荧光定量PCR

06-09

One-step qPCR Kit

RNA-direct TM SYBR?

Green Realtime PCR Master

Mix

(Code No. QRT-201, QRT-201T)

使用说明书

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department

OSAKA JAPAN

A3587K

－目录－

[1] 简介 (1)

[2] 制品内容 (3)

[3] 必需品 (4)

[4] 使用方法 (6)

[5] 相关实验 (12)

[6] 常见问题 (15)

[7] 相关产品 (17)

【注意】

本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。

在使用本产品时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。

“Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain Reaction (PCR) process for The Research Field in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process is covered by the up-front license fee, either by payment to Applied Biosystems or as purchased, i.e., an authorized thermal cycler.”

※LightCycler TM是Idaho Technology Inc.的注册商标。

※TaqMan?是Roche Molecular Systems Inc.的注册商标。

※ABI PRISM?是Applied Biosystems Inc.的注册商标。

[1] 简介

本品采用Thermus thermophilus HB8株来源的rTth DNA聚合酶，该酶在二价锰离子（Mn2+）存在下具有很强的逆转录活性，利用该特性，开发出单酶一步法定量PCR试剂盒。逆转录反应和PCR反应在同一反应体系连续进行，仅需一次加样即可完成，减少了样品间交叉污染的危险，而且操作便捷，尤其适用于高通量实验。

本品中含有SYBR Green I，可以方便地进行染料法定量PCR。

◆特征◆

1. 逆转录反应和定量PCR反应在同一反应体系中进行

本品以RNA为模板，逆转录反应和PCR反应在同一反应体系连续进行，实验快速方便，非常适合于高通量实验。同时也减少了样品间交叉污染的风险。

2. 可应用于高级结构复杂的RNA和高GC含量的模板

本品采用单种耐热性rTth DNA多聚酶。和通常的逆转录酶相比较，可以在高温进行逆转录，非常有利于对具有复杂高级结构的RNA模板进行逆转录反应，同时该酶对高GC含量的模板也有出色的扩增表现，在定量PCR实验中也能高效扩增。3. 快速热启动

本品采用抗体法热启动，对控制非特异性扩增非常有效。同时，抗体在高温下会迅速失活，释放多聚酶活性，最大限度地避免了高温对RNA模板和聚合酶活性的损伤。

4. 高适用性

可应用于LineGene（BIoFlux公司），LightCycler（Roche公司），ABI PRISM（ABI 公司）等仪器。

[2] 制品内容本品含以下组分。

品名内容保存

QRT-201

(50μl反应

x 100回用)

QRT-201T

(50μl反应

x 40回用)

RNA-direct SYBR? Green Realtime PCR Master Mix

-20℃

（4℃，2个月）

避光保存

500μl x 5 500μl x 2

50mM Mn(OAc)2 -20℃500μl x 1 200μl x 1

RNA-direct SYBR? Green Realtime PCR Master Mix

Master Mix是2×反应液，含反应buffer、dNTPs、rTth DNA多聚酶和多聚酶抗体，以及passive reference和SYBR Green I。使用时，加入RNA模板、引物、Mn(OAc)2溶液及DEPC水至1×即可。

Master Mix请在-20℃保存，融解后须上下颠倒混匀方可使用。使用后重新-20℃保存，通常冻融10以内不会影响实验，但也请尽量避免反复冻融。如果一次使用量较少，可以在融解后分装成几管，每次取一管使用。如果短期内需多次使用，可在4℃保存，但须在2个月内用完。注意必须避光保存。

50mM Mn(OAc)2

逆转录反应必需溶液。通常按反应体系的1/20体积（终浓度2.5mM）添加，根据RNA模板的不同，也可适当增减Mn(OAc)2的终浓度，以获得更高的扩增效率。

[3] 实验必需品

除本品外，还需以下仪器和试剂。

·定量PCR仪器

本品适用于LineGene（BIoFlux公司），LightCycler（Roche公司），ABI PRISM（ABI公司）等仪器。请根据各仪器的操作说明书进行实验。

·引物

请根据目的基因的序列设计引物，引物设计对定量PCR实验的精确性和重现性非常重要。

以下是设计引物的一般注意事项。

- 引物不必标记和修饰，长度20-30mer，GC含量在40-60％间。

- 扩增片段应小于200bp，过长的片段会降低扩增效率，而且容易导致非特异性反应，影响准确定量。

- 引物设计尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性。

·RNase-free水

建议使用超滤制备的RNase-free水，如果使用DEPC水，请通过高压灭菌去除DEPC，否则残留的DEPC会影响反应。另外，用于定量PCR的水不要和其它实验混用，以避免污染影响定量。

·Total RNA

本品可直接以Total RNA作为模板进行定量。通过常规AGPC（Acid Guanidium - Phenol – Chloroform）法制备的Total RNA中可能会混入基因组DNA，从而造成假阳性，必要时可用DNase I等试剂去除。在组织、细胞等样本中，作为目标检测对象的mRNA含量通常仅占Total RNA的1-2％。

·poly(A)+ RNA (mRNA)

具有poly(A)+结构的mRNA可通过oligo(dT)制备。通过纯化过程，mRNA得到高度浓缩，通常用于对mRNA 的高灵敏度检测。需要注意的是，mRNA比Total RNA更容易被RNase所降解，操作时需要特别小心。

[4] 使用方法

1. 使用LineGene (BioFlux公司)的SYBR Green分析法

(1)反应液的配制

[PCR反应液(例)]

蒸馏水（RNA-free）Up to 10 μl

SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 5 μl

RNA-direct

Mn(OAc)2 0.5ul

50mM

引物 1 (终浓度0.2uM ) 2pmol

引物 2 (终浓度0.2uM ) 2pmol

样品RNA溶液<500ng

Total 10μl

·蒸馏水必需用RNase-free水，建议用过滤法生成的RNase-free水。如用DEPC水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用RNase-free水。

·因为添加量在2-6pmol（0.2-0.6uM）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。

·Mn(OAc) 2终浓度通常为2.5mM，根据RNA模板浓度和序列的不同，有时适当增减Mn(OAc) 2浓度会得到更好的结果。

·作为的模板的RNA，通常Total RNA不要超过500ng，poly(A)+ RNA（mRNA）不要超过100ng，模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。

(2)PCR的实施

[RT-PCR温度设定(例)

变性1 90℃ 30s

↓

RT 61℃ 20min

↓

变性2 95℃ 30s

↓

PCR循环 95℃ 15s

（45Cycles） 55℃ 15s

74℃ 30s（data collection）

↓

熔解曲线分析

·本品是高速热启动产品（参见第2页），第一次变性过程90℃，30s（变性1）后，即可充分释放酶活，过分加热会影响酶活性及损伤模板RNA的稳定性。

·退火温度根据引物的Tm值在55℃-65℃间进行调整，有时最佳温度可能超出此范围，请根据实际情况调整。·定量PCR中目标片段通常都很小，对延伸时间不需调整。

·荧光detection channel请选择Channel F1。

·除以上举例的三步法外，也可用2步法进行定量PCR，此时请将data collection设置在退火/延伸步骤。

2. Applied Biosystems 7900HT（ABI公司）的SYBR? Green分析法

(1)反应液的配制

[PCR反应液(例)]

蒸馏水（RNA-free）Up to 50 μl

RNA-direct

SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 25 μl

Mn(OAc)2 2.5ul

50mM

引物 1 (终浓度0.2uM ) 10pmol

引物 2 (终浓度0.2uM ) 10pmol

样品RNA溶液<2.5ug

Total 50μl

·蒸馏水必需用RNase-free水，建议用过滤法生成的RNase-free水。如用DEPC水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用RNase-free水。

·因为添加量在10-30pmol（0.2-0.6uM）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。

·Mn(OAc) 2终浓度通常为2.5mM，根据RNA模板浓度和序列的不同，有时适当增减Mn(OAc) 2浓度会得到更好的结果。

·作为的模板的RNA，通常Total RNA不要超过2.5ug，poly(A)+ RNA（mRNA）不要超过500ng，模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。

(2)PCR的实施

[RT-PCR温度设定(例)

变性1 90℃ 30s

↓

RT 61℃ 20min

↓

变性2 95℃ 60s

↓

PCR循环 95℃ 15s

（45Cycles） 55℃ 15s

74℃ 45s（data collection）

↓

熔解曲线分析

·本品是高速热启动产品（参见第2页），第一次变性过程90℃，30s（变性1）后，即可充分释放酶活，过分加热会影响酶活性及损伤模板RNA的稳定性。

·退火温度根据引物的Tm值在55℃-65℃间进行调整，有时最佳温度可能超出此范围，请根据实际情况调整。·Detector通常设为SYBR Green，Quencher：None，Passive Reference设为ROX。请根据仪器说明进行相应设置。

·定量PCR中目标片段通常都很小，通常不需调整延伸时间，如需变更，请确保data collection步骤在30s以上。·除以上举例的三步法外，也可用2步法进行定量PCR，此时请将data collection设置在退火/延伸步骤。

·上例采用Applied Biosystems 7900HT的标准模式。使用SYBR Green分析法时，ABI公司不推荐使用快速模式（Fast Mode）。

3. 使用LightCycler TM (Roche公司)的SYBR? Green分析法

(1)反应液的配制

[PCR反应液(例)]

蒸馏水（RNA-free）Up to 20 μl

SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 10 μl

RNA-direct

Mn(OAc)2 1ul

50mM

引物 1 (终浓度0.2uM ) 4pmol

引物 2 (终浓度0.2uM ) 4pmol

样品RNA溶液<1ug

Total 20μl

·蒸馏水必需用RNase-free水，建议用过滤法生成的RNase-free水。如用DEPC水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用RNase-free水。

·因为添加量在4-12pmol（0.2-0.6uM）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。

·Mn(OAc) 2终浓度通常为2.5mM，根据RNA模板浓度和序列的不同，有时适当增减Mn(OAc) 2浓度会得到更好的结果。

·作为的模板的RNA，通常Total RNA不要超过1ug，poly(A)+ RNA（mRNA）不要超过200ng，模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。

(2)PCR的实施

[RT-PCR温度设定(例)

变性1 90℃ 30s

↓

RT 61℃ 20min

↓

变性2 95℃ 30s

↓

PCR循环 95℃ 5s

（45Cycles） 55℃ 10s

74℃ 15s（data collection）

↓

熔解曲线分析

·本品是高速热启动产品（参见第2页），第一次变性过程90℃，30s（变性1）后，即可充分释放酶活，过分加

热会影响酶活性及损伤模板RNA的稳定性。

·退火温度根据引物的Tm值在55℃-65℃间进行调整，有时最佳温度可能超出此范围，请根据实际情况调整。·对于200bp以内的目标片段，延伸15s通常已经足够。如需调整，请确保data collection步骤在10s以上。·Detector设为F1。

·除以上举例的三步法外，也可用2步法进行定量PCR，此时请将data collection设置在退火/延伸步骤。

℃。·本品支持20/sec

℃的快速升温模式，扩增效果不佳时，可试着在退火和延伸步骤将升温速度降至2/sec [5] 相关实验

1. Total RNA的DNase I处理

用AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法等常规方法制备的Total RNA中经常会混入基因组DNA，必要时可通过DNase I处理，方法如下：

(1)反应液配制：

反应液组成（例）

蒸馏水（RNA-free）Up to 10 μl

Total RNA X μg

Buffer 1ul

I

10×DNase

RNase-free DNase I （10U/ul）0.5ul

Total 10μl

(2)反应和纯化

上述反应液置冰浴反应10-30min。

↓

加入100ul蒸馏水，100ulTE饱和酚，混匀后，冰浴5min。

↓

12,000rpm、离心5min，取上清。

↓

加入100μl氯仿，混匀。

↓

12,000rpm、离心5min，取上清。

↓

加入5ul 20mg/ml肝糖（共沉剂），100ul 5M醋酸胺，200ul异丙醇，混合均匀，-20℃放置30min。

↓

12,000rpm、离心5min，弃上清。

↓

在沉淀中加入70％乙醇洗涤。

↓

12,000rpm、离心5min，弃上清。

↓

用适量蒸馏水溶解沉淀。

2. poly(A)+ RNA纯化法

目的基因含量很低时，将Total RNA纯化成poly(A)+RNA，可提高灵敏度。以下以MagExtractor -mRNA- （code No. NPK-801，在磁硅珠上结合有oligo(dT)，专用于mRNA的纯化）为例介绍poly(A)+RNA的纯化。

(1)纯化前DNase I反应液配制：

反应液组成（例）

MagExtractor -mRNA- 溶出液Up to 100 μl

Total RNA（～100ug）X μg

I

Buffer 10ul

10×DNase

RNase-free DNase I （10U/ul）1ul

Total 100μl

上述反应液冰浴反应15min。

↓

加入400ul溶解液（含2-ME）和800ul吸附液。

(2)纯化

在新的1.5ml 离心管中加入250ul磁硅珠。

↓

使用磁性台架（Magical Trapper (Code No. MGS-101)）进行固液分离（B/F分离），弃上清。

↓

在磁珠中加入上述处理后的Total RNA溶液。

↓

充分混匀。

↓

室温放置10min。

↓

固液分离（B/F分离）弃上清。

↓

加入1ml洗净液。

↓

充分混匀。

↓

固液分离（B/F分离）弃上清。

↓

加入1ml洗净液。

↓

充分混匀。

↓

固液分离（B/F分离）弃上清。

↓

加入1ml洗净液。

↓

充分混匀。

↓

固液分离（B/F分离）弃上清。

↓

Spin down，再次去除上清。

↓

加入适量溶出液

↓

充分混匀。

↓

65℃温浴2min。

↓

充分混匀。

↓

Spin down。

↓

固液分离（B/F分离）回收上清。

·在MagExtractor -mRNA- 试剂盒的标准操作中，上述纯化过程须重复2次，虽然一次纯化也能满足通常的实验需要，但是对poly(A)+RNA的纯度要求很高时，建议重复2次，以彻底除去可能残留的基因组DNA和rRNA。·关于纯化操作，详细说明请参考MagExtractor -mRNA- 试剂盒的说明书。

［６］常见问题

１．扩增曲线混乱或没有

(1) PCR仪设定方面的问题(参照相应仪器的说明书)

原因对策

detector设成不适合SYBR Green I检测适当调整仪器的设定，再进行分析。

数据收集的设定不恰当通常设在延伸步骤，请调整设定再进行实验

样品位置设定错误设定适当的样品位置后再进行分析或再进行实验。

仪器方面的其他故障请根据各仪器的说明书进行点检。

PCR条件、引物序列或浓度不当请确认引物浓度及PCR条件，扩增不好时，通常先尝

试降低退火温度，延长退火时间和提高引物浓度，有时

也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。

对于GC含量高的模板，可以适当延长变性时间。如果

还是扩增不好，请重新设计引物。

RNA质量问题 RNA模板可能被降解，重新抽提RNA。

２．定量值重现性差

原因对策

仪器方面的故障因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性

差。请根据相应仪器的说明书进行点检。

样品纯度不好不纯的样品会导致实验的重现性差。请使用混匀的样

品。另外，样品中残留的基因组DNA也可能导致定量

值偏差，请用DNase处理以除去基因组DNA。

PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物。

计量误差反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR

仪推荐的反应体积重新实验。

３．空白样品中有信号（请在熔解曲线分析的基础上进行判断。）

原因对策

阳性样品或PCR产物污染首先请更换用作空白样本的水。如果还发生同样情况，

请分别检查蒸馏水、引物或另启用一管新的Master Mix

后再进行实验。

发生了引物二聚体等的非特异性反应请调整引物浓度和PCR条件。出现非特异性扩增时，

请提高退火温度、延长退火时间、缩短延伸时间或降低

引物浓度。尝试改用三步法PCR。如果还是有非特异

性扩增，请重新设计引物。

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SIN-101B

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Website: https://www.wendangku.net/doc/0b13433238.html,

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

荧光定量PCR注意事项

荧光定量PCR 注意事项 一、基本步骤： 1、目的基因的查找和比对； 2、引物设计； 3、引物合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1 目的基因（DNA 和mRNA）的查找和比对 从https://www.wendangku.net/doc/0b13433238.html,/网点的genbank 中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar 软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar 软件中的Seqman 软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq” 的所有文件，点击“add” 或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble” 进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig) ，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project” 菜单下的“parameter” ，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在

实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤

实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。

荧光定量PCR实验指南(一)

荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从https://www.wendangku.net/doc/0b13433238.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定

比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

实时荧光定量PCR具体实验步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板

相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项

相对定量方法实际操作 （三种常用方法） 本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看对照组目的 基因平均Ct 对照组看家 — 待检样品目 ——

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例：

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

荧光定量PCR全攻略

荧光定量PCR完全攻略 1、什么是定量PCR？ 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 2、定量PCR定量的理论依据是什么？ 特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果：Y=X×2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。 3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？ PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。 PCR扩增通式：① T n=T0（1+E）n ② T n=Tn-1（1+E）n 注：[0

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法 是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR： 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 原理： 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性） 2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)； 3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录； 5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。 收费标准 优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量） （含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系

荧光定量PCR_完整版

08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
2008 年螺旋课堂的课程计划！
2007 年已悄然逝去，2008 年已向我们扑面而来。08 年是共和国发展的关键 一年，也是螺旋网抓住机遇，加快发展的关键一年。今年螺旋网将为各位螺友提 供大量的关于生命科学的讨论主题，让各位螺友对生命科学的灵感相互碰撞，达 到共鸣。还有螺旋网将联合一批一线生命科学人员为您的研究保驾护航。同时还 将为大家提供各种资源包括各类电子书、生命科学研究进展、生物软件等。 为此，螺旋课堂 08 年的课程将围绕着最新的研究方法、研究进展进行课程 设置。具体安排如下： 第一期：荧光定量 PCR 技术 第二期：原位杂交技术 第三期：引物的设计原理及方法 第四期：BAC 库的构建技术 第五期：手把手教你进行序列分析
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实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项

CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项1、开始运行仪器 1.1打开电脑 1.2打开定量PCR仪底座开关 1.3启动CFX Manager软件 2、放置样品 2.1将PCR反应体系加入到0.2ml底缘八联管，盖上管盖；或加入底缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须戴一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 3、设置程序，运行试验 3.1定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（protocol tab）b.设置反应板文件（plate tab）。c.点击‘‘start run’’键，运行程序。 3.2热循环程序文件（protocol tab）设置指南：点击edit（编辑）或create new （创建新程序）。 3.3反应板设置文件（plate tab）设置指南：选择本次试验所需要使用的荧光染料种类；单机样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（standard），点击‘‘dilution series’’键可设置其标准品浓度及稀释倍数。 3.4点击‘‘start run’’键。单击open lid（打开热盖）或close lid（关闭热盖）放置样品；单击start run，保存文件，开始运行程序。 4、结果分析 4.1PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和CT值等。 4.2如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。 4.3点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。 5、关闭运行仪器 5.1实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电 源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。

荧光定量PCR详细流程和问题解析

荧光定量PCR详细流程和问题解析 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，