药物的耐药性，指导临床合理用药。方法用Uu培养、鉴定和药敏一体化试剂盒，取宫颈分泌物进行检测和药敏试验。结果 258例疑为非淋菌性泌尿生殖道感染的女性患者中，共检出Uu133例，检出率为51.55％。9种抗菌药物药敏试验结果显示，Uu对强力霉素（91.73%）、交沙霉素（84.96%）、阿奇霉素（84.96%）、林可霉素（84.21%）敏感性较强，对红霉素（48.12%）、罗红霉素（27.07%）、氧氟沙星（20.30%）具有较高的耐药性。结论 Uu是非淋菌性泌尿生殖器官炎症的重要病原体，临床应重视对它的筛查，并根据药物敏感性试验结果合理选用抗生素，以达到更好的治疗效果。 【关键词】女性泌尿生殖系统疾病；解脲支原体；微生物敏感性试验 解脲支原体（Uu）是寄生在女性泌尿生殖道常见的病原体之一，常引起非淋菌性尿道炎、宫颈炎、盆腔炎等炎症，并与异位妊娠、不孕、流产等疾病密切相关。近年来，由其引起的泌尿生殖道感染呈现逐年上升的趋势。为了解本地区女性泌尿生殖道分泌物Uu的感染情况，做到早发现并指导用药，我们对258例女性患者的泌尿生殖道分泌物标本进行支原体培养和药敏试验，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 标本来源 2006年7月～2007年3月在我院妇产科就诊疑为非淋菌性泌

尿生殖道感染的女性患者，年龄20～52岁，平均33岁。均采用无菌拭子取宫颈分泌物，且取材前1周内均未使用过抗生素。 1.2 试剂 采用Uu培养、鉴定和药敏一体化试剂盒，由上海奥普生物医药有限公司提供。 1.3 方法 操作方法、结果判断均严格按照试剂说明书进行。 2 结果 2.1 258例样本中检出Uu 133例，检出率为51.55％。其中单一Uu感染102例，占39.53%；单一人型支原体(Mh)感染7例，占2.71%；Uu+Mh混合感染24例，占9.30％。 2.2 药物敏感试验结果 133例支原体感染患者对9种抗生素的药敏试验结果表明，Uu对强力霉素、交沙霉素、阿奇霉素、林可霉素敏感性较强，敏感率>80%；对红霉素、罗红霉素、氧氟沙星耐药性较高，见表1 。 表1 Uu对9种抗生素的药敏试验结果（略） 3 讨论 Uu是一类菌体大小介于细菌与病毒之间的微生物，它寄居于人体泌尿生殖道。近年来非淋菌性泌尿生殖器官炎症的发病率逐年上升，已占性传播疾病的第三位，这其中有20%～30％是由Uu感染引起的［1］。Uu可引起女性尿道炎、阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎和盆腔炎，孕妇被它感染了可引起自然流产、不孕症，甚至早产、死胎。进行泌尿生殖道分泌物的支原体培养、鉴定、药敏一体化检查，

支原体污染的特点及体检

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。 支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(P H7.6—8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后。培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢。甚至从培养器皿脱落。 为确定有无支原体污染可做如下检酗： ①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。 ②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗。置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 ③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速。也可以利用透射电镜。 ④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高。但方法较为复杂 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变

肺炎支原体两种检测方法的比对分析

肺炎支原体两种检测方法的比对分析 目的：探讨肺炎支原体（MP）咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）两种检测方法的不同。方法：将198例疑似MP感染的患儿根据年龄分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123），分别取咽拭子用PCR法测MP-DNA，取血清用IIFA法测MP-IgM，比较两种方法的阳性率。结果：MP-DNA检测阳性率为57.07%，MP-IgM检测阳性率为47.47%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。A组MP-DNA阳性率48.00%明显高于同组MP-IgM阳性率25.33%，差异有统计学意义（P＜0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率分别为62.60%、60.98%比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PCR与IIFA联合检测可以提高MP感染诊断的准确性。 标签：肺炎支原体；聚合酶链反应；间接免疫荧光法；肺炎支原体抗体 肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，主要通过呼吸道传染，临床表现多种多样，以呼吸道感染最为多见，并可引起全身各脏器损害[1]。MP的实验室检测方法有很多，近年来发展的咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）法均具有快速、敏感性高的优点[2]。为了客观评价这两种方法的异同，本研究对198例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集咽拭子和血清同时用咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）检测MP，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选取本院儿科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患儿198例，年龄0～12岁，根据年龄将其分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123）。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 仪器与试剂杭州博日line gene PCR扩增仪，ZEISS型荧光显微镜。PCR 法试剂盒由凯杰生物工程有限公司生产提供；IIFA法检测试剂盒由西班牙VIRCELL公司生产提供。 1.3 方法用灭菌棉签采集受试者咽部样本用PCR法检测MP-DNA，同时采集患儿静脉全血，常规分离血清后用IIFA 法检测MP-IgM。操作方法均严格按照说明书进行。 1.4 小儿肺炎支原体肺炎临床诊断标准持续剧烈咳嗽；全身症状比胸部体征明显；X射线所见较体征显著，胸片可见两肺均匀一致的片状阴影成似大叶性肺炎改变，肺门阴影增浓；白细胞计数正常或稍高，血沉多增快；应用大环内酯类效果好，其他抗生素如青霉素、头孢无效[3-4]。 1.5 统计学处理

肺炎支原体及其快速培养法概要

肺炎支原体及其快速培养法 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它既不同于细菌，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、nbsp;动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。 作者：罗三艳作者单位：412001 湖南株洲，株洲田心医院检验科支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，它既不同于细菌，也不同于病毒，是介于细菌和病毒之间，能在无活细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物。它广泛分布于自然界，与人类、动植物的疾病有密切的关系。支原体的种类繁多，造成的危害非常广泛。目前证明对人体有致病作用的支原体有肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体等几种，但临床以肺炎支原体最为常见［1］。肺炎支原体主要以飞沫传播，引起儿童、青少年呼吸道感染、咽炎、气管炎、肺炎等。近年肺炎支原体感染病例明显增多并有局部流行的趋势，早期诊断极为重要。 1 肺炎支原体的实验室检测方法目前，肺炎支原体的实验室检测方法有支原体分离培养、 PCR法检测质粒核酸、抗体检测、支原体快速培养法、分子生物学方法等。支原体细胞分离培养可获得肺炎支原体，可以确诊。由于支原体分离培养要求苛刻，一般医院实验室难以推广。此法阳性率低，需时3 周甚至更长时间，对临床快速诊断意义不大。PCR法检测质粒核酸快速、特异、敏感，但需昂贵设备，不易普及，且方法过于敏感，容易受污染。传统的冷凝集法检测肺炎支原体的IgM 抗体，方法简单、易行，但其敏感性和特异性均较差，易受病程影响。ELISA 检测支原体抗体法较为简便、可靠。由于发病初期，机体中尚未产生抗体不能被检出，发病时间较长此法才有意义。而快速培养法正以其简单、快速、经济、无创伤等优点，被越来越多的临床实验室所推广，也被越来越多的患者所接受。 2 肺炎支原体快速培养法肺炎支原体快速培养法是利用肺炎支原体的代谢产物使培养基液体中的指示剂颜色发生改变来判断其生长，标本中的其他支原体和细菌则被培养基中的青霉素和醋酸陀抑制［2］。此法操作简便、快速、无痛苦。先从冰箱中取出快速培养基，复温，按常规方法采集患者咽拭标本，将标本棉签浸入培养液，沿瓶壁挤压棉签，取出棉签、丢弃。旋紧瓶盖，登记标本号，35℃～37℃孵育24～ 48h，观察结果。培养基由红色变为绿色、黄色，且仍保持清晰透明，说明有肺炎支原体生长，明显混浊变色者不能视为阳性。培养液颜色不变，应判为无肺炎支原体生长。我院检验科是从2007年4月份开始展开此项检测，共检测293 例疑似肺炎支原体感染病例，阳性病例161 例，阳性率54.9%，及早为临床诊断、治疗肺炎支原体感染提供了依据。 3 讨论近年来，肺炎支原体感染明显上升，危害较大，其临床表现常无特异性，易与一般病毒性感冒相混淆。临床医生为了尽快缓解患者的症状，需根据患者症状、体征及肺炎支原体的相关检测，及早诊断、治疗。快速培养法不受病程影响，感染初期就可检测出肺炎支原体。有资料报道，在肺炎支原体检测的各种方法中，该法阳性病例病程最短，提示病程时间较短的患者选择此法检测的阳性率较高。快速培养法是诊断肺炎支原体的金标准 ［2］。肺炎支原体快速培养法采咽拭标本，采集标本前，用生理盐水漱口。所采集的标本应迅速接种，若不能及时接种，室温保存不超过2h。使用

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍 （2016年10月16日） 哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。 目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有： 一、培养法 ●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转 接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体 培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。 ●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可 的方法之一。 ●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支 原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最 常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无 法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞 支原体污染的20-50%。 ●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中 收录的培养法支原体检测方法进行操作。 二、荧光染色法 ●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培 养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色， 如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料 染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。 ●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。 ●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污 染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细

支原体检测

支原体检验法 1 培养基 1.1 检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey 氏培养基。 1.2 检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基 1.3 检验血清用无血清的支原体培养基 2 检查法 2.1 样品处理每批制品取样3-5瓶，液体制品混合后备用；冻干制品加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。 2.2 疫苗的检测 2.2.1 接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测 2.2.2.1 液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。 2.2.2.2 琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的

环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。 2.2.2 对照每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 2.3 血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定 3.1 接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。 3.2 阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。 附注：上述小瓶培养基是指在100ml小瓶中盛20ml液体培养基；小管培养基是指在1.0cm*10cm中盛1.8ml培养基。小管与小瓶须用胶塞封口。