有关PCR习题

一、选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。

1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（）

A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液

2．以下哪种酶可耐高温（）

A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段

3．PCR反应正确过程应为（）

A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火E．延伸→变性→退火

4． PCR技术的本质是（）

A．核酸杂交技术 B．核酸重组技术C．核酸扩增技术 D．核酸变性技术 E．核酸连接技术

5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（）

A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃

6．能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为（）

A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光PCR仪 E．实时PCR仪

7．在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数（）

A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光实时PCR仪E．定性PCR仪

8．PCR基因扩增仪最关键的部分是（）

A．温度控制系统 B．荧光检测系统 C．软件系统 D．热盖 E．样品基座

9．“位置的边缘效应”是指（）

A．温度的准确性欠佳 B．温度的均一性欠佳 C．边缘升降温速度快 D．边缘升降温速度慢

E．梯度模式和标准模式温度不一致

10．PCR扩增仪升降温速度快有很多优点，以下哪一项应除外（）

A．缩短反应时间 B．提高工作效率 C．消除位置的边缘效应 D．缩短非特异性反应时间 E．提高反应特异性

11、PCR技术扩增DNA,需要的条件是( )

①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA ⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④

⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥

12、镁离子在DNA或RNA体外扩增反应的浓度一般为（）

A、0.3-1mmol/L

B、0.5-1mmol/L

C、0.3-2mmol/

D、0.5-2mmol/L

13、多重PCR需要的引物对为（） A、一对引物 B、半对引物 C、两对引物 D、多对引物

14、PCR是在引物、模板和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，其特异性决定因素为（）

A、模板

B、引物

C、dNTP

D、镁离子

15、在PCR反应中，下列哪项可以引起非靶序列的扩增的扩增( )

A、TaqDNA聚合酶加量过多

B、引物加量过多

C、A、B都可

D、缓冲液中镁离子含量过高

16、PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是

A．dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作DNA合成的原料

B．dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖

C．DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋

D．CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一

17、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（）

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成

C．延伸过程中需要DNA聚合酶、A TP、四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高

18、下列有关PCR技术的叙述，不正确的是：（） A．PCR技术经过变形、复性、延伸三个阶段 B．PCR 技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等

C．PCR技术需在体内进行 D．PCR技术是利用碱基互补配对的原则

19、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460个）放入PCR仪中扩增4代，那么，在PCR仪中放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数至少应是

A．640 B．8100 C．600 D．8640

20、对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。下图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，M、N、Q、W是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，哪份标本最有可能确诊为禽流感（）

A．M B．N C．Q D．W

21、某考古学家在西伯利亚泰加林地区的冰中，发现了一种冰冻的已灭绝的巨大动物的肌肉。他想了解该巨型动物的DNA与现今印度大象的DNA的相似性，于是做了如下检测工作，其中正确的操作步骤及顺序是

①降低温度，检测处理后形成的杂合DNA双链区段②通过PCR技术扩增巨型动物和大象的DNA ③把巨型动物的DNA导入大象的细胞中④在一定的温度条件下，将巨型动物和大象的DNA水浴共热 A.②④

③ B.②④③① C.③④① D.②④①

22、 PCR的发明人是

A. Mullis

B. 牛顿

C.Kenny

D. James

23、退火温度一般比引物的熔解温度（Tm）低多少合适

A. 7℃

B. 10℃

C. 5℃

D. 2℃

E. 20℃

24、引物的最佳浓度为

A. 0.1-0.5 μM

B. 1-2μM

C. 5-10μM

D. 100μM

E. 200μM

25、专门用于制备单链DNA的PCR技术是

A、对称PCR

B、反向PCR

C、RT－PCR

D、不对称PCR

E、嵌套PCR

26、PCR变性温度一般为

A． 96℃ B. 85℃ C. 72℃ D. 55℃ E. 100℃

27、pre-mRNA 内含子的5'-末端一般为（）A、AU B、GU C、AG D、CG E、AC

28、在大肠杆菌的DNA损伤修复时，对于填补缺口可能最重要的酶是

A、DNA聚合酶Ⅰ

B、DNA聚合酶Ⅱ

C、DNA聚合酶Ⅲ

D、RNA聚合梅

E、以上都不是

29、可用于扩增未知序列的PCR方法是（） A、对称PCR B、反向PCR C、 RT-PCR D、不对称PCR E、嵌套PCR

30、在聚合酶链反应（PCR）中最常用的DNA聚合酶是 A．T4 DNA连接酶 B．T7 DNA聚合酶 C． Taq DNA 聚合酶 D．E. coli DNA聚合酶I E．E. coli DNA聚合酶II

31、下列关于PCR引物设计的说法错误的是（）

A．设计引物时应考虑使3’端引物和5’端引物具有相似的Tm值

B．每条引物自身不应有稳定的发夹结构

C．上下游引物之间不宜形成稳定的二聚体结构 D．引物的5’和3’端必须和模板严格配对结合E．引物与非特异扩增区的序列无同源性

32、Taq DNA聚合酶可以不依赖模板在dsDNA的3’末端加上一个碱基为（）

A. G

B. A

C. T

D. C

E. I

33．PCR反应中，所设计引物的长度一般为（）

A．5～10核苷酸 B. 15～30核苷酸 C. <50个核苷酸 D.长度任意 E. 以上答案均不对34．引物设计时G＋C含量在引物中一般占（）

A. 20～40﹪

B. 30～60﹪

C. 45～55﹪

D.越高越好

E.含量随意

35．以下说法错误的是（）

A引物中的碱基组成应该尽可能的随机分布。

B 引物自身不应该存在互补序列

C 设计引物时应考虑使3‘端引物和5‘端引物具有相似的Tm值

D 引物的5‘和3’端必须和模板严格配对结合

E 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70﹪

36．下列说法正确的是（）

C. PCR反应常用的缓冲液为10－50mmol/L的Tris-HCl（室温 PH 8.3－8.8）

D. 10mmol/L的KCl能促进引物的退火

E. 加入的BSA有利于破坏模板的二级结构

F.二甲基亚砜有利于保护TaqDNA酶的活性。

E. Mg2+能降低Taq DNA聚合酶的活性。

37. TaqDNA聚合酶活性需要以下哪种离子（ c ）

A．K+ B. Na+ C. Mg2+ D. Ca2+ E. Cl-

38．适用于DNA序列中单个碱基突变的检测的方法是：( d )

A．筑巢PCR B. 多重PCR C. 锚定PCR D. LCR

39．以下哪种PCR技术广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究（ a ）

A．原位PCR B．差异显示PCR C．不对称PCR D．反向PCR

40.已知一段设计好的引物的序列为GTGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC,其Tm值为（）

A. 78

B. 80

C. 82

D. 84

E. 无法计算

41．以下关于dNTP的说法错误的是（）

B.dNTP具有较强的酸性，使用时应将pH调至7.0-7.5

C.PCR反应中，四种dNTP必须按比例配制，以减少反应的错配率。

D.dNTP的浓度过高会增加碱基的错配率

E.dNTP的浓度低，反应速度下降，但特异性提高

42. TaqDNA聚合酶可以不要模板在ds DNA的末端加上一个( )碱基.

A. dGTP

B. dCTP

C. dATP

D. dTTP

43. 有关PCR的描述哪个不对( )

A.是一种酶促反应

B.引物决定扩增的特异性

C.扩增的对象是DNA序列

D.扩增的对象是氨基酸序列

44. 催化PCR的酶是 ( )

A.RNA聚合酶

B.DNA聚合酶

C.Taq DNA聚合酶

D.反转录酶

45. PCR产物具有特异性是因为( )

A.Taq DNA酶保证了产物的特异性

B.合适的变性,退火,延伸温度

C.选择特异性的引物

D.引物的Tm值不同.

46．LCR的说法正确的是 ( )

A.体系中采用DNA聚合酶

B.须设计一对引物

C.反应需经过变性,复性,连接

D. LCR中,酶将dNTP加到引物的3-OH端

E. LCR具有高度敏感性

二、多项选择题

1．下列关于退火温度说法正确的是（）

A. 合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。

B. 引物与模板的退火温度一般在45－55℃之间

C. 在Tm值允许的范围内，选择偏低的退火温度可以提高PCR反应的特异性。

D. 退火时间至少需要一分钟。

2．进行PCR实验时以下措施有助于防止污染和结果的假阳性（）

B.隔离不同的操作区

C.分装试剂，减少重复取样所致的污染

D.严格实验操作

E.设立实验对照

3．适用于扩增3‘或5‘端未知序列的PCR技术是（）

A．反向PCR B. 锚定PCR C. 多重PCR D.不对称PCR

4．以下关于PCR技术应用说法正确的是（）

B.筑巢PCR和共享引物PCR有利于增强PCR反应的特异性，适用于模板含量极少的样品的检测

C.不对称PCR可以大量制备单链DNA，可用于DNA的序列测定

D .彩色PCR适用于基因诊断和自动化DNA序列测定

E .定量PCR可用于基因表达和调控的研究

F.差异显示PCR可用于筛选和克隆受发育，突变等各种因素影响下差异表达的基因

5. 关于引物设计说法正确的是（）

B.为保证PCR反应的特异性，所设计的引物长度一般>30个核苷酸

C.引物设计时G＋C含量在引物中一般为45～55﹪

D.按经验，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3个碱基

E.两个引物之间不应存在互补序列，尤其避免3‘端的互补重叠

F.引物的3‘端可以游离而不影响PCR反应的进行

6. 以下关于PCR的说法正确的是（）

A.PCR的模板可以是DNA也可以是RNA

B.PCR的模板必须从组织细胞中分离出来

C.PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA的结合位点。

D.PCR反应初期，目的DNA片断的增加呈指数扩增。

E.PCR反应一般需要含102－105拷贝的模板

7．以下关于PCR反应条件错误的是（）

B.PCR缓冲液中加入二甲基亚砜有利于破坏模板的二级结构，提高反应的特异性。

C.Mg浓度过高会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过低又会使酶催化非特异性扩增增强。

D.4种dNTP应以等摩尔浓度配制，以减少错配误差。

E.引物浓度一般为0.5-1umol/L

8. PCR反应时应设立哪种对照（）

A.阴性对照

B.阳性对照

C.试剂对照

D.以上答案都正确

9. 逆转录反应体系包括（）

B. RNA模板，四种dNTP

C. RNA酶抑制剂

D.合适的缓冲液体系

E.逆转录酶

F.寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物

10. 有关PCR的模板说法正确的是 ( )

A.模板可以是DNA也可以是RNA

B.大多数PCR反应中对DNA模板纯度要求不高

C.模板用量低

D.标本处理的基本要求是除去杂质

11. 以下有关RT-PCR反应的说法你认为正确的有( )

A. 反应体系一般有20μl

B.反应体系中有缓冲液, 四种dNTP, MgCl2, DTT, 牛血清白蛋白, Oligo(dT)引物RNA模板和逆转录酶

C.逆转录于42℃进行,随后即进行PCR

D. RT-PCR的最终反应过程依然是以DNA为模板的PCR反应

12. PCR的产物累积的特征是( )

B.反应初期,目的DNA片断呈指数扩增

C. PCR进行到一定时间出现反应中的停滞效应

D.到达平台期的的PCR循环数取决于反应体系中酶的耗竭程度

E. PCR平台期的出现多数不可避免

F.到达平台期时若扩增目的DNA片断不足,可继续加入模板,酶和缓冲液进行PCR反应

13. 有关Mg2+在PCR中的作用说法不正确的是( )

A. Taq DNA 酶的活性维持需要Mg2+

B. Taq DNA酶的活性与反应体系中的Mg2+总浓度有关

C. Mg2+过低,酶催化非特异性扩增增加

D. Mg2+过高会降低酶的活性

E.总量应低于dNTP的量, 常用1.5mmol/L

14. PCR中使用的底物dNTP应该是( )

A.使用前应将pH值调至7.0-7.5

B. dNTP浓度高可以加快反应速度,但却增加了出错率

C.降低反应速度可以提高反应特异性

D. PCR中, 4种 dNTP必须按一定比例配制

E. Mg2+会与dNTP结合,应注意二者浓度之间的关系

15. Taq DNA酶的特点是( )

A. 75-80℃时具有最高的聚合酶活性

B.活性的维持需要Mg2+的参与

C. Taq DNA酶和klenow片断一样具有校正功能

D. Taq DNA酶的忠实性很高

E.具有类似末端转移酶的活性

16. 有关引物的说法正确的是( )

A.引物浓度一般为0.1-1.5μmol/L

B.引物与模板的的比至少为108:1

C.引物浓度过高会引起错配和非特异扩增,降低扩增效率

D.引物Tm值位于55-80℃较理想

17. PCR反应温度应该是( )

A. 为使DNA变性完全,变性温度越高,时间越长越好

B.按模板DNA的复杂程度来调整变性温度和变性时间

C.于反应管中加入1-2d 石蜡油防止反应液的蒸发

D.温度越高时间越长, dNTP破坏增加,对PCR反应产生不利影响

18.有关退火温度正确的是( )

A.引物与模板退火温度一般在45-55℃

B.退火温度过低,使非特异扩增增加

C.退火温度过高, PCR扩增含量下降

D.退火时间一般为1-2分钟

E. Tm值的允许范围内,应该选择较低的退火温度

19.延伸温度应有如下特点( )

A.一般为72℃

B. PCR延伸时间越长, 产物的得率越高

C. Taq DNA酶在延伸温度时有较高的酶活性

D. PCR延伸时间根据待扩增片断的长度而定

20.PCR循环次数设定时应注意( )

B.应由最初靶分子浓度而定

C. 理论上20-25个循环后, PCR产物累积达最大值

D. PCR的循环次数一般为25-30次

E.循环次数过多时会引起停滞效应

21.PCR样品制备时应注意( )

B.应有专门的区域制备模板

C.提取DNA样品和RNA样品时要带手套且经常更换

D.纯化样品对污染有极大的影响

E. 普通分子克隆工具不能用做样品的处理和靶序列

F.提取核酸所用的试剂要求新鲜配制或者适当储存未经使用的试剂.

22.操作中应该注意( )

A.使用的溶液应该没有核酸,核酸酶

B.试剂水都是高质新鲜蒸馏水

C.工具(枪头,试管) 都是一次性并且高压灭菌

D.应有专门的操作区

E.试剂应该分装保存

23. PCR反应总为阴性时应该( )

A.增加Taq DNA酶的浓度

B. 增加靶DNA的量

C.增加扩增循环或者降低退火温度

D.提纯样品

E.取10μl扩增液再行PCR

24. PCR反应出现非特异产物时,应该采取的措施是( )

A.增加退火温度

B.降低Taq DNA 酶浓度

C. 减少退火及延伸时间

D.减少引物浓度

E.减少扩增循环次数

25.PCR 可以广泛应用于( )

A.遗传性疾病的基因诊断

B. 检测癌基因

C.检测病原微生物

D. 法医鉴定

E. DNA 序列测定

二：填空题

1、PCR 技术的发明人是 。

2、PCR 产物短期存放可在 保存，长期储存应置于 。

3、PCR 的基本反应过程包括 ， ， 。

4、PCR 引物设计的目的是在 和 间取得平衡。

5. PCR 反应体系含有 ， ， ， 。

6. 引物与模板的退火温度一般为 ，延伸温度一般为 。

7. PCR 循环次数一般设定为 ，过多的循环次数会导致 的出现。

8. 引物3‘端最佳碱基选择是 和 。

9. PCR 的反应体系一般选用 。

10. PCR 反应的缓冲液提供了PCR 反应 常用的为 。

11. PCR 的反应体系中，Mg2＋的浓度一般保持在 ,常用的是 。

12. TaqDNA 聚合酶具有 ，缺乏 因此无 。

13. 在变性过程中，为防止反应液的蒸发，可在反应管中加入

14.(8分)聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、

足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分

子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。

（2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。

（3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处：

① 。 ② 。 ③ 。

15．（7分）资料显示，近十年来，PCR 技术（DNA 聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA 半保留复制的特性，在试管中进行DNA 的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：

循环重复

（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循。

（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是

和。

（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为。

（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（）

A．白细胞DNA B．病毒蛋白质 C．血浆抗体 D．病毒核酸

16．(8分)下面甲图中DNA决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品 DNA经PCR技术(聚合酶链式反应)扩增，可以获取大量DNA克隆分子。分析回答：

(1)甲图中含有种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子是。该图表示了DNA中遗传信息的

过程。

(2)有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成的。此种贫血症的根本原因是，即发生了改变。

(3)乙图的“PCR”与人体内的DNA复制相比有何特殊之处? 。

(4)现在要通过“PCR”得到甲图中DNA片段的1024个克隆片段，则至少要向试管中加入

个腺嘌呤脱氧核苷酸。

17、（8分）PCR技术是把某一DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异的扩增任何要求的目的或DNA分子片段；电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和作亲子法学鉴定。下图中1~4是电泳装置及相应电泳结果。

请回答：

（1）电泳与叶绿体色素分离采用的纸层析法比较，后者使用的介质是________。电泳过程中分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外，你认为还受什么因素影响(至少列出一种)？___________。

（2）PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，是依据什么原理？________________。

（3）图3是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，得到的氨基酸混合物进行电泳的结果，故可推知该

多肽是由________种氨基酸构成的。

（4）图4通过提取某小孩和其母亲，以及待测定四位男性的DNA，分别由酶处理后，生成含有若干DNA 片段，并已进行扩增得到的混合物，然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱，请分析：谁是该小孩真正生物学上的父亲？为什么？

18、（7分）PCR技术是一项在短时间内可将DNA分子迅速扩增的方法。它的基本原理与细胞内DNA分子的复制类似。下面是PCR的反应体系及反应条件，请据此回答：

（1）请指出DNA分子复制所需的条件是：、、和。与细胞核中DNA分子复

制相比，95℃条件下变性30s的目的是：。反应体系中的缓冲液相当于细胞中的。

（2）如果有反应体系中加入模板DNA分子100个，则经过30个循环后，DNA分子的数量将达到个。

19、（7分）在2004年12月26日发生的印度洋地震海啸灾难中，死亡人数已达到15万，为了帮助辨别遇难者身份，我国政府派出了DNA 鉴定专家组到泰国为遇难遗体做法医病理检验。下列是一组法医检验DNA时常用到的生物技术或物质：

（1）PCR技术是把某一DNA片段在体外酶的作用下，合成许多相同片段的一种方法，利用它能迅速而特异的扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段；

（2）限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切以选择目的基因或DNA片段；

（3）电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带电荷不同，把待测分子的混合物放在一定介质（如琼脂糖凝胶）中进行分离和分析的实验技术，利用它能分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质，也可用作亲子法学鉴定。

请阅读上述内容并回答下列问题：

（1）PCR技术能把某一DNA 片段进行扩增，是依据什么原理？；利用PCR技术扩增DNA片段时用到的“体外酶”通常是指什么酶？。

（2）电泳过程中分子的迁移率除与本身所带电荷的多少有关以外，你认为还受什么因素影响？（至少列出一种）。

（3）如果将含有2条多肽链共48个氨基酸的蛋白质进行彻底的水解，然后再将得到的氨基酸混合物进行电泳，结果如下图1所示。则可推知该蛋白质由种氨基酸构成，该蛋白质水解时需要的水分子数

。

（M 代表母亲，C代表儿子，

F1—F4 代表待测四位男性）

PCR反应体系：50ul

缓冲液 5ul

脱氧核苷酸 1ul (2.5mM)

引物 A 0.5ul

引物 B 0.5ul

Mg2+ 4ul (2.0mM)

DNA聚合酶 0.5ul

模板DNA 1-2ul (100-200ng)

加去离子水补足至50 ul

反应条件：

温度时间

预变性 94℃ 5min

变性 95℃ 30sec

复性 56-60℃ 30sec

延伸 72℃ 30sec

30个循环后72℃延伸5-10min

保温 4℃ 2h

图1 图2 图3

（4）由于每个人的DNA条带（经电泳后）分布图是独一无二的，因此“DNA指纹法”可帮助进行亲子鉴定或帮助司法部门进行案件侦破。如果取某小孩和其母亲、以及另外四位待测男性的DNA，经合适的酶处理以后得到若干DNA片段，再经电泳以后得到“DNA指纹图谱”如上图2所示，请分析：四位男性中谁最可能是该小孩的生物学父亲？。

（5）现以3种不同的限制性内切酶对6.2kb大小的线状DNA进行剪切后，用凝胶电泳分离各DNA片段，实验结果图3所示。请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置是。（请从下列各项中选择）

三、简答题

1、简述PCR反应的基本步骤。

2、简述PCR模板的种类及制备方法。

3、简述PCR产物的积累规律。

4、简述PCR的基本反应。

5、简述PCR实验应注意的事项。

6、简述连接酶链反应的基本原理。

7、简述RNA体外扩增的特点。

四、论述题

1、试述PCR的基本原理及引物设计原则。

2、试述PCR技术的特点。

3、试述PCR反应条件的优化。

4、试述PCR的主要类型及其工作原理。

PCR扩增原理及操作

PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，

PCR基本原理及方法_图文.

Medical Molecular Biology Principle and Applications of PCR （Polymerase Chain Reaction） Department of Biochemistry and Molecular Biology 1 Contents History of PCR Concept and principle of PCR PCR reaction system Types and Applications of PCR 2 Replication Substances Involved in DNA replication and Functions substrate (底物: 4 dNTP。合成新链的原料。 template (模板: 解开成单链的DNA母链。指引dNTP按碱基互补配对原则合成新链。 primer (引物: 一段寡核苷酸序列。提供3′-OH末端使dNTP 可以依次聚合。 polymerase (聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶( DNA-pol Other enzymes & protein factors： Helicase, Topoisomerase：解链解旋，防止打结。 SSB （单链DNA结合蛋白）：稳定已解开的单链。 Primase：催化RNA引物生成。DNA ligase：连接两段相邻的岡崎片段。 4 一、History of PCR 1、Khorana(1971等提出在体外经DNA变性,与适当引物 杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2、1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3、1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR 技术。 4、1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 5

pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答 当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将PCR反应的试管与反应板紧贴。 当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml 的PCR管中不能均匀传热。 不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。 没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。 泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。 检查模板和引物的用量。 增加循环次数和/或模板DNA的用量。 泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高退火温度，但不要超过68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。 其他值得注意的条件： 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。 基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。 变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。 延伸：68--72℃下进行延伸操作。 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

PCR技术的种类及其应用

PCR技术的种类及其应用 1PCR技术的基本原理 PCR技术是在模板DNA引物和四种dNTP等存在的条件下,依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25?30次循环DN数量可达2X106~7拷贝数。 2PCR技术的种类 2.1反向PCR( Inverse PCR, IPCR技术 原理：反向PC是克隆已知序列旁侧序列的一种方法.主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I) NA?后酶切片段自身环化?以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶 DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就 有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR( Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3 '末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用50?100T比例。在最初的10?15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA 应用：可制备单链DNA

pcr技术原理简介

PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引

PCR原理及过程

PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验试剂与器材 模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 O 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH 2 PCR仪、移液枪、PCR板 四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL

PCR技术原理模板

PCR技术原理 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 一.假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖

凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其

PCR技术的种类及应用

PCR技术的发展及应用 平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术 对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理[1,2] PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。 2、PCR技术的反应组份 2.1 模板DNA PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，可以是基因组DNA 或cDNA，

PCR技术及原理

PCR定义：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一、PCR反应成分： 1、模板DNA； 2、引物； 3、四种脱氧核糖核苷酸； 4、DNA聚合酶； 5、反应缓冲液、Mg2+等。 二、PCR反应基本步骤： 1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR扩增的基本方法 PCR反应的成分和作用

总体积：一般为25μl～100μl 一、无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50?mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP 为200?μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、 三、BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。 四、底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。 五、Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。 六、模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 七、引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。 PCR反应条件的选择（影响因素） 温度参数： 1、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。 2、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。 3、延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。 循环数： PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR产物积累规律： 反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

PCR原理

PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 一、温度循环参数 在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。 关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。 1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。 2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相

PCR 技术的种类及其应用

PCR 技术的种类及其应用 1PCR 技术的基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2PCR技术的种类 2.1反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但

PCR_技术的种类及其应用

PCR 技术的种类及其应用 1 PCR 技术的基本原理 PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。 2PCR技术的种类 2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶 切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 2.2锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。 2.3不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。 2.4反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术 当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。 2.5修饰引物PCR技术 为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。 2.6巢式PCR(NEST PCR)技术 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二 次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。 2.7等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术 ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。 2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来

PCR技术的原理与方法

PCR定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 一.PCR反应成分： 1.模板DNA； 2.引物； 3.四种脱氧核糖核苷酸； 4.DNA聚合酶； 5.反应缓冲液、Mg2 等。 二.PCR反应基本步骤： 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的

DNA以2n的形式增加。 ?PCR扩增的基本方法 ?PCR反应的成分和作用 总体积：一般为25μl～100 μl （一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。M

PCR原理及注意事项

PCR 一、PCR的原理 PCR，Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明。该技术基本原理如下： 在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下，依赖于DNA polymerase的酶促合成反应。DNA polymerase以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端(退火),并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环。 1.PCR反应的基本成分 包括：Templates DNA(待扩增DNA)、Primers、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的Buffer(对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO)。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃或60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，新链又可成为下次循环的模板。 3.PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示实际扩增效率，平均约为75%，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。如果进行30个Cycles，实际扩增倍数往往为106-107（理论上以Y=2n计算，为109）。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有

PCR的原理是什么

PCR技术的诞生与发展 核酸研究已有100多年的历史，1930年人们正式提出了DNA和RNA的概念。从此人们对其化学组织、结构及其功能进行了深入研究。1953年Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。之后，对基因的表达和调控等方面的研究取得了长足进展。60年代中期开始的从细胞中分离基因的工作拉开了基因工作的序幕。本世纪60年代末和70年代初，人们主要致力于研究基因的体外分离技术。Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室的mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 1987年该项技术获美国专利。 1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术的自动化成为现实。