TERE1基因在小鼠胚胎腭发育和腭裂形成中的表达即相关性研究
中图分类号：Q132.7；Q593.4；R114文献标识码：A文章编号：1002－3127（2010）04－0271－04·论著·TERE1基因在小鼠胚胎腭发育和腭裂形成中的表达
朱勇飞1，3，朱江波2，王飞2，红凌1，张天宝2
（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074； 2.第二军医大学卫生毒理学教研室；
3.杭州师范大学医药卫生管理学院）
【摘要】目的观察TERE1基因在正常小鼠腭发育和全反式视黄酸诱导的小鼠腭裂形成过程中的表达变化，探讨TERE1基因在腭裂发生中的作用。方法ICR小鼠受孕后，将其随机分为实验组和对照组，各64只小鼠。于孕10d （gestational day10，GD10），经口灌胃一次给予实验组孕鼠80mg/kg的全反式视黄酸、对照组孕鼠给予等体积的大豆油，并分别于GD11 GD18取两组胎鼠的腭板。于GD12取下小鼠胚胎腭移植体，以10－9 10－5mol/L全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，atRA）诱导，培养72h后收获腭板。利用实时荧光定量PCR方法（quantitative real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）检测TERE1基因在正常腭组织和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中的表达情况。结果TERE1在正常、异常腭及培养腭板中均有表达。在GD11，异常腭中该基因的表达丰度高于正常腭，而在GD12 GD17，其表达丰度则低于正常腭（P<0.05）。10－9mol/L atRA组和对照组的TERE1基因表达丰度差异无统计学意义（P>0.05），其他各atRA组该基因的表达丰度均低于对照组。结论在该试验条件下，atRA会抑制TERE1在腭中的表达，提示TERE1在腭的发生过程中可能起作用。
【关键词】TERE1基因；全反式视黄酸；腭裂；孕小鼠
Expression of TERE1in normal palates and all-trans retinoic acid-induced
cleft palates during mouse embryogenesis
ZHU Yong-fei，ZHU Jiang-bo，WANG Fei，HONG Ling，ZHANG Tian-bao
（College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，
Wuhan Hubei430074，China）
【Abstract】Objective To observe the expression of TERE1gene in normal palates and all-trans retinoic acid-induced cleft palates during mouse embryogenesis，and explore the relation between TERE1and the cleft palates.Methods At gestational day10（GD10），the gestational mice of the treatment group were administered with80mg/kg atRA，and those of the control group were administered with the same volume soybean oil.The palates of all embryos were harvested during GD11-GD18.At GD12Mouse embryonic palates were explanted and induced by atRA in different concentrations from10－9mol/L to 10－5mol/L and cultured for72h.The mRNA expression of TERE1in all samples was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction（QRT-PCR）.Results TERE1was expressed in all samples.At GD11the mRNA expression of TERE1in the cleft palate were higher than those in the normal palate，and at GD12-GD17，the expression of this gene in the cleft palates were lower than those in the normal palates.The mRNA expression of TERE1in the10－9mol/L atRA group had no difference incomparison with those of the negative control group，and the expressions of this gene in the other atRA groups were lower than those of the negative control group.Conclusion TERE1maybe play a role during the development of palate and atRA probably affects the expression of TERE1in palate.
【Key words】TERE1gene；atRA；cleft palate；gestational mouse
基金项目：浙江医药卫生项目（2008A126）；上海市公共卫生重点学科建设项目（08GZX0301）
作者简介：朱勇飞，博士，研究方向：发育生物学与发育毒理学。
通讯作者：红凌，教授，博士研究生导师，研究方向：发育生物学。
张天宝，教授，博士研究生导师，研究方向：发育毒理学与分
子毒理学。
TERE1（transitional epithelial response gene，移行上皮反应基因）/UBIAD1（UbiA prenyltransferase domain containing1）基因是一个广泛表达于人体各组织的强有力肿瘤抑制因子，有研究显示TERE1在大多数侵袭性肌肉移行细胞癌中表达水平显著下降甚至缺失；而通过基因转染在膀胱癌和前列腺癌细胞中强制表达TERE1，
发现TERE1对泌尿系统肿瘤具有抑制作用［1-2］。
该基因在果蝇中的同源基因是heix基因，在果蝇胚胎和幼虫的发育过程中，heix突变可导致果蝇幼虫出现黑色素瘤，从而引起其死亡［1］。另外，胚胎发育与肿瘤发生的关系甚密，如肿瘤的发生过程中的Wnt、FGF、Notch、Hedgehog、TGF-β和Ras-MAPK等几条重要的信号通路，在胚胎发育过程中对调控胚胎发育也起重要作用。因此，推测TERE1/UBIAD1可能在哺乳动物胚胎发育中起调控作用。
腭是哺乳动物胚胎发育过程中最容易发生畸形的器官之一。TERE1基因在腭的正常发育或者腭裂发生中有何功能？要回答这个问题，首先必须要了解这个基因在正常腭和腭裂组织中的动态表达情况，进而初步推测这些基因在正常腭发育和腭裂发生中的作用。本研究利用Real-time PCR方法，以atRA为致畸物，从体内和体外两方面着手，观察TERE1基因在小鼠胚胎正常腭和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中的表达情况，为进一步研究它在正常腭发育和腭裂发生机制中的作用奠定基础。
1材料与方法
1.1主要仪器和试剂解剖显微镜（XTL-3型，重庆光学仪器厂），高速冷冻离心机（HERMLE ZK400，德国EPPENDORF公司），BioSpecmini型核酸/蛋白分析仪（日本岛津公司）；7300型荧光定量PCR仪（美国ABI公司），旋转培养器，恒温培养箱，混合供气系统。
BGJb培养基（美国Gibco），临用前加入0.15mg/ ml谷氨酰胺（美国Sigma）、6mg/ml BSA（美国Sigma）、50μg/ml链霉素和50U/ml青霉素，Hanks 液，全反式视黄酸（美国Sigma），Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen），逆转录试剂盒（美国Promega），SYBR kit（美国ABI），基因TERE1和内参照β-actin的荧光定量PCR引物均由上海英骏公司合成（引物序列见表1），其余试剂均为国产分析纯。
表1TERE1及β-actin的QRT-PCR引物序列
Genes Forward primer sequences Reverse primer sequences TERE15?GGCCATTCTCCATTCCAACA3?5?GCCAGCCTCTCGGTCAGA3?
β-actin5?GTCCCTGTATGCCTCTGGTC3?5?GGTCTTTACGGATGTCAACG3?
1.2实验动物及样品收集ICR小鼠（上海必凯实验动物有限公司提供），8 10周龄，雌鼠体重25 30g，雄鼠体重30 35g，动物合格证号为SCXK（沪）2003-0002。适应性饲养1周后，雌、雄按2?1的比例合笼交配，查到阴栓之日为孕期第0天（GD0），并将孕鼠随机分为实验组与对照组各64只小鼠。将RA用大豆油为溶剂配制成混悬液，浓度为8mg/ml，于GD10经口灌胃给予实验组孕鼠RA混悬液，给药体积为0.1ml/ 10g体重，对照组给予同样体积的大豆油。分别于GD11 GD18将实验、对照组孕鼠分批颈椎脱臼处死，剖取子宫，肉眼检查确定妊娠情况，从子宫内取出胎鼠，由于RA诱导的腭裂发生率接近100%，故每窝随机选取一只胎鼠用于实验，解剖显微镜下分离其腭板，迅速用液氮冷冻保存。
1.3腭板培养及结果评价参照文献［3-4］的方法，进行腭板培养及结果评价。将atRA溶于DMSO随BGJb培养基加入培养瓶中。实验共7组，分别为对照（生理盐水）组，溶剂对照组（0.1%DMSO），终浓度为1.5?10－9、1.5?10－8、1.5?10－7、1.5?10－6和1.5?10－5mol/L的atRA组。
于GD12脱颈处死孕鼠，无菌取出胚胎，切下腭移植体，将腭移植体放入含9ml BGJb培养液和atRA的50ml培养瓶中，每瓶3 4个，旋转培养［（37.5?0.5）?，20 25r/min］。分别于培养开始时、24h 和48h充入培养瓶内无菌过滤混合气体2 3min，其比例（O
2
?CO
2
?N
2
）为50?5?45。72h时取出腭板，拍照，用液氮冷冻保存。
腭板融合可分为5个类型：（1）双侧腭突分离；（2）双侧腭突靠近但未接触；（3）双侧腭突接触但未融合；（4）部分融合（后部软腭融合）；（5）全融合（融合长度>1/2中线长度）。每只腭板根据上述分类情况分别记为1 5分，并进行统计分析以提供融合率（融合率=计分为4分和5分的腭板数/总腭板数）。
1.4总RNA提取、QRT-PCR及其数据处理将收集的样品用Trizol裂解，按试剂盒的说明提取总RNA，RNA 溶于无核酸酶水中。取约1μg总RNA进行逆转录，合成cDNA，反应体系和反应条件均参照试剂盒的说明。
将所得cDNA进行PCR扩增反应，反应体系如下：SYBR buffer6.5μl，cDNA1.0μl，上下游引物各0.75μl，Mili Q水16.0μl。反应条件为：95?10 min，95?15s、60?1min（40个循环）。
通过各目标基因的PCR扩增曲线Ct值与所设内参照基因（β-actin）的Ct值相比较（即ΔCt值）来对各基因的原始拷贝数进行相对定量分析：ΔCt=目标基因Ct－内参照基因Ct，通过内均一化处理之后，目标基因相对于内参照基因的量为Y=2－ΔCt。
1.5正常及异常腭的HE染色参照李勇和张天
宝［3］提供的方法。
1.6统计学方法运用统计分析软件SPSS13.0，采用χ2检验、方差分析法统计分析所有结果，检验水准α=0.05。
2结果
2.1光学显微镜下正常腭及腭裂的比较图1显示，正常腭双侧腭突发生接触、融合；腭裂的腭突由于双侧腭突体积较小，不能达到中线处进行接触、融合，双侧腭突之间有一明显的空隙。
2.2不同浓度atRA对培养腭融合的影响图2和表2显示，溶剂DMSO和浓度为1.5?10－9mol/L
的
图1GD15小鼠腭突发育
atRA对腭板腭突的融合没有影响；1.5?10－8mol/L的atRA对腭板腭突的融合率有影响，但差异没有统计学意义（P>0.05）；1.5?10－7、1.5?10－6和1.5?10－5mol/L的atRA明显抑制腭板腭突的融合，3组的融合率明显低于对照组（P<0.05），且显示出剂量—反应关系
。
培养腭分类：（A）完全融合；（B）部分融合；（C）双侧腭突接触但未融合；（D）双侧腭突靠近但未接触；（E）双侧腭突分离
图2atRA对腭板形态的影响
表2atRA对小鼠腭板融合率的影响
atRA（mol/L）观察的腭板数融合的腭板数融合率（%）对照组（0）211885.7
DMSO（0）191789.5
1.5?10－9201890.0
1.5?10－8191473.7
1.5?10－7221150.0#
1.5?10－618527.8#
1.5?10－520420.0#
注：与对照组比较，#P<0.05。
2.3实验组和对照组TERE1基因表达丰度的比较
图3显示，该基因在正常和异常腭中均有表达。在正常腭中，TERE1基因的表达模式为升高、降低、升高、降低；在异常腭中，其表达模式为先降低后升高。在GD11，异常腭中该基因的表达丰度高于正常腭（P<0.05），而在GD12-GD17，其表达丰度则低于正常腭（P<0.05）。
2.4不同浓度atRA对培养腭中TERE1基因表达丰度的影响图4显示，该基因在所有组中均有表达。在atRA各组，随着浓度的增加，TERE1基因表达丰度呈下降趋势；1.5?10－9mol/L atRA组和对照组、DMSO组该基因表达丰度差异无统计学意义（P> 0.05），其他各atRA组该基因的表达丰度明显低于对照组和DMSO组（P<0.05）
。
与对照组比较，
#表示TERE1基因表达丰度低于对照组，P <0.05图4不同浓度atRA 对培养腭中TERE1基因表达丰度的影响
（上接第273页）
迄今，有关该基因的报道很少，更未见其在小鼠中的表达或作用的报道。通过研究发现，在GD12 GD17，TERE1在异常腭中的表达丰度明显低于正常腭，而在GD12 GD15正是小鼠腭板长出、融合的时期，由此推测腭裂发生过程中，该基因的表达受到抑制，该基因可能在腭发生过程中起作用。体外实验发现10
－9
mol /L 的atRA 对腭突的融合没有影响，甚至
可能会促进其融合，当atRA 的浓度大于10－8
mol /L
时，会影响腭突的融合；10－9
mol /L 的atRA ，没有影响
TERE1在腭板中的表达丰度，但当atRA 浓度高于10－8mol /L 时，该基因在体外培养腭板中的表达呈下
降趋势，这说明atRA 对腭突融合的影响和对TERE1在腭板中表达的影响是一致的。
本结果表明，atRA 降低TERE1在腭中的表达，提示TERE1在腭的发生过程中可能起作用，但其具体的作用机制仍待进一步的研究加以证实。参考文献
［1］McGarvey TW ，Nguyen T ，Tomaszewski JE ，et al.Isolation
and characterization of the TERE1gene ，a gene down-
regulated in transitional cell carcinoma of the bladder ［J ］.Oncogene ，2001，
20（9）：1042-1051.［2］McGarvey TW ，Nguyen T ，Puthiyaveettil P ，et al.TERE1，
a novel gene affecting growth regulation in prostate carcinoma ［J ］.The Prostate ，2003，54（2）：144-155.
［3］李勇，张天宝.发育毒理学研究方法和实验技术［M ］
.北京：北京医科大学出版社，
2000.［4］韩静，肖颖，林久祥，等.小鼠腭板旋转培养模型的建立
及其初步应用［
J ］.卫生研究，2006（35）：33-35.［5］Orr A ，Dube MP ，Marcadier J ，et al.Mutations in the
UBIAD1gene ，encoding a potential prenyltransferase ，are causal for Schnyder crystalline corneal dystrophy ［J ］.PLoS ONE ，2007，2（8）：e685.
（收稿日期：2009－11－26）
中图分类号：R994
文献标识码：A
文章编号：1002－3127（2010）04－0274－05
·论著·
CCl 4急性染毒小鼠肝细胞线粒体损伤机制的研究
汤新慧1，林娜2，何文静1，严丽芳1，2，高静
2
（1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室盐城师范学院生命科学与技术学院，
江苏盐城224002； 2.江苏大学药学院）
【摘要】目的
研究CCl 4急性染毒小鼠肝细胞线粒体损伤的毒理机制。方法
ICR 雄性小鼠，随机分为正常对照
组，7.5、15、30和60mg /kg CCl 4组，腹腔注射16h 后测定小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT ）、天冬氨酸转氨酶（AST ）活力和肝组织脂质过氧化产物丙二醛（MDA ）水平，测定线粒体膜电位值、线粒体肿胀敏感度以及线粒体内游离钙的含量。结果
与正常对照组相比，15、30和60mg /kg CCl 4组小鼠血清ALT 、AST 活力显著增高、肝组织MDA 水平明显上升，各染
毒组小鼠肝细胞线粒体膜电位值下降、线粒体肿胀的敏感性下降，同时检测到15、30和60mg /kg CCl 4组小鼠肝细胞线粒体内钙离子超载。随着染毒剂量的增大，
CCl 4对上述各指标的影响逐渐增加。结论在该试验条件下，
CCl 4毒理机制可能与线粒体内钙超载导致线粒体膜通透性转运孔（PTP ）高通透性开放有关。
【关键词】CCl 4；肝损伤；线粒体；小鼠
基金项目：江苏省自然科学基金（BK2009172）；江苏省高校自然科学基金（08KJB360011）；江苏省高校自然科学重大基础研究项目（07KJA18017）；江苏省
“333工程”、“青蓝工程”人才计划项目
作者简介：汤新慧，教授，博士，硕士生导师，研究方向：药理学和毒理学。通讯作者：高静，教授，博士，博士生导师，研究方向：药理学。
·472·毒理学杂志2010年8月第24卷第4期J Toxicol August 2010Vol.24No.4
小鼠早期胚胎发育和胚胎移植
小鼠早期胚胎发育和胚胎移植 https://www.wendangku.net/doc/0017471817.html,/4544.htm、 小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。 小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。一些发达国家已有经营奶牛和肉牛胚胎移植的企业公司，向国外销售胚胎。在我国，这一技术的研究起步较晚，1974年在绵羊上获得成功，1978年在奶牛上获得成功，80年代后期90年代初，奶牛、安哥拉山羊和绵羊的胚胎移植开始在生产上应用。胚胎移植术也是显微操作中最基本的实验技术，是从事其它显微操作如嵌合体动物、胚胎干细胞、转基因动物和细胞核移植等实验必不可少的步骤。下面以小鼠为例，介 绍哺乳动物的早期胚胎发育及胚胎移植的操作过程。 实验技术 一、人工催情和超数排卵 1. 小鼠的性别鉴定： 成年小鼠的性别较易鉴别。雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊，仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。 2. 人工催情： 成年小鼠在非妊娠和非哺乳期间，任何时间都可发情，性周期为4-5天。超数排卵一般选用体重在20-30g的雌鼠，注射孕马血清（PMSG）促使超排。每头雌鼠注射PMSG 5-10IU，注射时间可在第一天下午4时左右，注射部位为腹腔。在第三天的下午4时左右腹腔再注射绒毛膜促性腺激素（hCG）5IU，并和雄鼠合笼饲养让其自然交配。第四天上午8时左右检查雌鼠，如有阴道栓形成者，即可供采卵。阴道栓是雌鼠交配后精液与阴道分泌物及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即可出现 （图16.3）。最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转为黄色，最后阴栓缩入阴道液化而消失，此过程需10余小时，有的在24-48小时后仍可见。在合笼后每天上午8-9 时，下午5-6时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠的第一天，即胚龄的第一天。 二、受精卵及囊胚的获得 1. 受精卵的获得： 将检查有阴栓的小鼠用脊椎脱臼法处死，70%酒精消毒腹部。在腹部中央横剪一小口（0.5cm 宽），将两边皮肤肌肉沿切口部剪开，暴露腹部器官；用剪刀和镊子除去卵巢、输卵管和子宫周围的脂肪组织，把输卵管取出（图16.4，16.5），置于盛有培养液的表面皿中。在解剖镜下找到输卵管膨胀的壶腹部，用镊子撕开一小口，卵子即自然流出（图16.6）。如受精卵已迁移到输卵管的狭窄部，则可用冲洗法收集受精卵。方法是：在解剖镜下找到输卵管喇叭口，可以用小玻璃探针帮助，将吸有冲卵液的注射器针头对准喇叭口，右手用小镊子轻轻将喇叭口套在针头上，套进约1mm即可，并用镊子把管
人胚胎干细胞研究的临床意义
人胚胎干细胞研究的临床意义 [关键词] 人胚胎干 健康讯: 吕广秀 20XX14上海市解放军第85医院儿科1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别发表论文阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。 1 胚胎干细胞的一般定义特征考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。 2 胚胎干细胞的最新研究James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能
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人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新
和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,
小鼠早期胚胎发育的研究 )
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计 所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学 学生姓名 学生学号 指导教师 XXXX年XX月XX日 小鼠早期胚胎发育的研究 一、引言 胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。 动物胚胎的发育过程 虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。 受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界， 卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是
对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。 不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。 原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。例如由内胚层发展而来，具有具有多潜能性的的间叶细胞，可以分化成纤维母细胞、软骨母细胞、硬骨母细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、横纹肌母细胞、造血母细胞等等。 器官形成:外胚层、中胚层与内胚层形成各种组织和器官的过程，称为器官形成，也称做器官发生。以青蛙的胚胎为例，在器官形成的早期，外胚层会在突起之后向内凹陷，形成神经脊与神经管;中胚层则会形成中胚叶节(somite)与脊椎，中胚叶节包围的空间称为体腔。 小鼠应用于生命科学研究中已有上百年的历史，成为研究人类遗传疾病的最佳动物模型。它是最小的哺乳动物之一，体形小，易于饲养管理;繁殖和发育速度都特别快;性情温顺，胆小怕惊;对外来刺激极为敏感;便于提供同胎和不同品系动物;成雌鼠在动情周期不同级段，阴道粘膜可发生典型变化，根据阴道涂片的细胞学改变，可以推断卵巢功能的周期性变化，且市场价格较低，。虽然小鼠和人类在体型大小和形态上相差很大，但在生物进化上非常接近。所以以小鼠作为研究人类遗传疾病的材料最为合适。
人胚胎干细胞研究进展
人胚胎干细胞的研究进展 周进学号10170807 【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。 【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述 1、胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。 胚胎干细胞属全能干细胞。ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞
实验小鼠和大鼠各胚胎发育时期的变化
实验小鼠和大鼠各胚胎发育时期的变化 时期 胎龄（日） 胚胎发育小鼠大鼠 1 1 1 单核细胞（输卵管内） 2 2 2细胞期（输卵管内） 3 2 3.25 4细胞期（输卵管内） 4 2. 5 3.5 8-12细胞期（输卵管内） 5 3 3. 桑椹期（输卵管—子宫上部） 6 3.5 4 囊胚初期（子宫内） 7 4 5 囊胚期 8 4.5 6 植入开始 9 5 6.75 内外胚层分化 10 5.5 7.25 植入末期，卵黄腔形成，分化成内外胚层， 11 6.5 7.75 植入完毕，出现羊膜。 12 7 8.5 出现中胚层和原条。 13 7.5 9 出现神经板，头部突起，出现尿膜褶。 14 7.75 9.5 体节1-4（头部）完成外层胎盘。 15 8～8.5 10 腔，胚外体腔内和羊膜腔发育。体节5-12（颈椎部） 形成神经沟，胚回转开始。 16 8.5～9 10.5 体节13-20（胸椎前部）胚回转结束。 17 9.5 11 体节21-25（胸椎后部），神经沟闭锁。 18 10 11.5 体节26-28（腰椎前部），前肢出现。 19 10.25 11.75 体节29-31（腰椎后部），后肢出现。 20 体节32-33（荐椎后部）。 21 12 体节34、35（荐椎后部）。 22 10.5 体节36（第一层尾椎）鼻窝形成 23 体节37、38（尾椎）。 24 体节39、40（尾椎）。 25 11 12.5 体节41、42，前肢变大。
26 体节43-45（尾椎）手指分化。 27 12 13 体节46-48（尾椎）脐疝明显。 28 12.5 13.5 体节49-51（尾椎），鼻上颌闭锁。 29 14 体节52-55（尾椎）。 30 13 14.5 体节56-60（尾椎），耳孔开，耳壳形成 31 13.5～14 15 体节61-63（尾椎），口盖板闭锁 32 14.5 15.5 体节64（尾椎）、体表出现毛囊。 33 15 16 体节65（最终尾椎） 34 16-16.5 17-18 脐疝消失，眼脸、耳壳闭锁。 35 17-19 19-22 胎盘发育显着。临产。
早期胚胎发育
榆林市苏州中学 年级 高二 学科生物 学期二 编写人：张瑞 审核人： 审批人： 授课教师： 班级： 小组： 姓名： 日期4.23 课时编号17 体内受精和早期胚胎发育 (二) 【学习目标】 ．1.简述哺乳动物的受精过程。 2．简述哺乳动物的胚胎发育过程及其主要特点。 【学习重点】 1.受精过程。 2.早期胚胎发育过程及主要特点 【学习难点】 早期胚胎发育过程及主要特点 受精作用 1．场所： 。 2．过程： （1）准备阶段： ①准备阶段1 精子 ； 精子必须在 发生相应生理反应后，才获得受精能力。 ②准备阶段2 卵子的准备 在（ ）内达到 期时，卵子才具备与精子受精的能力。 （2）受精阶段 ①精子穿越 和 首先发生 反应，是顶体内的 释放出来，直接溶解卵丘细胞间的物质，穿越放射冠。 穿过放射冠的精子立即与 接触， 随后将透明带溶出一条孔道，精子借自身 穿越透明带。 精子触及卵黄膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，这个反应叫 做 反应，它是防止多精入卵受精的第一道屏障。 ②精子进入 卵黄膜表面有大量的 ，能抱合精子，随后，精子外膜与卵黄膜融合，精子入卵。精子入卵后，卵黄膜会立即产生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，这种生理反应称 作 作用，这是防止多精入卵受精的第二道屏障。 ③ 形成 a ．雄原核的形成：精子 脱离，并且原有的 破裂，随后，精子形成一个比 原来精子还 的核，叫做雄原核。 b ．雌原核的形成：精子入卵后，卵子被激活，完成 分裂，排出 后， 形成雌原核，雌原核一般略 于雄原核。 ④配子结合 胚胎发育 一、 探究问题 1. 发生受精的部位在哪？描述受精的各个阶段的特征？ 2,受精卵发育的部位在哪里？受精卵形成早期胚胎经历哪些阶段，每一阶段有什么特点？ 二、 课堂检测
胚胎干细胞体外诱导分化综述
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
小鼠胚胎冷冻方案
药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10，见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。
胚胎干细胞的组蛋白修饰(二)
一、即将表达基因启动子中的组蛋白修饰 研究显示，在人类胚胎干细胞中有3/4基因启动子区的组蛋白被活化修饰，并通过DNA聚合酶Ⅱ起始转录。但是只有其中的一半能够生成可检测到的转录本。例如，H3K4me3出现在胚胎干细胞大约80％的启动子区。其中的许多区域并不能产生目前技术可检测到的全长转录本。在许多情况下这些启动子区也会有抑制性表观遗传标记H3K27me3，表现为二价性。染色质二价域多与胚胎干细胞中的分化相关基因关联，在上文中我们已经讨论过这一点(图3—4)。 有趣的是，大约一半的二价染色质域都有三个转录因子0ct4、Nanog、Sox2中至少一个转录因子的结合位点。二价染色质域多有PcG结合。然而，尽管胚胎干细胞中PRC1和PCR2会同时出现在许多启动子区，也有一些启动子只有一个复合物。在胚胎干细胞中，根据PRC1、PCR2同时出现或只有PCR2出现，可将二价染色质域分为两类。有趣的是，出现两种复合物的启动子区可以在分化过程中有效地保持PcG介导的染色质结构。非典型性PCR2同样也出现在人类胚胎干细胞中。这种复合物中包含EZH1——一种EZH2的同源物。含有EZH1的复合物选择性调控发育相关关键基因，抑制这些基因的表达可以阻止胚胎干细胞的分化。 基因功能丧失实验证实PRC2(和H3K27me3)在胚胎干细胞中发挥着至关重要的作用。PRC2成分的缺失可以导致胚胎干细胞分化缺陷。然而，纯合删除Eed、Suz12或Ezh2后，小鼠囊胚中仍可分离出胚胎干细胞并能够在体外传代。最近对Jarid2(与Jarid1家族密切相关)的研究显示Jarid2能调控PRC2的催化活性及其定位，从而可以精细调控H3K27me3水平。已知Jarid2在胚胎干细
胚胎干细胞基因表达
胚胎干细胞基因表达 关键词：假单胞菌,培养基,平板,atcc,北京标准物质网 一、即将表达基因启动子中的组蛋白修饰 研究显示，在人类胚胎干细胞中有3/4基因启动子区的组蛋白被活化修饰，并通过DNA聚合酶Ⅱ起始转录。但是只有其中的一半能够生成可检测到的转录本。例如，H3K4me3出现在胚胎干细胞大约80％的启动子区。其中的许多区域并不能产生目前技术可检测到的全长转录本。在许多情况下这些启动子区也会有抑制性表观遗传标记H3K27me3，表现为二价性。染色质二价域多与胚胎干细胞中的分化相关基因关联，在上文中我们已经讨论过这一点(图3—4)。 有趣的是，大约一半的二价染色质域都有三个转录因子0ct4、Nanog、Sox2中至少一个转录因子的结合位点。二价染色质域多有PcG结合。然而，尽管胚胎干细胞中PRC1和PCR2会同时出现在许多启动子区，也有一些启动子只有一个复合物。在胚胎干细胞中，根据PRC1、PCR2同时出现或只有PCR2出现，可将二价染色质域分为两类。有趣的是，出现两种复合物的启动子区可以在分化过程中有效地保持PcG介导的染色质结构。非典型性PCR2同样也出现在人类胚胎干细胞中。这种复合物中包含EZH1——一种EZH2的同源物。含有EZH1的复合物选择性调控发育相关关键基因，抑制这些基因的表达可以阻止胚胎干细胞的分化。
基因功能丧失实验证实PRC2(和H3K27me3)在胚胎干细胞中发挥着至关重要的作用。PRC2成分的缺失可以导致胚胎干细胞分化缺陷。然而，纯合删除Eed、Suz12或Ezh2后，小鼠囊胚中仍可分离出胚胎干细胞并能够在体外传代。最近对Jarid2(与Jarid1家族密切相关)的研究显示Jarid2能调控PRC2的催化活性及其定位，从而可以精细调控H3K27me3水平。已知Jarid2在胚胎干细胞和诱导多能干细胞中高表达并对分化至关重要，但似乎与胚胎干细胞的自我更新无关。 最近，有表观遗传学研究试图鉴定H3K4me3、H3K27me3之外的二价染色质域。目前已经在胚胎干细胞编码发育调控因子的二价启动子区域中鉴定出了 H3K9me3。但截止到目前，还没有能够成功鉴定出这种三价染色质结构。同样，有报道称组蛋白异构体H2A．Z可与PcG蛋白共定位，并与PCR2成分Suz12相互作用。但使用人类细胞(U2OS)的另一实验却证明没有被转录的常染色质基因的启动子区不存在H2A．Z。 在人类胚胎干细胞中，除了H3K4me3组蛋白修饰会同时出现在活化或失活基因启动子区外，H3K56ac也有类似的分布。有趣的是，与H3K4me3相比，NANOG、SOX2和OCT4与H3K56ac结合更加紧密，说明H3K56ac参与多能性相关核心调控网络。当然，这还需要进一步功能研究予以证实。 二、基因沉默相关的组蛋白表观遗传学标记 包括转座子和重复元件在内的基因沉默相关区域通常具有抑制性组蛋白修饰，包括H3K9me3和H4K20me3。H3K64me3(H3K64位于H3组蛋白的球状结构域)是一个新鉴定出的抑制性修饰，多位于着丝点周围异染色质。有趣的是，与分化细胞相比，H3K64me3在小鼠胚胎干细胞中水平较高，这说明分化过程中重复序列的表观遗传学修饰与胚胎干细胞的可塑性相关。 功能性研究进一步证实了这些组蛋白修饰在胚胎于细胞中的重要性。一方面，失去H3K9甲基转移酶Suv39h的小鼠胚胎干细胞中会有大量的重复序列相关转录本产生。另一方面，H3K9去甲基化酶Jmjd1a和Jmijd2c被认为是Oct4的靶基因。在胚胎干细胞中抑制Jmjd1a／2c的表达会导敛细胞分化拨 H3K9me2／3的升高，傥明返网个去甲基化酶及H3K9甲基化水平与多能性的维持相关。
胎儿唇腭裂的B超诊断
胎儿唇腭裂的B超诊断 发表时间：2010-08-25T16:16:08.577Z 来源：《中外健康文摘》2010年第16期供稿作者：赵梦丹[导读] 三维超声在唇裂诊断更直观，更一目了然。但其受影响的因素较二维超声更多。 赵梦丹（黑龙江省青冈县第三人民医院 151600） 【中图分类号】R714 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)16-0111-01 【摘要】唇腭裂是较常见的胎儿先天畸形，发病率约为1%。据近几年的出生缺陷监测资料统计，唇腭裂畸形已上升为胎儿畸形的首位，所以产前对胎儿唇腭裂的诊断尤为迫切，而超声是产前诊断胎儿唇腭裂的首选方法.以前由于受仪器分辨力的限制和超声诊断医生的认识不足，一般认为诊断不易，近年来随着仪器质量的改善和超声诊断医生的水平提高，唇腭裂的产前诊断已成为可能.本文通过我院B超诊断的8例唇腭裂胎儿的声像进行回顾性总结分析，旨在探讨其超声扫查技巧及声像图表现特征. 【关键词】唇腭裂 B超诊断 唇腭裂是最常见的颜面部畸形，其发生率有明显的种族差异，按出生人口统计，美国印第安人最高约3．6％。，其次为亚洲人1．5％～2‰。白人约l‰，黑人约0．3‰。我国最近统计资料为1．8‰。胎儿唇腭裂的发生率可能更高，因为合并有致死性染色体畸形或其他解剖结构畸形病例未能统计在内(28周以前即流产)。资料表明约50％为唇裂合并腭裂，约25％为单纯唇裂，25％为单纯腭裂。单侧唇腭裂(约占75％)多于双侧，左侧多于右侧，左右侧之比为4：1。唇裂患者无论伴有或不伴有腭裂，大多数病例(80％左右)不合并其他畸形，但有20％的患者出现在100多种基因综合征中；单纯腭裂则不同，约50％常合并其他畸形，常并发于200多种基因综合征。可以是常染色体显性、隐性遗传，也可以是X染色体连锁显性或隐性遗传。1％～2％有染色体异常(主要为18-三体和13-三体)，约5％与致畸物有关。正中唇裂约占所有唇裂病例的0．5％，常与全前脑或口-面-指综合征有关。 一临床资料 自1999年2月至今我们利用二维超声或彩超对20周以上的妊娠妇女8180例进行了胎儿唇部的常规检查。本组20~35周5180例胎儿唇部清晰显示，超声显示率为100%，35~40周3000例胎儿唇部显示清晰，超声显示率为84%。共查出唇腭裂8例，发生率0.1%，其中唇裂3例，唇腭裂5例，均经引产证实。漏诊1例，为单侧不完全唇裂，足月分娩证实。 二超声图像特点 (1)单纯唇裂：主要在胎儿颜面部冠状切面和横切面上观察，表现为一侧或双侧上唇连续性中断，中断处为无回声带，无回声带可延伸达鼻孔，引起受累侧鼻孔变形、变扁。单侧唇裂时，两侧鼻孔不对称常为Ⅲ度唇裂；如果鼻孔两侧对称、鼻孔不变形、唇裂裂口未达鼻孔者则多为Ⅱ度唇裂；仅在唇红部显示中断者为I度唇裂。I度唇裂因裂口小常漏诊。经鼻孔矢状切面正常曲线形态失常，在上唇裂裂口处上唇回声消失。 (2)单侧完全唇裂合并牙槽突裂或完全腭裂：除上述唇裂征象外，上颌骨牙槽突回声连续性中断，正常弧形消失，在裂口中线侧牙槽突常向前突出，而裂口外侧牙槽突则相对后缩，在横切面上可见“错位”征象。乳牙列在裂口处排列不整齐，乳牙发育可正常，也可伴邻近乳牙发育异常，如乳牙缺如或乳牙增多。牙槽突裂的裂口处一般在侧切牙与犬牙之间裂开(原发腭与继发腭之间未能正常融合)。 (3)双侧完全唇裂合并牙槽突裂或完全腭裂：双侧上唇、牙槽突连续性中断，在鼻的下方可显示一明显向前突出的强回声块，该强回声浅层为软组织(上唇中部及牙龈)，深层为骨性结构(前颌突)，这一结构称为颌骨前突。颌骨前突在正中矢状切面最明显。 (4)单纯不完全腭裂(不伴唇裂和牙槽突裂)：在超声图像上难以显示出它的直接征象，由于腭的走向为横向走行，其前方与两侧均有上颌骨牙槽突的遮挡，超声不能穿透骨性牙槽突，在牙槽突的表面几乎产生全反射，其后方为声影，硬腭与软腭正好处于声影区内，因而硬腭与软腭在冠状切面、矢状切面和横切面都难以直接显像，因此，腭裂的裂口亦难以通过这些切面直接显示出来。 (5)正中唇腭裂：正中唇腭裂常发生在全前脑和中部面裂综合征，两者在面部超声特征的明显区别是前者眼距过近，而后者眼距过远。正中唇腭裂在超声图像上表现为上唇及上腭中部连续性中断，裂口宽大，鼻结构明显异常，常伴有其他结构的明显异常。 (6)不规则唇裂：不规则唇裂多与羊膜带综合征有关，常表现为面部及唇严重变形，裂口形态不规则，形状怪异，裂开的部位亦不寻常，可发生在唇的任何部位。此外，除上述裂畸形外，常可检出胎儿其他部位，包括头部、躯干、肢体等部位的明显异常，如不规则脑或脑膜膨出、腹壁缺损、缺肢、缺指(趾)等。常有羊水过少。 三维超声在唇裂诊断更直观，更一目了然。但其受影响的因素较二维超声更多。影响二维超声观察的因素同样影响三维超声，此外，三维超声要求胎儿面部有更多的羊水衬托，且对胎儿体位要求更高，医师的扫查手法亦直接影响三维超声重建图像的质量，仪器三维重建各参数的调节也是影响图像质量的一个重要因素。对于图像质量不佳的三维超声图，诊断唇裂应特别小心。 三临床意义 不伴其他结构畸形的单纯唇腭裂预后较好，可通过手术修补治愈。但正中唇腭裂及不规则唇裂常预后不良。唇腭裂伴有其他结构畸形或染色体异常者，其预后取决于伴发畸形的严重程度。 参考文献 [1]李胜利主编.胎儿畸形产前超声诊断学.北京：人民军医出版社，2004.445. [2]薛俊山，薛亚男，刘彦伟.胎儿上唇裂及上唇裂伴腭裂畸形的超声诊断.2005; 21(6):474～475.
小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究
江丙农业学报2010，22(12)：144～146 A c t a A g r i c uhu r ae J i an gxi 小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究 林峰，陈玉霞+，孙克宁，杨婷，田晓军 (河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002) 摘要：为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响，分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明：子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P<0．01)，而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P< O．05)，两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P>0．05)，说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著，且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明：超排处理后，在公母鼠合笼后76～79．5h采胚，胚胎大多处于桑椹胚期，而在公母鼠合笼后88～91．5h采胚，胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期；采用TC M l99+15％胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。 关键词：小鼠；超数排卵；早期胚胎；体外培养；冲胚方法 中图分类号：Q132．8文献标识码：A文章编号：1001—8581(2010)12—0144—03 St udy on E f f ect of Super ovul a t i on and i n vi t r o C ul t ur e of Ear l y Em br yo i n M ous e LI N Fe n g，C H E N Y u—xi a‘，SU N K e—ni ng，Y A N G Ti ng．T I A N X i ao—j u“ (C ol l ege of A n i m a l H us ba ndr y a nd V et er i nar y M e di ci ne，H enan A矛c ul t ur al U ni ver si t y．Z he ngzhou450002，C hi na) A bs t r act：I n t hi s paper．t he e ffe c t of dif f erent m e t h ods of c o l l ec t i n g e m br yos on t he s uper ovul at i on of m i c e w a s s t udi ed，and t he e m br yos i n t he suoer ovul at ed m i Ce w er e coll ected by usi ng t he ut erus—m i nc i ng m e t ho d a nd ut er us—col l ect i ng m e t hod re s pec t i ve l y．ne r es ult s show e d t ha t t he aver age num ber of eggs and em bryos obt ai ned by t he ut er us—co l l ect i ng m e t ho d w er e,ext r em el y s ignif i ca ntl y hi gher(P<0．01)t han t hos e obt ai ned by t he ut e r us—m i nci ng m e t hod，an d t he aver age nu m ber of us abl e em bryos obt ai ned by t he u t e r r us—coll ect i ng m e t he d w强si gni f i cant l y hi gher(P<0．05)t han t ha t di d by t he ut erus—m i nc i ng m et hod．ne aver age num be r of an-fe r t i l i zed eggs obt ai ned by t hes e t w o m e t h ods w a s no t s ignif i cant ly di f f er e nt(P>O．05)．So t he s uper ovu l at i on e ffe c t of m i c e W a S s i g-nif i e ant lv i nnue nee d by t he m e t ho d of coll ect ing em bryos．T he obs er vat i on r es ult s of ear l y e m br yos de vel opm ent i ndi cat ed t hat m ost of t he em bryos coll ected76—79．5hour s aft er com bi ni ng cages w e r e at m or ul a s t age．w hi l e m os t of t}l e em bryos coll ected88～91．5 hour s a ft e r com bi ni ng cages w e r e a t com pa ct e d m or u l a s t a ge and bla s t o e yst s t ag e．I t W a S f eas i ble t ha t t he em bryos of m i c e w er e cul t i—vat ed i n vi t ro by usi n g t he m i xed s o l ut i o n of T C M l99and15％F C S． K e y w or ds：M ouse；Sup er ov ul at i on；E ar l y em br yo；I n vi t ro cul t ur e；M e t hod of coll ect ing em bryos 雌性哺乳动物一生所产的卵子总数早在其胚胎发育形成卵巢的过程中已被确定，成熟卵子在成年后的发情周期中分别排出，但是单纯依靠动物的自然排卵，一方面所得到的卵母细胞数或胚胎数较少，另一方面又消耗大量的时间和浪费较多的动物．因此为了获取大最的胚胎，多采用超数排卵的方法，即利用外源性促性腺激素诱发多个卵泡同时发育并排出具有正常受精能力的卵子¨。1。该技术大幅度地开发利用了卵巢上的卵母细胞资源，为胚胎工程和转基因动物等相关领域的研究提供了大量的研究素材。小鼠具有个体小、生长快、繁殖力强等特点，是畜牧兽医科学研究领域应用最为广泛的实验动物，研究小鼠超数排卵对动物胚胎工程等研究具有重要意义。 近年来，随着遗传工程小鼠的大量开发，人们对小鼠卵母细胞和胚胎的需求量日趋增多，因而完善的超数排卵技术是遗传工程小鼠研究获得成功的重要前提条件。到目前为止，能够获得大量胚胎来源的技术仍为超数排卵。超数排卵反应是一个极其复杂的生理过程。研究资料表明，小鼠超排效果受激素的种类、剂鼍以及动物的生理状态等多种因素影响，这些因素错综复杂，使超数排卵效果很不稳定H—o。为了进一步研究冲胚方法对超数排卵的影响及小鼠冲胚的有效方法，本试验在控制以上因素一致的条件下，采用两种不同的冲胚方法来进行对比，以期为今后的小鼠超数排卵研究提供一定的参考依据，为胚胎生物技术研究提供借鉴。 l材料与方法 1．1试验地点和时间本试验于2009年l O月16日至2010年5月27日在河南农业大学牧医工程学院胚胎生物技术研究室进行。 1．2试验动物 1．2．1试验动物的条件试验用昆明小白鼠购于河南省实验动物中心。雌性小鼠(未经产)为17周龄、体重30 收稿日期：2010一 基金项目：河南省重点科技攻关计划项目(82102130005)；河南省蕈大科技攻关计划项目(0422011200)。 作者简介：林峰(1972一)。男．山东栖霞人．副教授，博士，主要从事动物胚胎生物技术研究。通讯作者：陈玉霞。
胚胎干细胞
胚胎干细胞 胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs，简称ES或EK细胞。）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。ES细胞将会给人类移植医学带来一场革命。 一、ES细胞的生物学特性 ES细胞的形态学特征 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。 ES细胞的分化 ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），而且可以检查到OTC4基因的表达，这两种蛋白是发育全能性的标志。ES细胞的多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。 二、胚胎干细胞的发展现状 国内的现状 我国的科研工作者在80 年代中期建立了小鼠的胚胎干细胞(ES)系. 应用建立起来的胚胎干细胞系, 科学家们研究了小鼠胚胎干细胞系的分化与胚胎发育有重要关系的基因, 还 对胚胎干细胞中特定的功能基因进行了定向敲除. 尤其值得一提的是早在1998 年, 我国的科研人员就已经分离并培养出人类胚胎干细胞, 并先后将其诱导形成了浆细胞造血干细胞. 1999 年, 小鼠EG 细胞系在上海建立. 目前, 造血干细胞移植已经被应用于临床,相关的基础研究工作也在进行中. 另外，中国军事医学科学院的研究人员发现了“人胚胎干细胞分泌素”，经过内地、台湾地区两万病例的临床应用后，这项成果不久前在中、美两国科学院联合举办的“中美前沿科学研讨会”上正式向全世界发布人胚胎干细胞已被证实的功效有：刺激骨髓造血，刺激红细胞增生，可用于再生障碍性贫血的治疗；刺激白细胞再生，可综合提高人体免疫力，可望用于艾滋病的治疗；可改善脑组织代谢功能，加快脑血管意外后遗症的恢复等。我国的学家成功地在世界上首次利用原位干细胞在体外合成胃肠器官组织。这项生命科学新技术刚刚在美国申请了专利。 三、人类胚胎干细胞研究发展的瓶颈 人类胚胎干细胞研究已有几十年，然而却一直没有突破性的进展，近日Nature Biotechnology8月刊发表了一篇报告文章，解析了近些年人类胚胎干细胞研究受阻的主要原因。文章报告称，由于科学家们长久以来对胚胎干细胞的研究就依赖于两株人类胚胎干细胞系，因此，这样的困境阻碍的人类胚胎干细胞研究朝着多样化，丰富化的方向发展。正是由