切胶回收的步骤

切胶回收的步骤

1．琼脂糖凝胶电泳目的基因，紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul）

2．尽量切碎凝胶

3．向离心管中加入3倍体积的NAL溶液，55（视具体胶定）度加热，使凝胶完全融化，

4．按每20ul硅胶树脂结合（树脂使用前要充分混匀）约3ugDNA加入适量比例的硅胶树脂，充分混合，室温放置20min，

5．10000rpm离心1分钟，去上清（上清液暂保存，如回收率不过可重复4）

6．加入800ul清洗液（清洗液加入56ml100%的无水乙醇），振荡混匀后，室温静置10min，10000rpm离心1分钟，去上清

7．重复步骤6，尽量去除上清，完全风干至不残留乙醇味道；

8．加入和硅胶树脂等体积的TEbuffer或灭菌蒸馏水混匀，55度水浴20min 9．10000rpm离心1分钟，吸上清为DNA回收液，

10．重复8，9

尿液中囊泡的提取和鉴定概要

尿液中exosome的提取和鉴定 一、exosome的提取 （一）实验准备 1.试剂：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水 耗材：超速离心管50mL，15mL （二）实验步骤(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010) 1. 将－80℃冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。 2.从-20℃中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。 3.每50mL尿液中加入625 μL溶解后的蛋白酶抑制剂（12.5 μL/mL Urine）。 4.于4℃，17000 × g 离心15 min。（新鲜尿液25℃离心）（超速离心机型号Hitachi CP 80MX） 5.取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL， 4℃ 200 000 × g离心1 h。（同上新鲜尿液25℃） 6.离心后弃上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。 7.弃上清，3管中各加50μL isolation solution，涡旋混匀30 s，转移到一个1.5 mL Eppendrof 离心管中。 8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95℃孵育2 min。 9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速离心10min。 10.弃上清，加50 μL isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 离心15 min。

取上清做1D SDS/PAGE. 11.Bradford 法测蛋白总浓度。 12.按1:4体积比加入5×SDS-Laemmli 缓冲液（含60 mg/mL DTT），涡旋混匀。 13.60℃加热10 min，-80℃保存。（for western blot） 朱墨桃师姐提取exosome方法(Zhu, Li et al. 2012) 1.2,000 g for 10 min at 4 °C ，除去死细胞； 2.取上清，4 °C 10,000 g 离心30 min，除去细胞碎片； 3.取上清，4 °C 110,000 g离心70 min，弃上清； 4.PBS清洗并重新分散，-80 °C保存。 5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。 二、负染电镜分析 （一）实验准备 4% paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4），1 % Uranyl acetate乙酸双氧铀in dd-H2O，石蜡膜，200 目镍网 （二）实验步骤 1.将20μL exosomes 小体悬样与4% 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4）1：1混匀。 2.取10μL混合物滴于石蜡膜上，将200目镍网置于液滴中悬浮10min。 3.用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 4.在20μL PBS液滴中悬浮5min，重复。 5.在20μL 去离子水液滴中悬浮5min，重复。 6.1% 乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 7.将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥15min。 8.样品准备完毕，进行EM分析。 三、1D SDS-PAGE （一）实验准备 储存液配制： （1）2 M Tris-HCl （2）100 g/L SDS 溶液 （3）75%（v/v）甘油 （4）10 g/L 溴酚蓝溶液 电泳工作液配制： （1）Acr-Bis液 （2）4×分离胶缓冲液 （3）100 g/L 过硫酸铵溶液 （4）TEMED 成品液 （5）5×样品缓冲液 （6）10×电泳缓冲液

板式热回收原理及应用

板式热回收原理及应用 https://www.wendangku.net/doc/0a14460635.html,/EEB/heat_recovery.html 工作原理 板式能量回收换热器有两种型式，即显热回收和全热回收。 两股由导热导湿材料隔绝而又逆向流动的气流，当存在温度或湿度差时，就会发生热或湿的传递，从而实现能量回收，其工作原理如图。 显热回收是通过传热铝箔进行热量的交换，而全热回收则是通过全热交换纸进行热和湿的交换，这种全热交换纸纤维间隙很小，只有水蒸气分子能够通过，而直径较大的有害气体或异味气体分子无法通过，同时能进行热的传递。 结构特点 显热回收换热器采用耐海水腐蚀的优质亲水涂层铝箔做传热导体，采用特殊工艺加工而成，具有换热效率高，易于维护，寿命长等特点，该种换热器特别适用于室内外温差大，湿度小的地区。 全热回收换热器采用进口优质全热交换纸做传热传湿导体，具有透湿率高，气密性好，抗撕裂，耐老化和传热效率高等特点。该种换热器主要适合于室内外温差小，湿度大的地区。 没有运动部件，设备维护费用较少。 结构紧凑，体积小，适合各种场合。

热回收效率 寿命周期成本 工作原理 板式能量回收换热器有两种型式，即显热回收和全热回收。 两股由导热导湿材料隔绝而又逆向流动的气流，当存在温度或湿度差时，就会发生热或湿的传递，从而实现能量回收，其工作原理如图。

显热回收是通过传热铝箔进行热量的交换，而全热回收则是通过全热交换纸进行热和湿的交换，这种全热交换纸纤维间隙很小，只有水蒸气分子能够通过，而直径较大的有害气体或异味气体分子无法通过，同时能进行热的传递。 结构特点 显热回收换热器采用耐海水腐蚀的优质亲水涂层铝箔做传热导体，采用特殊工艺加工而成，具有换热效率高，易于维护，寿命长等特点，该种换热器特别适用于室内外温差大，湿度小的地区。 全热回收换热器采用进口优质全热交换纸做传热传湿导体，具有透湿率高，气密性好，抗撕裂，耐老化和传热效率高等特点。该种换热器主要适合于室内外温差小，湿度大的地区。 没有运动部件，设备维护费用较少。 结构紧凑，体积小，适合各种场合。 热回收效率

胶回收DNA注意事项

胶回收DNA注意事项 ①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。 ②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。 ③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。 ④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。 ⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。 ⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。 ⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。 ⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，

其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。 ⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。 关于胶回收切胶的一点注意事项 1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。 4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。 胶回收

promega 胶回收完整说明书

Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA Toll Free in USA 800-356-9526·Phone 608-274-4330 ·Fax 608-277-2516 ·https://www.wendangku.net/doc/0a14460635.html, Printed in USA.Part# TB308Revised 11/09Page 1 1. Description ..........................................................................................................12. Product Components and Storage Conditions ............................................33. General Considerations ....................................................................................44.Gel Slice and PCR Product Preparation .. (4) A.Preparing the Membrane Wash Solution (4) B.Dissolving the Gel Slice (5) C. Processing PCR Amplification Products (6) 5.DNA Purification (6) A.DNA Purification by Centrifugation (6) B.DNA Purification by Vacuum............................................................................76. Troubleshooting .................................................................................................97. References .........................................................................................................118.Appendix .. (11) https://www.wendangku.net/doc/0a14460635.html,position of Buffers and Solutions (11) B. Related Products (12) 1.Description The Wizard ?SV Gel and PCR Clean-Up System is designed to extract and purify DNA fragments of 100bp to 10kb from standard or low-melt agarose gels in either Tris acetate (TAE) or Tris borate (TBE), or to purify PCR products directly from a PCR amplification. Up to 95% recovery is achieved depending upon the DNA fragment size (see Table 1). PCR products are commonly purified to remove excess nucleotides and primers. This membrane-based system, which can bind up to 40μg DNA, allows recovery of isolated DNA fragments or PCR products in as little as 20 minutes, depending on the number of samples processed and the protocol used. The purified DNA can be used for automated fluorescent DNA sequencing, cloning, labeling, restriction enzyme digestion or in vitro transcription/translation without further manipulation.?Clean-Up System All technical literature is available on the Internet at https://www.wendangku.net/doc/0a14460635.html,/tbs Please visit the web site to verify that you are using the most current version of this Technical Bulletin. Please contact Promega Technical Services if you have questions on use of this system. E-mail techserv@https://www.wendangku.net/doc/0a14460635.html,.

(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法

SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；

热回收技术应用原理

热回收技术应用原理 一、热回收原理 制冷机组经冷凝器放出的热量通常被冷却塔或冷却风机排向周围环境中，对需要用热的场所如宾馆、工厂、医院等是一种巨大的浪费，同时给周围环境也带来一定的废热污染。 热回收技术就是通过一定的方式将冷水机组运行过程中排向外界的大量废热回收再利用，作为用户的最终热源或初级热源。 制冷压缩机排出的高温高压气态制冷剂先进入热回收器，放出热量加热生活用水（或其它气液态物质），再经过冷凝器和膨胀阀，在蒸发器吸收被冷却介质的热量，成为低温低压的气态制冷剂，返回压缩机。图中热回收器便是热量回收的载体，起着热量回收和转移的作用。根据热力学第一定律可以得到如下关系式φ?k′+φ?R=φ0′+P?in′式中，P?in′—压缩机吸收并压缩制冷剂消耗的功率； φ0′—制冷剂在蒸发器吸收的热量，即制冷量； φ?R—制冷剂在热回收器中放出的热量，即热回收量； φ?k′—制冷剂在冷凝器中冷凝（或过冷）放出的热量。 雷诺威机房空调，雷诺威精密空调 二、热回收类别 针对热回收器回收热量的多少，热回收又可以分为部分热回收和全热回收。其中，部分热回收只能回收冷水机组排放的部分热量，全热回收基本回收了系统排入环境中的全部热量。 三、热回收器形式 根据使用场所的不同和用户终端的具体需求，热回收器可以采用多种不同的形式，如管壳式、板式、翅片管式、套管式等。 四、热回收技术在冷水机组上的一般应用 根据冷水机组通常的使用场所，一般以水作为热量回收的媒介，在此以制取免费卫生热水为例展开讨论。 五、热回收技术原理 热回收器里通过的是高温高压的气态制冷剂（温度约70℃—85℃），在高温高压制冷剂通过热回收器的同时，利用循环水泵将常温的水送入热回收器，在热回收器里水与高温制冷剂蒸气进行热交换，制冷剂被冷凝的同时将水温升高，然后返回热水储存箱，水泵再次从储存箱中将水送入热回收器进行循环加热，使热水温度进一步升高。储存箱中的水经热回收器多次热交换，最终达到客户要求的水温（55℃-60℃左右）。当热水温度达到设定值时，循环水泵停止工作。 通过热水阀自储存箱中提取卫生热水，一旦水箱中水位降低，补水装置自动补水，此时水温开始下降，当水温降到低于设定值时，热水循环泵自行启动运转，再次通过热回收器对储存箱的水进行循环加热（前提是冷水机组在运行中），这样就确保储存箱中的热水温度维持在相对恒定的范围内。

DNA胶回收中常见问题和解答

1、如何计算提取率 1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率； 2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比； 3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。 2、如何简易测算提取率 取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5-10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。 3、如何看待提取得率 影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 4、回收率为什么与点样量和片段大小有关 DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。 5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因 1）胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；

2）胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收； 3）紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内； 4）洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率； 5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好； 6）回收前的样品量太少，加大点样量； 7）洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。 6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象 1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶； 2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收； 3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。 7、琼脂糖凝胶块不溶 1）琼脂糖质量不好； 2）含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃； 3）制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

血清蛋白电泳操作规程

血清蛋白电泳 一．项目名称 血清蛋白电泳（HYDRAGEL PROTEIN） 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶区带电泳 三．方法学原理 蛋白电泳是临床实验室中一种常用的蛋白质剖析技术。它可以对血清或其他体液中的异常蛋白质进行筛选。它是以区带电泳为基础在一种合适的支持介质—琼脂糖上进行的电泳。血清蛋白质在给定的PH条件下主要根据其所带电荷数将其分离成五种片段：白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白，每一区带含有一种或多种血清蛋白质。 四．方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。血清蛋白区带电泳是在临床实验室中常用的技术之一，可定性和/或半定量各条正常或异常蛋白区带。 五．仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二）分析和计算参数： 1．处理量：约162个样本/小时 2．所需样本量：10ul 3．检验时间：约半小时 4．重复性：有良好的批内和批间重复性 5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 15 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 30 PROTEIN(E)试剂盒 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：70测试/150测试/300测试 （3）货号：PN4100/ PN4120/ PN4140 2．脱色液 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 10×100ml （3）货号：PN4540 (4) 成分：柠檬酸

胶内酶解

一、试剂准备 1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾 9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水 2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠 24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水 3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵 0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水 4. 覆盖液（酶解缓冲液） 40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN 200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水 5. 萃取液 50％ACN，0.1% TFA 6. 胰蛋白酶 贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。 工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL

7. 脱色液 银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合 考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3 以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。 二、实验步骤 1. 切胶 用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。 2. 脱色 银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。 （3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O） 考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。 3. 洗涤 向每管加入200uL 40mmol/L NH4HCO3，振荡洗涤2min，多余液体吸出丢弃，重复1次。

转轮热回收与乙二醇热回收的比较分析

转轮热回收与乙二醇热回收对比分析 一、转轮热回收和乙二醇热回收工作原理 转轮热回收：以轮芯作为换热媒介，转轮使用定制的蜂窝状金属材料，表面涂有一层特殊等级的吸附材料分子筛干燥剂。将转轮置于风道之间,从而使其分成两部分。来自空调房间不新鲜空气从一半转轮排出，室外空气以相反的方向从另一半转轮进入。同时，轮子缓慢旋转（约20RPM）。金属层从较热（冷）空气流吸收存储热量（冷量），并释放到较冷（较热）部分,显热发生转移。附着干燥剂的金属片将来自高湿度的空气流里的湿气冷凝后，通过干燥剂吸收（同时释放热量），再蒸发（吸热），将湿气释放到低湿度的气流里，这个过程将潜热转移。 乙二醇热回收：以换热器和乙二醇溶液作为换热媒介在排风侧将排风中的冷量(热量)通过换热器传递给乙二醇溶液，降低（提高）乙二醇溶液的温度，然后通过循环泵将被冷却（加热）的乙二醇溶液输送到新风侧的换热器中，降低（提高）新风温度，减少系统的负荷和整个空调系统的运行成本。 二、关键部件外形图 转轮热回收转轮：乙二醇热回收换热器 三、关键部件材质 转轮热回收转轮： 可选用进口优质产品美国百瑞（Bry-Air）热回收转轮，美国百瑞（Bry-Air）热回收转轮为能量回收领域的领先品牌。 其特点如下： 1、独有分子筛技术：百瑞热回收转轮的基材采用铝箔材料，在铝箔表面覆盖不可移动式

分子筛干燥剂；相比采用其他材料覆盖在铝箔上的其他热回收转轮，美国百瑞（Bry-Air）热回收转轮在铝箔表面覆盖低微孔尺寸佛石干燥剂，仅容许水分子通过，拒绝所有其他污染物，其结果是污染物只留在排风中。 2、百瑞转轮内置净化装置：消除了交叉污染，做到新风和排风气流的隔离，防止新风排风的交叉污染；净化装置具备严格的空气流隔离功能，以防止细菌、灰尘和污染物从排风侧携带到新风侧，净化装置和迷宫式密封系统把交叉污染的排风浓度限制在0.04%。 3、清洁扇：转轮采用可调整式内置清洁扇清洗部件；免除清洁烦恼，降低运行成本。 乙二醇热回收换热器： 排风侧的换热器和新风侧的换热器组成，两换热器直接通过乙二醇管道相连，通过循环泵循环。由于有载冷剂乙二醇的存在，乙二醇有一定的挥发性及有毒性，且是可燃性液体，存在泄露隐患。 四、与空调系统配套情况 转轮热回收： 由于转轮热回收整体结构简单，无连接件。则与空调系统配套较为方便，可作为空调箱的一个功能段可以上下安装也可以左右安装。可以承收5.5m/s的面风速，占用空间小。 乙二醇热回收： 由于连接部件较多，结构复杂，连接件较多。则与空调系统配套较复杂，连通管道的泄漏，换热媒介的质量，换热器的质量，管道循环泵的质量，均可形成空调整套系统隐患。可作为空调箱的一个功能段可以上下安装也可以左右安装。比较适用于送排风须完全隔离的（甚至是远距离的末端处理）送排风系统。可承受的最大面风速为2.8m/s，占用空间大。 五、换热效率 转轮热回收： 中间换热媒介单一，换热效率高，在高温高湿条件下显热效率和潜热效率到均可达到70％以上，最高可达90％（焓换效率）。 乙二醇热回收： 间接能量回收（显热）型,中间换热媒介较多，换热效率低，显热效率一般仅为30－40％，最高仅能达到45％基本上无潜热回收（温度交换效率）。 下面就本工程单台机组冬季运行时作经济分析： 转轮热回收换热效率按70%，乙二醇热回收换热效率按40%，其他参数暂定如下：

胶回收方法全攻略

胶回收方法全攻略 说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳片断回收没有1—2个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单的操作而 烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比如 酶切连接、转化筛选、测序或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。 一、胶回收的关键参数 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的载量等等。 回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，会强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。 回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低;又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。 其他：操作方面，相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量，就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势——同一个片断你要用2个柱子，多郁闷啊。

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量

胶内酶解

1.2.2 蛋白质谱鉴定 （1）胶内酶解 斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。 脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。 酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。保存？？？ （2）质谱鉴定 ①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。 ②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。

胶回收

除了选择合适的方法外,实验中还要注意以下几点: (1)防止抽提过程中污染DNA酶 与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌(酶)处理,即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶,不然可能发生回收片段部分降解的现象,有时甚至一无所获.即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末 端时也会导致严重的连接困难. (2)紫外照射选择长波段 回收过程往往需在紫外等监测下进行,与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯.因为短波紫外线(254nm)会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体,前者会使以后的连接与转化等实验失败,后者可能造成基因突变,给克隆工作带来麻烦.即使是使用了长波紫外照射,回收DNA时也要尽量短时照射,避免连续长时间照射. (3)实验操作要轻柔 特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏,如吸取液体,转动离 心管等操作均应缓慢,轻柔. 综上所述,只有在合适的回收方法基础上注意具体操作步骤是才能有效回收所需片段,为以后的酶切,连接,标记等工作打下良好基础. 3 实验步骤 一、试剂盒法(Kit回收法,以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例) (1)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小,提供后续回收效率) (2)凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN) (3)凝胶溶解:55-60℃,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀. (4)将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒. (5)取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟. (6)重复步骤5一次. (7)取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm 离心2分钟. (8)将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放 置2分钟. (9)盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA 片段. 胶回收 一. 提高胶回收量的办法： 1) 增加电泳时的上样量。 2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

SDS-PAGE电泳操作规范

聚丙烯酰氨凝胶电泳 一简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选

TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上

蛋白胶内酶解方法

三、制备方法 （一） 胶内酶解方法[9] 1.操作步骤 1)用手术刀片切下电泳胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中(胶块切成约 1mm3大小)，同时切下空白胶块作对照 2)加入200～400ul 100mM NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干(注：脱色液体积过 量为好，脱色至透明，不必担心蛋白的损失，因为完整蛋白在此条件下很难被洗脱) (若为银染)[10]取30～50ul 30mM K3Fe(CN)6:100mM Na2S2O3=1:1(体积比)加入胶块内，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立刻加200ul水终止反应，10分钟后，去除上清，再加入100ul 100mM NH4HCO3,静置20分钟，去除上清 3)(若是2-D gel，则跳至第8步) 每管加入90ul 100mM NH4HCO3，10ul 100mM DTT，56℃孵化30分 钟，还原蛋白质(注：溶液体积过量，若温度为室温，反应时间相应延长至1～2小时) 4)去上清，每管加100ul 100%ACN，5分钟后吸去 5)每管加入70ul 100mM NH4HCO3，30ul 200mM IAA(现配，避光保存)，暗处20分钟 6)去上清，每管加入100ul 100mM NH4HCO3，室温15分钟 7)去上清，加入100ul 100%ACN，5分钟后吸去，冻干 8)冻干后，各加入5ul 2.5～10ng/ulTrypsin溶液，置于4℃冰箱30～60分钟，使胶块充分吸胀(若仍有剩 余液，吸出打掉)注：50ng酶量是基于考染一块胶1mg的上样量，12.5ng是基于银染一块胶100ug的上样量。上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质量比一般为1：20～1：100[11,12] 9)再加入20~30ul左右50mM NH4HCO3缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8～8.0(Promega)注：缓冲液体积视胶 块体积而定，一般没过胶块20ul左右 10)37℃反应过夜，20小时左右 11)吸出蛋白酶解液，转移至新EP管中，原管加入100ul 60% ACN/0.1%TFA,超声15分钟，吸出溶液， 并入前次溶液，反复抽提3次，合并，冻干 12)样品制备完成，可以复溶，点样，进行质谱分析 2.注意事项 1)若样品种类较多，切记编号离心管，样品对号入管 2)考染方案各注释均适用于银染方案 3)整个操作过程应注意角蛋白等的污染 4)佩带一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore H2O 5)不同公司的酶，最适PH范围不同，调节PH值 3.试剂配制 1)100mM NH4HCO3：称取1.581g NH4HCO3(MW 79.06)溶于200ml Milli Q水中 2)50 mM NH4HCO3：称取0.791g NH4HCO3溶于200ml Milli Q水中 3)100mM DTT：称取DTT(MW 154.3)0.0154g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中 4)200mM IAA：称取IAA(MW 185.0)0.0370g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中 5)TPCK-Trypsin无需配制，Promega公司已提供成品，浓度为0.5ug/ul，用时可按需稀 6)30mM K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6(MW 329.25)0.0099g溶于1ml Milli Q水中 7)100mM Na2S2O3·5H2O：称取Na2S2O3(MW 248.11)0.0248g溶于1ml Milli Q水中 8)银染脱色液：将6)和7)以1:1体积混合，现配