天然产物有效成分的分离的一些思路

天然产物有效成分的分离与应用

绪论

◆定义：天然产物是包括了存在于陆生动植物、海洋生物和微生物体内各类物质成分，甚至还可以包括人与动物体内许多内源性成分。

◆有效成分（active compound）在药理学和生理学角度来看是指具有生物活性的物质，这种物质在化学上能用分子式或结构式来表示，并且有一定的物理常数。

◆天然产物有效成分研究的目的

（1）从天然产物中寻找新药先导物，进而开发成药物，是创新药物研制的突破口。

★中国于1969年开始抗疟药研究。历经380多次鼠疟筛选，1971年10月取得中药青蒿素筛选的成功。1972年从中药青蒿素中分离得到抗疟有效单体，命名为青蒿素，对鼠疟、猴疟的原虫抑制率达到100%。

1973年经临床研究取得与实验室一致的结果、抗疟新药青蒿素由此诞生。

1981年10月在北京召开的由世界卫生组织主办的“青蒿素”国际会议上，中国《青蒿素的化学研究》的发言，引起与会代表极大的兴趣，并认为“这一新的发现更重要的意义是在于将为进一步设计合成新药指出方向”。

1986年，青蒿素获得新一类新药证书，双氢青蒿素也获一类新药证书。这些成果分别获得国家发明奖和全国十大科技成就奖。

2011年9月，中国女药学家屠呦呦因创制新型抗疟药———青蒿素和双氢青蒿素的贡献，获得被誉为诺贝尔奖“风向标”的拉斯克奖。这是中国生物医学界迄今为止获得的世界级最高级大奖。

★青蒿素的发现是许多人分工合作、相互竞争的结果，究竟谁的功劳大，至今争论不休。不过，大家都公认屠呦呦起到的关键作用就是发现青蒿素受热就失去活性，想到了要用乙醚提取。屠呦呦称，她是在东晋葛洪《肘后备急方》一书中看到“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”的说法，才恍然大悟不能加热青蒿。由于这个故事，人们会说青蒿素的发现至少受到了中医的启发，葛洪也因此成了“东晋名医”。其实葛洪是个炼丹的术士，《肘后备急方》则是收集民间的偏方，并没有用到阴阳五行、辨证配伍，与中医中药没有关系。

青蒿素是文革期间集中全国力量用人海战术研发出来的。动用了数十个单位的500多名科研人员，用5年的时间筛选了4万多种化合物和草药，最后才很偶然地发现了青蒿素。中医和中医典籍提供的众多药方没有派上用场，和拿着一本《中国植物志》一个一个往下筛选的效率差不多。有人从青蒿素的发现认识到“中药是尚未充分开发的宝库”，中药中当然完全可能含有某些还未被挖掘出来的化学药，但是青蒿素的发现过程恰恰说明想从中医典籍无数以讹传讹的记载中找到真正有用的药物极为困难，效率非常低下，而且要靠运气。屠呦呦课题组搜集了808个可能抗疟的中药，而同时的云南小组搜集的中草药单方、验方竟多达4300余个。

这么多的偏方正说明没有哪个有突出的效果，否则就都用它了。而当时的实验也证明它们无一有效。

青蒿素发现之后的40年间，虽然有无数的科研人员试图从草药中再创奇迹，却再也没能找到第二种能被国际公认的新药，也就并不奇怪了。

（2）开发保健食品，保健食品中应含有保健功能作用的一种或多种功效成分，功效成分的来源一般而言都是来自天然产物。

银杏胶囊由高品质银杏叶提取物（GBE-HP）银杏黄酮甙≥30%总萜内酯≥10%精制而成，不但对“三高”人群效果显著，可以调节血脂、软化血管、降血压，而且可以改善大脑功能，减轻头痛、耳鸣、晕眩、健忘、多梦、手脚冰凉等症状；增强记忆力，预防老年痴呆症；抗血小板活化因子，清除致癌因子；润肤祛斑、养颜美容、延缓衰老。

我国保健（功能）食品的兴起是在20世纪80年代末90年代初，经过一、二代的发展，也将迈入第三代，即保健食品不仅需要人体及动物实验证明该产品具有某项生理调节功能，更需查明具有该项保健功能因子的结构、含量、作用机理以及在食品中应有的稳定形态。

◆学科特点：

1、天然产物有效成分的分离涉及许多学科，从应用的角度我们把它看成是生物技术的一个重要领域。

2、复杂性

生物材料组成复杂，种类繁多，还有相当多的化合物目前还是未知物质；有些目标化合物在材料中的含量极微小（例如脑垂体组织提取的某些激素的释放因子；从蚕体中提取的信息激素，从竹笋中提取的竹笋素，都是用几吨或几十吨原料才提取出几个毫克的目的物）

天然产物还具有不稳定性，许多具有生理活性的化合物一旦离开机体就会变性，破坏。因此，在生产过程中应根据目的物的性质，采用温和的条件，在洁净的环境和较低的温度下进行分离；一般来说，为了保护所提取物质生理活性及结构上的完整，分离的方法多采用温和的“多阶式”，一个分离方法常常少则几个步骤，多至十几个步骤，并不断变换各种分离方法，操作时间长，工艺复杂。

◆天然产物开放利用概况

1、天然产物在医药业的开放利用概况

目前天然产物发展最为活跃的领域就是制药领域，对于天然产物的研究成果来说，它所得到的活性物质结构新颖、疗效高、副作用小，所以它始终是制药工业中研究新药的主要源泉，它所显示的化学结构是新药设计的主要模型，当然分离所得的活性物质也可以直接用于医药生产。比如：抗癌新药——紫杉醇、羟基喜树碱等。

2、天然产物在食品行业的发展概况

天然产物在食品中的应用由来已久，卫生部公布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中规定了87种药食同源食品，这些物品既可以作为食品也可以作为药品，是在长期的实践中总结而得，它们所含有的功能性天然产物其作用已被广泛认同。目前天然产物在食品中的应用一方面集中在食品原辅材料的生产，比如生产柠檬酸、苹果酸等有机酸，生产各种天然色素和香精等等，他们往往是食品工业和现代生物技术产业结合的产品，拥有着非常广泛的应用前景和开发潜力；另一方面则集中在功能性食品的开发，但这种开发不仅需要人体及动物实验证明产品的生理功能，而且还需进一步查清具有该功能的功能因子及其结构、含量、作用机制和在食品中的稳定性。所以对于功能食品开放而言，单纯的添加某种功能成分的意义是不大的，这也会影响使用的效果和消费者的信心，规范、科学的进行功能性食品开发还需要大量的工作。

◆天然产物分离提取工艺设计策略

1、生物原料生产和天然产物提取技术结合

生物原料的生产是天然产物提取生产的第一工厂，培养高含量的天然产物原料可以起到事半功倍的作用，在很多时候也是产业是否可以发展的前提。微生物菌种的选育以及生物催化剂、诱导剂的使用是天然产物提取上游工程的主要工作之一。总的来说，希望原料的有效成分含量高，避免在原料生产过程中引入酵母膏、杂蛋白为原料，减少下游加工过程的工作，同时选择适当的工艺，这些都是发展天然产物生产的有利条件。

2、根据生物原料的物质组成和天然产物结构设计提取工艺

生物原料中的物质组成及天然产物的空间结构、官能团种类、位置、数量、存在的形式决定了提取工艺所选用的方法，尤其应该注意的是天然产物存在

于一个有机整体中，组成各部分之间往往相互制约和影响，这对提取工艺有很大的影响。

3、根据不同分离技术耦合设计天然产物提取工艺

近年来，随着技术的发展，天然产物加工过程发展的一个主要倾向是多种分离、纯化技术相结合，也包括新老技术的相互交叉、渗透与融合，比如萃取技术可与多种分离技术耦合衍生出新型的分离技术，如微胶囊萃取、凝胶萃取、乳化液膜萃取等，这类技术具有选择性好，分离效率高，下游加工过程步骤简化，能耗低，加工过程水平高等优点，是今后研究的一个主要发展方向。

4、提取过程前后阶段的纵向统一

在天然产物提取分离中应选择不同分离机理单元组成一套工艺，应将含量多的杂质先分离出去，尽早采用高效分离手段，而将最昂贵费事的分离单元放在最后阶段。有些杂质引起的分离纯化困难可通过前后协调巧妙解决。如萃取时常产生乳化现象，本质上是表面活性剂引起的，其实蛋白质是溶液中最容易引起乳化的，故可在萃取前，通过加热、絮凝、金属离子沉淀、水解酶等预先除去蛋白。分离操作中的絮凝、沉淀、萃取等，既要考虑分离剂的回收，又要考虑对后续操作及产品质量的影响，如反复通过匀浆阀或长时间破碎虽然可以提供胞内物的释放率，但产生的碎片不利于后续的分离。在纵向工艺中要考虑不同操作单元所用方法和操作条件的耦合，如在提取液中为了除去不同的杂蛋白，可以采用不同的PH作为工艺参数处理提取液，以除去碱性或酸性蛋白，还可以采用冷热处理构成一套工艺，还可以选用阳离子和阴离子交换树脂构成一套工艺来除去杂蛋白。

总之，天然产物提取的每步操作主要目的是①减少产品体积②提高产品纯度③增加后续操作效率。原料的选择与处理是为固液分离、初步纯化等服务，初步纯化是为高度纯化提供合适的材料，减少提取分离步骤和增大单步效率是减少后期工艺难度乃至降低生产成本的关键，提取工艺过程的不同阶段通过各种参数存在密切的相互作用和协调、耦合来纯化天然产物，形成一套完整的提取工艺。

◆设计天然产物产品加工过程的原则

1、采用步骤最少。天然产物的分离纯化都是多步组合完成的，理论上每一步的组合都会影响到产品的回收率以及操作的成本，不能将过程中的每一步分裂开来讨论，而应从工艺路线综合考虑。比如说，某种天然产物可以用两种工艺来分离纯化，一种是吸附加上三步结晶和重结晶，另一种是高压液相色谱和结晶，虽然HPLC的操作成本很高，但由于它减少了分离步骤，提高了产品的回收率，所以综合来看，由提高回收率而得到的效率大大的超过了增加的成本。

2、采用步骤的次序要相对合理。在对天然产物进行初步纯化的过程中，对于不同特性的产品，具有不同的纯化步骤。比如说，对蛋白质和酶的分离纯化方法有很多，但在处理时一般会按如下的顺序：匀质化（或细胞破碎）、沉淀、离子交换、亲和吸附、凝胶过滤，对于这个顺序，我们的理解是沉淀能处理大量的物质，并且它受干扰物质影响的程度比吸附或色谱分离小；离子交换用来除去对后续分离产生影响的化合物；亲和技术常在流程的后阶段使用，以避免因非专一性作用而引起亲和系统性能降低；凝胶过滤用于蛋白质聚集体的分离和脱盐，由于凝胶过滤介质的容量比较小，故过程的处理量小，一般在纯化过程的最后一道处理中被使用。

3、产品的规格产品的规格是用产品中各类杂质的最低存在量来表示，它是确定纯化要求的程度以及由此进行加工过程方案设计的主要依据。如果只要求产品的低度纯化，那么在大多数情况下简单的分离过程就可以达到目的；但是对于一些高度的纯化，比如说注射类的药物产品，则会要求精细的分离方法（如凝胶渗透层析法）。

4、进料的组成进料的组成是影响分离过程的主要因素。一般来说，高浓度的目标产物意味着分离过程可能相对简单；在物料组成中，若存在某些化合物与目标产物非常类似，则表明需要一个非常专一性的分离过程或者要求进料流中含有的某些组分必须在分离的早期就全部除去或要求它的浓度低于限值；如果进料的组成是含丝状微生物的悬浮液，则过滤是合适的单元操作，但中空纤维过滤系统由于通道狭窄容易堵塞则不适宜，同样，含有高浓度干物质的发酵液或高粘度的培养液，因为粒子沉降性能差，所以也很难用离心法处理。

5、产品的稳定性通常用调节操作条件的办法，使由于热、PH或氧化所造成的产品降解减少到最低程度。比如一些天然产物含有羟基和不饱和键等基团，一些蛋白质活性点或活性基团均存在巯基，为了防止在分离过程中氧化破坏，可以在工艺中设计排除空气或加入抗氧化剂。

◆天然产物分离提取后续工艺思路

1、从天然产物中分离得到的产物需要进行定性定量分析，如果是已知的物质，可以通过化学鉴别法、光谱鉴别法和色谱分析法与标准品进行鉴定。如果是未知物，需进行分级结构的研究。

2、天然产物中提取分离的有效成分经检测、鉴定后作用于人体需要经过严格的毒理学安全性评价、药效性和功能性评价。

3、从天然产物中提取的有效成分需经过非临床试验证明其毒理学安全性后，才能通过动物实验和人体试验验证其功效性。

◆功能性食品

强调其成分对人体能充分显示机体防御功能、调节生理节律、预防疾病和促进康复等功能的工业化食品。

◆保健食品

具有特定保健功能的食品，适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗为目的，具有食品的属性，要求无毒、无害，达到应有的营养要求，经得起科学验证，有明确和具体的保健功能。

见PPT

◆保健食品的分类

（一）根据消费对象进行分类

1．日常功能性食品

它是根据各种不同的健康消费群（如婴儿、学生和老年人等）的生理特点和营养需求而设计的，旨在促进生长发育、维持活力和精力，强调其成分能够充分显示身体防御功能和调节生理节律的工业化食品。它分为婴儿日常功能性食品、学生日常功能性食品和老年人日常功能性食品等。

（1）婴儿日常功能性食品

应该完美地符合婴儿迅速生长对各种营养素和微量活性物质的要求，促进婴

儿健康生长。

（2）学生日常功能性食品

应该能够促进学生的智力发育，促进大脑以旺盛的精力应付紧张的学习和生活。

（3）老年人日常功能性食品

应该满足以下要求：即足够的蛋白质、足够的膳食纤维、足够的维生素和足够的矿物元素，低糖、低脂肪、低胆固醇和低钠。

2．特种功能性食品

它着眼于某些特殊消费群的身体状况，强调食品在预防疾病和促进康复方面的调节功能，如减肥功能性食品、提高免疫调节的功能性食品和美容功能性食品等。

◆分类（二）按技术含量进行分类

1．第一代产品（强化食品）

第一代产品主要是强化食品。它是根据各类人群的营养需要，有针对性地将营养素添加到食品中去。这类食品仅根据食品中的各类营养素和其他有效成分的功能，来推断整个产品的功能，而这些功能并没有经过任何试验予以证实。目前，欧美各国已将这类产品列入普通食品来管理，我国也不允许它们再以保健食品的形式面市。

2．第二代产品（初级产品）

第二代产品要求经过人体及动物试验，证实该产品具有某种生理功能。目前我国市场上的保健食品大多属于此类。

3．第三代产品（高级产品）

第三代产品不仅需要经过人体及动物试验证明该产品具有某种生理功能，而且需要查清具有该项功能的功效成分，以及该成分的结构、含量、作用机理、在食品中的配伍性和稳定性等。这类产品在我国现有市场上还不多见，且功效成分多数是从国外引进，缺乏自己的系统研究。