大白菜渗透压应激活化蛋白激酶基因SRK2F的克隆与表达

周志国,男,讲师,专业方向:蔬菜作物生物技术育种,E-mail:zhiguo__zhou@http://m.wendangku.net/doc/11efd995227916888486d7c6.html

收稿日期:2014-07-05;接受日期:2014-08-25基金项目:河北省科技计划项目(12226306)

大白菜渗透压应激活化蛋白激酶基因

SRK2F 的克隆与表达

周志国 王聪艳

(廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000)

摘 要:以不耐盐、不耐旱的大白菜自交系SY-14-06为试材,提取根部总RNA,反转录为cDNA。根据大白菜SRK2F 基因设计引物,PCR 扩增SRK2F 基因CDS 序列1 044 bp。SRK2F 编码347个氨基酸,预测分子量为39.3 kD,理论等电点为4.88。利用pEASY-E1原核表达载体构建原核表达质粒pEASY-E1-SRK2F,转化表达菌株Transetta(DE3),通过SDS-PAGE 检测该蛋白的表达。经Smart-embl 预测其具有丝/苏氨酸激酶特有结构域,位于第4~260位氨基酸处。经ClustalX2比对,其与拟南芥同源性最高。最后利用镍离子金属螯合亲和层析介质对该蛋白进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。关键词:大白菜;SRK2F ;序列分析;蛋白表达纯化

干旱、寒冷、高盐等环境因素都会对植物产生胁迫作用,导致植物的离子动态平衡被打乱,出现氧化损伤和生长抑制。了解植物如何应对外界环境的胁迫作用是提高植物抗性的关键。多种蛋白激酶已被证实参与植物对外界胁迫因素的应激。大量研究已经阐明胁迫应答基因表达和该机制中操纵胁迫应答基因的转录因子在植物逆境生理过程中发挥着重要作用,如脱水应答元件结合因子〔DREB-C-重复结合因子(CBF)〕(赫卫 等,2014),但转录因子的应答方式及其上游应激蛋白表达机理仍不十分清楚;蛋白激酶途径也可以在外界胁迫因素的调节中发挥作用,研究较多的是渗透压感应通路丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),在拟南芥、马铃薯、苜蓿中MAPK 可被高盐、干旱或寒冷等外界因素激活(Sinha et al.,2011)。Mizoguchi 等(2000)利用酵母双杂交技术研究了MAPK 级联信号通路途径,包括AtMPK4、AtMEK1(MAPKK)和AtMEKK1;此外,SNF-1相关蛋白激酶2(SnRK2)也是一个重要的信号通路(Umezawa et al.,2004)。在拟南芥中SnRK2家族主要由10个成员组成,为

SnRKA-J(Boudsocq et al.,2004)。最初,SnRK2家族被认为是蚕豆在受到脱落酸(ABA)刺激后气孔关闭的核心调节因子,被定义为AAPK(ABA-activated protein kinase,脱落酸活化蛋白激酶)(Li & Assmann,1996)

。而近年来发现在马铃薯和黄豆中SnRK2的一些成员在高渗条件下也可被激活(边鸣镝 等,2008)。在水稻SnRK2家族的10个成员中,3个可以被外源ABA 和渗透压胁迫激活,而其他成员均可被渗透压胁迫激活(Fahey et al.,2002;Fourquin et al.,2005)。这些研究都说明SnRK2家族可能在渗透压应激激活中起到非常重要的 作用。

随着SnRK2家族被越来越多的人所重视,其各个成员的功能也逐渐被研究。如SnRK2C 在拟南芥中高表达可以提高植株对干旱的抗性(Fenwick et al.,1983;Wang et al.,2011;Chandna et al.,2012)。SnRK2C 与SnRK2F 可以协同调节干旱诱导基因的表达(van der Rhee et al.,1990;Uknes et al.,1993;Wittstock & Halkier,2002;Wentzell et al.,2007;Samuel et al.,2009)。本试验在前人研究的基础上,根据大白菜SnRK2家族成员SRK2F 序列设计引物,从大白菜中克隆SRK2F 基因,进一步进行序列分析及同源性对比,结合原核表达及蛋白纯化技术,为大白菜中SRK2F 基因研究及其

大白菜渗透压应激活化蛋白激酶基因SRK2F的克隆与表达

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