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禽传染性支气管炎病毒 S1 基因植物表达载体的构建

浙江大学学报(农业与生命科学版)　27(3):

293～296,2001

Journa l of Zheji a ng Un i versity (A gric

.&L ife Sci .) 收稿日期:2000212215

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070570)

作者简介:吴建祥(1968-),男,浙江诸暨人,硕士,讲师,主要从事免疫学和分子生物学研究Λ

文章编号:100829209(2001)0320293204

禽传染性支气管炎病毒S 1基因植物表达载体的构建

吴建祥,周继勇,程丽琴,沈行燕,丁红梅

(浙江大学动物预防医学研究所,浙江杭州310029)

摘　要:以含传染性支气管炎病毒(ZJ 971毒株)S 1基因的质粒PBS 为模板,根据其序列设计引物进行

PCR 扩增,得到1.7kb 左右的S 1基因产物;用XbalI 和BamH I 酶切纯化,并在T 4DNA 连接酶的作用

下,定向克隆到植物表达载体PB I 121中,PCR 及酶切鉴定表明,质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中Λ关　键　词:禽传染性支气管炎病毒;S 1基因;植物表达载体中图分类号:S 858.3;Q 782 文献标识码:A

W U J ian 2x iang ,ZHOU J i 2yong ,CH EN G L i 2qin ,SH EN X ing 2yan ,D I N G Hong 2m ei (Institu te of P reven 2tive V eterinary M ed icine ,Z hej iang U niversity ,H ang zhou 310029,Ch ina )

The con structi on of plan t expressi on vector of S 1gene of av i a n i n fecti ous branch itis v i rus .Journal of Zhejiang U n iversity (A gric

.&L ife Sci .),2001,27(3):293～296Abstract :T he S 1gene of avian infecti ous bronch itis virus (ZJ 971strain )w as amp lified by po lym erase chain reacti on w ith s pecial p ri m ers con tain ing XbalI and BamH I .T he purified PCR p roduct w as digested by the restricted enzym e XbalI and BamH I

.T he digested and purified S 1gene of infecti ous bronch itis virus w as cl oned in to p lan t exp ressi on vecto r pB I 121.T he result show s that pB I 121w ith S 1gene w as success 2fully tran sferred in to A g robacterium tum e f aciens (A otum ef aciens )w ith m ethods of PCR and restricted en 2zym es

.Key words :avian infecti ous bronch itis virus ;S 1gene ;p lan t exp ressi on vecto r

禽传染性支气管炎病毒(A vian Infecti ous

B ranch itis V irus ,I B V )属冠状病毒科冠状病毒属,因I B V 抗原性的漂变可引起呼吸型、肾型、腺胃型、肌肉型等不同病变类型的鸡传染性支气管炎,对养禽业危害极大,是最重要的传染病之一[1]Λ该病毒属单股正链RNA 病毒,具有S 、M 和N 三种结构蛋白ΛS 蛋白是由S 1和S 2组

成的寡聚蛋白,S 1和S 2均为糖蛋白多肽,其分子量分别为90kD 和84kD ,用酶去除寡糖后

S 1和S 2的分子量分别为64kD 和61kD [2,3]

ΛCavanagh

[4]

确证S 1蛋白是宿主的主要保护性

抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,继而使机体得到保护,在免疫学方面起着重要作用的S 1基因一直是世界各国研究该病毒的热点Λ自20世纪90年代以来,国内外对I B V 的研究取得了长足进展,已有关于I B V S 1基因在昆虫杆状病毒、痘苗病毒等载体中进行表达的报道[5,6],但尚无在植物中表达的报道Λ为探讨植物表达家禽病毒基因的可能性,我们利用

已获得的禽传染性支气管炎病毒S1基因成功地构建了植物表达载体系统Λ

1　材料与方法

1.1　菌种及质粒

大肠杆菌DH5Α,根癌农杆菌EHA105,植物表达载体PB I121,含辅助质粒PBK2013的HB101和含I B V S1基因的PBS质粒取自本所[7]Λ

1.2　酶及试剂

所有酶均购自P rom ega公司,PCR纯化K it和割胶回收K it均为德国Q I A GEN公司产品,所有抗生素均为国产分析纯试剂Λ

1.3　PCR引物设计与合成

参照已发表的I B V2ZJ971株基因组序列设计[7],并作适当改进:为了便于与PB I121质粒的多克隆位点相连接,在引物5’端引入XbalI酶切位点,在引物3’引入Ba mH I酶切位点ΛPCR引物由上海生物工程公司合成Λ引物的具体序列如下:

5’端引物为52GCTCTA GAA T2 GT T GGTAA CA CCTCT T23’

3’端引物为5’2CGGGA TCCT TAA2 TAA CTAA CA TAA GGGCA23’

1.4　PCR扩增的禽传染性支气管炎病毒S1基因

在PCR反应管中依次加入下列试剂10×T aq P lus I PCR buffer10ΛL,25mmo l L M gC l26ΛL,10mmo l L d N T P混合物2ΛL, 20Λmo l L5’、3’端引物各1ΛL,含S1基因的pBS质粒1ΛL,灭菌M illi Q水78.5ΛL,T aq P lusI(5u ΛL)0.5ΛL,混匀后在表面加入2滴液体石腊Λ然后在PCR仪上94℃预变性2 m in,94℃45s,53℃45s,72℃2m in,共计30个循环进行扩增,最后一个循环后,72℃延伸10m inΛ

1.5　禽传染性支气管炎病毒S1基因植物重组表达载体的构建与鉴定

用PCR产物纯化K it纯化PCR产物Λ纯化的I B V S1基因PCR产物用XbalI和Ba mH I 在37℃酶切2h;pB I121质粒用XbalI和Ba mH I在37℃酶切5hΛ酶切产物用Q I A GEN 公司的Gel Ex tracti on K it割胶回收Λ两种酶切产物在16℃条件下用T4DNA L igase连接过夜Λ连接产物全部转化DH5Α感受态细胞,在含卡那霉素50Λg mL的LB固体培养基上挑取单菌落接种,碱法提取重组质粒,用PCR、XbalI 和Ba mH I双酶切来鉴定重组质粒(图1)

图1　S1基因植物表达载体的构建

F ig.1　The constructi on of p lant exp ressi on

vecter of S1gene

1.6　禽传染性支气管炎病毒S1基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌

受体农杆菌EHA105于液体YEP培养基中28℃振摇培养,将含帮助质粒pR K2013的菌株HB101和含目的质粒的菌株DH5Α接种于LB培养基上,37℃振摇培养Λ三种菌长到对数生长期时等体积混合,离心弃上清.50ΛL LB 悬浮,涂布于LB固体平板上培养过夜;用少量培养基洗下菌落,以适当倍比稀释后,涂布于含R if、Km和Sm的LB固体平板上培养,24h后长出的菌落按常规的碱法提取质粒,进行PCR 鉴定(图2)Λ

492 浙江大学学报(农业与生命科学版)　第27卷　

图2　三亲交配示意图

F ig .2　T ri parental m ating

2　结　果

2.1　传染性支气管炎病毒S 1基因的PCR 产

物鉴定

PCR 扩增后,取10ΛL 产物经1%琼脂糖电泳,可观察到一条约1.7kb 的片段,与预期的S 1基因大小一致(图3)

3,8,12,19为重组质粒,CK 为非重组质粒(PB I121质

粒),S1为S1基因PCR 扩增产物;M 为1kb 的DNA

M arker

图3　S 1基因扩增及植物重组质粒Xba l I 和

Bam H I 酶切鉴定结果

F ig .3　Amp lificati on of I BV Sigene and digesti on identi 2

ficati on of recom binant p las m id w ith Xba and Ba mH I

2.2　传染性支气管炎病毒S 1基因植物重组表

达载体的构建和鉴定

将酶切纯化的PCR 产物经Xba 和Ba mH I 进行双酶切后定向插入到经相同酶切过的PB I 121载体上,构建成含S 1基因的中间载体Λ在含Km (50Λg mL )的培养基上筛选重组子,经PCR 和双酶切后的电泳分析表明,植物中间表达载体中确实插入了1.7kb 左右的S 1基因(图3,4)

3、7、8、12、19为重组质粒,M 为1kb 的DNA M arker ,CK 为非重组质粒PB I 121质粒

图4　重组质粒S 1基因PCR 扩增产物

F ig .4　PCR p roduct of S 1gene of recom binant p las m id

3、7、8、12、19为转化子;1为S1基因;M 为1kb DNA M arker

图5　转化子的PCR 鉴定

F ig .5　Identificati on of transfor m ant by PCR

2.3　根癌农杆菌的转化与鉴定

以pR K 2013为辅助质粒,通过三亲交配的方式转化农杆菌Λ在R if (100Λg mL )的LB 培养基上筛选转化子,挑取20个单菌落接种,用

92　第3期　吴建祥,等禽传染性支气管炎病毒S 1基因植物表达载体的构建

碱法抽提质粒,并以该质粒为模板,以S1基因的特异引物进行PCR扩增Λ结果表明:大多数转化子1,3,7,8,12,19均能扩增出与S1基因大小相同的1.7kb片段(图5)Λ

3　讨　论

20世纪80年代以来,植物转基因工程在植物改良上取得了许多成就(如抗病水稻,抗虫棉等)[8,9],在生物医药方面作为生物反应器,也有巨大的潜在优势Λ1992年,M as on等[10]就乙肝表面抗原在转基因植株中表达一文中,提出了用转基因植物生产疫苗的概念ΛT ubo ly等在转基因烟草中表达了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因并研究了其表达产物的免疫原性[11]Λ与常规疫苗及其他新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,是目前世界各国新型疫苗研究的热点之一Λ我们利用禽传染性支气管炎病毒的S1基因成功构建了植物表达载体,并转化了根癌农杆菌,为进一步分析转基因马铃薯所表达的I B V S1基因产物的免疫原性及禽传染性支气管炎植物疫苗的研究打下了基础Λ虽然转基因植物疫苗存在外源蛋白的免疫原性、表达水平低及糖基化等问题,但用植物生产外源蛋白质则是安全廉价的生产系统,很有吸引力Λ

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692 浙江大学学报(农业与生命科学版)　第27卷　

植物病毒载体

植物病毒载体的类型及应用摘要：植物病毒载体可分为5种类型，烟草花叶病毒载体是最常用植物病毒载体。植物病毒载体应用广泛，有诸多优点，也存在一些问题。本文对植物病毒载体进行综述。关键词：植物病毒载体；类型；烟草花叶病毒载体；应用 The Types and Application of Plant Virus Vectors Abstract: Plant virus vectors can be divided into five types. Tobacco Mosaic Virus vector is the most commonly used plant virus vector. Plant viral vectors are widely used. They have many advantages，as well as some problems. This article provides an overview of plant virus vectors. Key words: plant virus vectors; type; Tobacco Mosaic Virus vector;application DNA 体外重组是基因工程技术的重要步骤之一，它是将外源目的基因与适当的载体相连。要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(V ector)。载体有很多种，病毒载体是其中的一种。病毒载体是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具[1]。植物病毒载体的研究开展得较晚，1984 年才诞生了第一例由植物DNA病毒——花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)构建的载体。但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白的需求。因此，1984年之后，人们尝试了多种植物病毒载体构建方法。目前已经构建了多种类型的植物病毒载体，已有用植物病毒载体pClYVV 表达了绿色荧光蛋白基因[2]、Nodulin gene基因、人的α-干扰素基因及小球状病毒抗原蛋白基因等的报告[3]。近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。一植物病毒载体的类型植物病毒载体可分为置换型载体、插入型载体、互补型载体、抗原展示型载体和融合/释放型载体5 种。 1置换型载体置换型载体是最原始的载体类型，由外源基因置换对植物病毒基因组复制影响不大的基因构建而成，一般用于转染原生质体进行瞬时表达以验证构建载体的可行性，较少接种于植株来系统地表达外源基因。CaMV 首先被用于构建置换型载体的研究。用外源基因置换CaMV 的基因Ⅱ(蚜传因子)后不影响其侵染性，成功地表达了细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)和人α-D 干扰素基因[4]，IFN-αD 的表达量可达到2μg/g(鲜叶)。 DEC 2012

鸡肾型传染性支气管炎的防治措施

鸡肾型传染性支气管炎的防治措施鸡肾型传染性支气管炎的防治措施核心提示：鸡传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，有囊膜，单股正链病毒，病毒粒子形态为多形性，但大多数为球形，直径约为80～120纳米，囊膜表面呈松散、均匀排列的冠状纤突，状如皇冠，其纤突不如副粘病毒的棒状纤突排列紧密，有的毒株离心力超过100000克时纤突会丢失。传染性支气管炎病毒能在10～11日龄的鸡胚中生长，用自然毒初次接种鸡胚，多数鸡胚存活，但随继代次数的增加，对鸡胚的毒力增强，到第10代时，可在接种后的第9天引起80%的鸡胚死亡。肾型传染性支气管炎是鸡传染性支气管炎的一种病理表现形式。我国于1972年由邝荣禄首次报道在广东省有传染性支气管炎存在，随后绝大多数省份都有该病发生的报道，在此期间发生的传染性支气管炎也主要为呼吸型。1962

年等在美国发现了致肾病变型传染性支气管炎病毒,并将其命名为株,该型的代表毒株有株、株、56b株、株等,其中株是缓和型毒株。同年在澳大利亚分离出N1/62(T株),该病毒被认为是嗜肾型传染性支气管炎病毒的代表株。20世纪90年代以来，肾型传染性支气管炎在国内也相继爆发，流行十分广泛。尤其是最近几年，肾型传染性支气管炎在我国肉鸡群中大面积流行，给养鸡生产带来了严重的损失。一、病原鸡传染性支气管炎病毒( ，)属于冠状病毒科冠状病毒属，有囊膜，单股正链病毒，病毒粒子形态为多形性，但大多数为球形，直径约为80～120纳米，囊膜表面呈松散、均匀排列的冠状纤突，状如皇冠，其纤突不如副粘病毒的棒状纤突排列紧密，有的毒株离心力超过100000克时纤突会丢失。传染性支气管炎病毒能在10～11日龄的鸡胚中生长，用自然毒初次接种鸡胚，多数鸡胚存活，但随继代次数的增加，对鸡胚的毒力增强，到第10代时，可在接种后的第9天引起80%的鸡胚死亡。胚体的特征性变化是发育受阻，胚体卷成球形，脚变形压在头部，羊膜增厚，紧贴胚体，卵黄囊缩小，尿囊液增多，肾脏尿酸盐沉积。传染性支气管炎病毒也能在15～18日龄的鸡胚肾细胞()、鸡肾细胞()和鸡胚肝细胞()上生长，经多次传代(6～10代)后，可引起较明显的细胞病变，表现为胞浆融合，形成合胞体及细胞死亡。病毒经

高级植物病毒学

高级植物病毒学第一讲 1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别： ⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuous bilayer membrane）与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virus particle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别： ①大小: 一些痘病毒（pox virus）比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellular parasite）如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到

鸡传染性支气管炎病毒的研究进展

鸡传染性支气管炎病毒的研究进展鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染病，它主要侵害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。本病呈世界性分布，对养鸡业的危害极大，它能使成鸡的增重和饲料报酬降低，鸡蛋的产量、质量和孵化率下降，并直接导致雏鸡死亡、肾脏病变和输卵管永久性退化；另外，IB还经常做为病因之一参与混合感染，例如诱发慢性呼吸道病(CRD)的爆发，近年来，该病的流行呈上升趋势，尤其肾病变型IB 已蔓延至全国各养鸡地区，造成了严重的经济损失。本病最早由美国Schalk和Hawn报道，临床以患鸡咳嗽、喷嚏和气管哕音的呼吸道症状为主，之后陆续在世界各国发生，1936年Beach和Schalm确定病原为病毒(呼吸型IBV)，后命名为鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)，归入冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。 1972年邝荣禄等首次在广东证实我国也有该病发生。传染性支气管炎病毒血清型较多，常见的有Massachussetts、Connecticat、lowa97、Iowa609、Hotle、JMK、Clark333、SEl7、Florida、Arkanass99和Australian“T”。1962年Wintefield等首次报道了肾型IBV，可引起肾脏肿大、尿酸盐沉积等症状。1986年E1 Houadfi等在摩洛哥首次分离到以G株为代表的嗜肠型IBV，主要引起呼吸道、肾脏及肠道病变。Gough等首先报道了英国存在一种新的特殊IBV血清型793/B，而来自西班牙、德国、希腊和墨西哥可疑血清样本中亦可发现抗此血清型IBV的特异性抗体，法国、荷兰、意大利、泰国等均有此血清型IBV的存在。 IBV基因组核酸RNA复制的不连续机制及RNA聚合酶的不完全校对机制，使得病毒RNA在复制过程中易发生基因点突变、插入、缺失或重组，造成大量IBV变异株的出现，目前世界上已分离到的IB血清型已达30种之多，不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用，IB的多血清型性为其免疫预防增加了难度。 1 IBV的基因组鸡传染性支气管炎病毒是正链单股RNA病毒，直径为90～200nm，是所有RNA病毒中最大的，蔗糖浮密度值常在1.15～1.18g/ml范围内，病毒有囊膜，表面有间距较宽、呈放射性排列的杆状纤突，长约20nm，使病毒外观近似皇冠，纤突不稳定，易从病毒粒子上脱落，当离心力超过100000r/min，甚至有时在37℃孵育，都会导致某些纤突成分的丢失，IBV 是第一个测定了基因组全部序列的冠状病毒，长27～30kh，有感染性，5′末端为“帽子”结构，3′末端含有共价结合的poly(A)尾，至少有10个明显的开放阅读框架(ORF)，编码分子量6.7～440kDa蛋白，病毒RNA各基因的定位次序如下： 5’-F1-F2-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N poly(A)-3′。Boursnell等完成了对IBV-Beaudene株全基因组的测序，共有27608个核苷酸组成，不同IBV毒株的基因组长度略有差异。lBV被分为6个区域，由小到大分别被命名为MrnaA～F。 IBV含三种最主要特异性蛋白：纤突蛋白(Spike Glycoprotein，SGP，即S蛋白)、膜蛋白(Membrane Glycoprotein，MGP，即M蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，NP，即N蛋白)，分别由mRNA E、C、A编码，三种结构蛋白的摩尔比为1:6:15，第四种小膜蛋白(sM)与病毒囊膜有关。病毒的血清型、血凝抑制和大多数的中和抗体均由S1蛋白决定和诱导。 2 IBV的主要结构蛋白及功能 2.1纤突蛋白(S) S蛋白由mRNA B编码，位于病毒粒子最表层的囊膜上,是构成病毒纤突的主要成分，是由2～3个相同的单体非共价连接构成的聚合物。S蛋白包含两种糖多肽S1和

植物病毒分子检测方法概述

植物病毒分子检测方法概述邵碧英 (福建出入境检验检疫局　福州　350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1　以病毒外壳蛋白为基础的检测方法植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111　酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112　斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113　直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114　电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —

植物抗病基因研究进展

植物抗病基因研究进展摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景一、植物抗病基因工程原理植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在

传染性支气管炎

传染性支气管炎疾病概述：传染性支气管炎是由冠状病毒引起的鸡的急性、高度接触性传染病。临床上分为呼吸道型和肾病理变化型两种类型。病原病毒能在发育的鸡胚中生长良好，也能在气管器官组织培养中增殖。病毒经56℃15分钟或45℃90分钟即被灭活，对乙醚敏感，50％氯仿室温下作用10分钟、0.1％去氧胆酸钠4℃作用18小时能使病毒完全失去感染性。病毒对常见消毒剂敏感，0.05％或0.1％的β戊酮内酯(BPL)或0.1％福尔马林均可使其失活。流行病学：自然感染仅见于鸡、雉鸡，各种年龄的鸡均可感染，但以雏鸡发病最严重。传染源主要是病鸡和康复后带毒鸡，病鸡康复后可带毒49天。病毒主要存在于呼吸道渗出物中，也可在肾和法氏囊中增殖。传播途径通过飞沫经呼吸道传播，也可经污染的饮水、饲料和垫料传播。本病传播迅速，一旦感染几乎全群发病。一年四季都可发生，但以气候寒冷的季节较为严重。临床症状：人工感染的潜伏期为18～36小时，自然感染的潜伏期长，有母源抗体的幼雏潜伏期可达6天以上。雏鸡突然出现呼吸症状并很快波及全群，病鸡表现为气喘、咳嗽、打喷嚏、气管鸣音和流鼻涕，精神沉郁、畏寒、食欲减少、羽毛松乱、打堆，个别鸡鼻窦肿胀、流泪。6周龄以上的鸡症状不明显，主要是气管鸣音、喘气和轻微咳嗽等。蛋鸡产蛋量下降，并产软壳蛋、畸形蛋或粗壳蛋，蛋白稀薄如水样，蛋黄与蛋白分离以及蛋白粘壳等。肾病理变化型传染性支气管炎是目前发生多、流行范围较广的疾病，20～30日龄是其高发阶段。病初，病鸡表现怕冷、喷嚏和咳嗽，有的张口喘气及气管鸣音，2～3天后出明显的全身症状，表现为厌食、拱背、饮水量增大，拉白色水样粪便，粪便中含有大量尿酸盐。病鸡失水，肌

禽传染性支气管炎

有关鸡传染性支气管炎的病疾病概述：鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是一种对鸡危害严重的急性、高度接触性传染病,临床症状与Ⅰ群和Ⅱ群人的冠状病毒引起的症状相似,在我国大部分地区都有流行。本病是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiouss bronchitis virus,IBV)引起的,主要侵害呼吸道、肠道和泌尿生殖道,某些毒株可引起肾脏和肠道疾病。所有日龄的鸡历史及分布： 1930年在美国北达科他州首先发现了鸡传染性支气管炎。次年Schalk和Hawn，对该病的临床症状和初步实验研究结果作了报道。此后，加拿大、英国、意大利、澳大利亚、日本、比利时、印度等都有相关报道。 1936年Beach和Schalm确定了该病的病原，1937年Reaudette和Hudson首次在鸡胚上成功培养该病毒。 1962年Winterfield和Hitchner报道了肾病变型IB。早期报道的IB主要是幼鸡的疾病，但后来发现此病也存在于育成鸡和产蛋鸡群中。我国于1972年由邝荣禄教授在广东首先发现IB的存在。此后北京、上海相继有报道，现已在我国大部分地区蔓延。 1996年以来，又见有腺胃型传染性支气管炎的报病原：传染性支气管炎病毒属冠状病毒科冠状病毒属。本病毒对环境抵抗力不强，对普通消毒药过敏，对低温有一定的抵抗力。传染性支气管炎病毒具有很强的变异性，目前世界上已分离出30多个血清型。在这些毒株中多数能使气管产生特异性病变，但也有些毒株能引起肾脏病变和生殖道病变。本病主要通过空气传播，也可以通过饲料、饮水、垫料等传播。饲养密度过大、多热、过冷、同分不良等可诱发本病。1日龄雏鸡感染时刻使输卵管发生永久性的损伤，使其不能达到应有的产量。流行病学： 1.传染源：病鸡和带毒鸡是主要传染源。感染后的病鸡主要通过呼吸道和泄殖腔等途径向外界排毒，为该病主要的传染源。病鸡康复后可带毒49d，在35d内具有传染性。 2.传播途径：主要通过呼吸道和消化道传播。受污染的飞沫、尘埃、饮水、饲料、垫料等则是最常见的传播媒介。 3.易感性：鸡是IBV的自然宿主，但不同品种和品系的鸡群对IBV的敏感性不同。各种龄期的鸡均易感，其中,(1)呼吸型IB 以雏鸡和蛋鸡产蛋高峰发病较多；(2)肾型IB 多发生于10～50日龄的幼鸡；(3)腺胃型IB 多发生于30～80日龄的鸡) 流行特点：本病一年四季均流行，但以冬春寒冷季节较严重。本病属于高度接触性传染病，在鸡群中传播速度快，2周内可波及全场。发病率和死亡率与毒株的毒力和环境因素(如气温、通风、饲养密度、健康状况、日粮配合、应激等)有很大关系诱病因素：过冷、过热、拥挤、通风不良、维生素缺乏及疫苗接种会促进病的发生。

浅析鸡传染性支气管炎、喉气管炎与禽流感的鉴别诊断要点

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/0713068292.html, 浅析鸡传染性支气管炎、喉气管炎与禽流感的鉴别诊断要点作者：乔保磊来源：《农家科技下旬刊》2017年第12期摘要：鸡传染性支气管炎、喉气管炎和禽流感都是危害养鸡业发展的重要疫病，临床上极易出现错判误断，贻误病情，分析区别三种疫病临床症状、发病原因、流行特点、剖检变化等诊断要点，准确判别出鸡群所患的疫病，及时采取有效措施，防治疫病发生和流行。关键词：支气管炎；喉气管炎；禽流感；鉴别；诊断进入21世纪以来，养鸡业迅速发展，规模场不断增加，已经成为主要的养殖模式；同时养鸡业的快速发展丰富了人们的“菜篮子”，提高了人们的生活水平。养鸡业现已成为促进农业发展、增加农民收入的主要产业，很多贫困户依靠养鸡已经脱贫致富。然而，在养鸡生产中，疫病仍然是阻碍发展的最大“天敌”，很多疫病对养鸡业威胁很大，给养殖场户造成巨大损失。我们常见的鸡传染性支气管炎、喉气管炎、禽流感在整个养殖生产中是发病率、死亡率、危害率较高的疫病，可以说98%以上的养殖场都发生过这几种病，由于这几种病在流行特点、临床症状、发病规律、病理变化等方面极为相似，临床上容易出现误诊误判，以至于造成防治失败，给养殖场造成损失。分析区别鸡传染性支气管炎、喉气管炎、禽流感的诊断要点，准确判断鸡群发生的疫病，有针对性地开展防治工作。笔者根据多年的积累，总结出三种疫病的鉴别要点，供大家在今后的养殖生产中借鉴。一、流行特点 1.发病季节性。三种疫病的发病季节没有明显差异，都是秋末、冬季和早春季节多发，但是禽流感在春季的发病率高于传染性支气管炎、传染性喉气管炎，而传染性支气管炎、喉气管炎在冬季的发病率高于禽流感。 2.饲养条件不良。鸡群拥挤、通风不畅、阴雨潮湿、贼风侵袭、饲养管理不善、缺乏维生素、营养不良、寄生虫感染等因素能够引发三种疫病发生流行，这些因素可用来区别于其他疫病。 3.易感性。传染性支气管炎感染鸡，5周龄以内的鸡感染后症状明显，没有品种差异。传染性喉气管炎主要侵害鸡，各种年龄及品种的鸡均可感染。但以成年鸡症状最为特征。

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这 6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。关键词: Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的

植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)

一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti

（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。

1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中 T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。

鸡传染性支气管炎的预防和控制

鸡传染性支气管炎的预防和控制 “三百六十行，行行出状元!”养鸡也不例外，有许多普通老百姓就通过养鸡成为当地小有名气的人物。那么，这其中的奥秘又是什么呢？说它容易，只要你掌握了科学的方法就能达到目的；说它难，是因为有许许多多的鸡病威胁着养鸡场，时时刻刻都有赔个底儿朝天的风险。在我国每年都有养鸡场因为管理不善或防疫不到位而损失惨重。所以，养鸡的朋友不仅要学会科学的“养鸡”，更要懂得有效的“防病”，把病防住了，养鸡的风险就小了，致富路上也顺畅。今天就介绍一种对养鸡业危害较大的疾病“鸡传染性支气管炎”的防治方法。鸡传染性支气管炎（IB），我们简称为“鸡传支”，该病是由冠状病毒引起的，发生在鸡身上的一种传染病，这种病传染性强、传播速度快，危害大，如果鸡群遭到感染，容易导致发病，发病后幼鸡死亡率可高达30%，产蛋鸡产蛋下降高达50%，甚至丧失产蛋能力。目前，鸡传染性支气管炎有很多种变异型，以呼吸型、肾型和腺胃型为主，在我国流行的主要是肾型。那么，鸡传染性支气管炎到底是怎么流行的呢？我们用“流行病学”这个专业术语来描述，下面我们就来说说鸡传染性支气管炎的流行病学特征。流行病学特征通常，鸡传染性支气管炎只发生在鸡身上，不论是大鸡还是小鸡，都能够感染该病，其中小鸡是最容易感染的群体。小鸡感染后，3周龄以下没有症状，到了3-6周龄是发病率较高的时候，这段时期的小鸡常常会引起死亡，死亡率高达30%，6周龄以上的鸡感染后很少死亡。感染鸡和发病鸡通过以下几种方式传播病毒： 1.通过呼吸、打喷嚏、咳嗽等方式将病毒排出体外 2.通过粪便排出病毒 3.通过嘴巴污染食槽或水槽无论通过哪一种方式都会污染环境，当健康鸡接触后，都可导致感染，另外如果饲养员串岗或不慎将污染的饲喂工具带到干净的鸡舍，也可造成该病的间接传染。一般感染鸡通过呼吸道排毒时间为两周左右，通过粪便排毒时间长达3周以上；产蛋鸡如果短时间内发病，产的蛋内也含有大量的病毒。发病鸡经过治疗康复后，仍然可持续的排出病毒，排毒时间长达50天左右。鸡传染性支气管炎发生不分季节，在一年内任何时间都可能发生。如果饲养管理不善，当鸡舍内过冷、过热、饲养密度大、矿物质维生素缺乏时，均能促进这种病的发生。以上就是鸡传染性支气管炎的流行病学特征，在日常养殖中又该如何诊断该病呢？

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2增强翻译效率为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2优化起始密码周边序列虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称

基因工程应用——抗病毒

讨论为什么植物转入病毒外壳蛋白（coat protein, CP）基因或病毒复制酶基因就具备抗病性，本人开始也没想明白，后来请在大学的同学帮忙才查到，欢迎大家补充！（1）病毒外壳蛋白（coat protein, CP）基因：在植物中表达病毒外壳蛋白基因可以阻止病毒的侵染或症状的产生。病毒外壳蛋白的抗性机理：一种假说认为，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，它们立即被细胞中的自由CP所重新包裹，从而阻止了入侵病毒核酸的翻译和复制。在离体条件下，附加自由CP能够抑制末装配病毒的翻译的实验结果支持了上述假说；另一假说认为，抗性机制是在CP水平上抑制病毒脱壳，此说法最有力的证据是转基因植株可抗完整病毒的侵染．但不能抵御裸露病毒RNA的入侵；还有一种观点认为病毒外壳蛋白的抗性机制不是外壳蛋白在起作用，而可能是它的RNA转录物与入侵病毒RNA之间的相互作用（2）病毒复制酶基因：RNA病毒（如烟草花叶病毒）的复制酶是依赖于RNA 的RNA聚合酶。病毒复制酶一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成的。在植物中表达不完整的病毒复制酶基因可以显著提高植物对病毒的抗性，作用机制还不十分清楚，可能与基因转录后沉默有关。下面是文献: 植物抗病毒基因工程植物病毒病难以防治已成为植物界的“癌症”，给全球农业生产造成巨大的损失。有效地防治植物病毒病，减少经济损失，满足日益增长的世界人口需求。是农业生产当务之急。病毒分子生物学，植物基因工程的迅速发展，为筛选培育抗病、优质、丰产的新植物开辟了广阔的前景。自1986年，全球范围内兴起了多种利用分子生物学及基因工程研究成果防治植物病毒病害的策略，并成功地培育筛选出多种抗病毒的工程植物。 1．病毒外壳蛋白介导的基因工程抗病性外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，它的功能是将病毒基因组核酸包被起来，保护核酸；与宿主互相识别，决定宿主范围；参与病毒的长距离运输等。1986年，美国的Beachy实验室的Powell－Abel等第一次将烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV－Cp）基因插入修饰过的农杆菌质粒中，并置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子下，经农杆菌侵染而将TMV－Cp基因转入烟草，并在烟草中表达TMV－Cp，分子生物学检测表明TMV－Cp基因已整合到烟草的基因组中，并能稳定地遗传给子代，在转基因烟草中TMV－Cp表达量占叶蛋白0．1％左右。

植物基因工程中的载体

植物基因工程中的改进之载体朱祺琪社科1003 3100104077 【摘要】植物基因工程经历了二十多年的发展历程，虽然取得了令世人瞩目的成绩，但仍有许多问题一直困扰着这个领域的研究者。本文从各种文献中整理了国内外在构建植物表达载体方面的一些新进展，这些策略的最终目的都是为了更好地增强外源基因的表达水平，提高生物工程体的安全性。【关键字】植物基因工程载体启动子内含子定位信号位置效应【引言】近几年来植物基因工程的研究进展十分迅速。在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变植物的某些成份方面都已得到不少转基因植株,有的已经建成了品系;为提高作物的产量、抗逆能力、改进它们的品质,进行快速、优质、稳产的良种选育提供了一条全新的诱人的途径。植物基因工程经历了二十多年的发展历程，虽然取得了令世人瞩目的成绩，但仍有许多问题一直困扰着这个领域的研究者。突出的问题表现在外源基因往往表达效率不高，难以得到理想的转基因植物（作物），转基因作物的安全性不好。这些问题不仅成为植物基因工程发展的限制因素，而且也是近几年在西欧等国家对转基因作物有较大争议甚至产生排斥反应的直接原因之一。如何提高载体的表达效率，最大程度上消除植物基因工程的非安全因素，已经成为当下一个值得深思的问题。【正文】一、植物基因工程过程简介基因工程简单地说就是采用目前知道的新技术，在大分子（DNA分子）水平上将个别基因的分子基础输入到另一种生物的细胞以定向改变其遗传特性。

一般来讲，基因工程的实现主要分为三个步骤：1)以人工方法在现有的生物中取得所需要的DNA片断，利用mRNA复制所需的DNA，即人工合成基因。2)将人工合成的基因输入到新细胞当中去，并使其与新细胞中原有的DNA相组合，即DNA的重组。3)筛选和培养有外源基因的细胞或组织，使其产生正常健康的转基因植物，通过有性繁殖将优良性状传递给下一代。实现以上三步需要进行以下工作：1) 寻找目标基因。2) 取得目标基因。3) 基因的载体问题。二、植物基因工程载体的种类 1、载体是指运载外源DNA 进入受体细胞内的运载工具。它同外源DNA 在体外重组成DNA 重组分子, 在进入受体后形成一个复制子, 即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此, 作为载体应该具有以下几个要求: ①有某种限制酶的一个切点, 最好是有许多种限制酶的切点, 而且每种酶的切点只有一个; ②外源DNA 插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制, 载体应对受体细胞无害, 以及载体能接纳尽可能大的外源DNA 片段; ③有利于选择的标记基因, 可以很方便地知道外源DNA 已经插入, 以及把接受了载体的受体细胞选出; ④具有促进外源DNA 表达的调控区。 2、克隆载体及表达载体载体又可分成克隆载体和表达载体两大类。克隆载体一般是原核细菌将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接, 再导入原核细菌内, 质粒会在原核细菌内大量复制, 形成大量的基因克隆。被克隆的基因不一定会表达, 但一定被大量复制。而表达载体是一些用于工程生产的细菌, 他们被导入目标基因, 这些目标基因会在此类细菌中得到表达。生产出我们需要的产物, 导入的基因是有克隆载体产出的。最常用的载体是Ti质粒载体。质粒是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子,它是闭合环状的双链DNA 分子, 大小从1kb 直到200kb 以上。质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。有些质粒处于“严紧控制”之下, 即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝, 或最多只有几份拷贝。

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