病毒DNA提取

小鼠血浆中HSV-1 DNA的提取

[目的] 掌握血浆中病毒DNA 提取的原理，熟悉其提取方法。

[原理] E.Z.N.A.?Viral DNA Kit

该试剂盒提供了从小于250ul血浆、血清、无细胞培养液等样品中快速简单地提取病毒DNA的方法，液体样品经Buffer BL和蛋白酶（OB）消化后，经乙醇调节结合条件，过柱吸附DNA，再经过两步快速洗涤后，最后用Elution Buffer (10mM Tris,pH8.5)溶解基因组DNA。纯化的DNA可直接用于PCR，Southern杂交，酶切等实验。

[试剂及仪器]旋涡混合振荡仪；微量DNA定量仪；台式离心机；65℃水浴锅。

1.5ml无菌EP管（2个/人）；EP抗凝管(含100ul抗凝剂)（K）；1000ul枪及枪头；。Hibind DNA 结合柱(1个/人)；2ml收集管（3个/人）；OB蛋白酶（OB）；Buffer B L（含线性丙烯酰胺）(BL)；乙醇(乙)；Buffer HB(HB)；DNA Wash Buffer（W）；Elution Buffer(EB)。

[实验步骤]

一、血浆样品的制备：

1.用微量加样器取100ul抗凝剂加入1.5mlEP管中。

2.右手抓起小鼠尾巴，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子迅速摘除

眼球，将流出的血液滴入含有抗凝剂的1.5ml EP管中，迅速混匀后，10000rpm，离心3min。

上层黄色透明的即为血浆。

二、DNA的提取

1.取血浆250ul（如不足250ul，用Elution Buffer补足250ul）于1.5ml无菌EP管中。

2.加入10ul OB蛋白酶和250ul BL Buffer（含4ul线性丙烯酰胺用于填补病毒DNA在吸附

柱上的本底吸附），于旋涡混合振荡仪上最大速度振荡15sec。

3.65℃孵育10min。孵育过程中，用旋涡混合振荡仪混匀一次。

4.加入260ul乙醇，旋涡混合振荡仪最大速度振荡20sec。12000×g离心10sec，使盖子上的

液体沉于管中。

5.将Hibind DNA结合柱装在2ml收集管中，将第4步离心的上清中所有液体（约760ul）

加入Hibind DNA结合柱装上，8000×g离心1min。卸下收集管，将收集管及其中的液体弃去。

6.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入500ul HB Buffer，8000×g

离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。、

7.向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，卸下收集管，将收集管及其中

的液体弃去。

8.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，

8000×g离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。

9.将空的Hibind DNA结合柱15000×g离心2min，以去掉其中残余的液体。卸下收集管，

将收集管及其中的液体弃去。----这一步非常重要

10.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的无菌1.5ml EP管上（事先做好标记），加入50-100ul

65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min后，8000×g离心1min，洗脱液中即含有病毒DNA。

三、DNA定量：

微量DNA定量仪。取1.5ul用于DNA定量。

[结果] DNA浓度（ng/μl）=

A260=1.0， ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml

DNA纯度判定：

1. A260 / A280>1.8 85%-95%

<1.8 蛋白或酚类污染

2. A260 / A230>2

<2 碳水化合物，多肽，苯酚污染

注意事项：

1.染毒动物及物品的处理：

2. 抗凝剂：

（1）EDTA是极大多数（降解DNA的）脱氧核糖核酸酶的强烈抑制剂，建议抗凝剂使用EDTA，终浓度一般为50～100 mmol /L。

（2）ACD抗凝剂，每100ml中含0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠和1.47g葡萄糖，用作抗凝时每6ml新鲜血液中加入1ml ACD。

（3）一般不用肝素抗凝。

病毒DNA提取

小鼠血浆中HSV-1 DNA的提取 [目的] 掌握血浆中病毒DNA 提取的原理，熟悉其提取方法。 [原理] E.Z.N.A.?Viral DNA Kit 该试剂盒提供了从小于250ul血浆、血清、无细胞培养液等样品中快速简单地提取病毒DNA的方法，液体样品经Buffer BL和蛋白酶（OB）消化后，经乙醇调节结合条件，过柱吸附DNA，再经过两步快速洗涤后，最后用Elution Buffer (10mM Tris,pH8.5)溶解基因组DNA。纯化的DNA可直接用于PCR，Southern杂交，酶切等实验。 [试剂及仪器]旋涡混合振荡仪；微量DNA定量仪；台式离心机；65℃水浴锅。 1.5ml无菌EP管（2个/人）；EP抗凝管(含100ul抗凝剂)（K）；1000ul枪及枪头；。Hibind DNA 结合柱(1个/人)；2ml收集管（3个/人）；OB蛋白酶（OB）；Buffer B L（含线性丙烯酰胺）(BL)；乙醇(乙)；Buffer HB(HB)；DNA Wash Buffer（W）；Elution Buffer(EB)。 [实验步骤] 一、血浆样品的制备： 1.用微量加样器取100ul抗凝剂加入1.5mlEP管中。 2.右手抓起小鼠尾巴，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子迅速摘除 眼球，将流出的血液滴入含有抗凝剂的1.5ml EP管中，迅速混匀后，10000rpm，离心3min。 上层黄色透明的即为血浆。 二、DNA的提取 1.取血浆250ul（如不足250ul，用Elution Buffer补足250ul）于1.5ml无菌EP管中。 2.加入10ul OB蛋白酶和250ul BL Buffer（含4ul线性丙烯酰胺用于填补病毒DNA在吸附 柱上的本底吸附），于旋涡混合振荡仪上最大速度振荡15sec。 3.65℃孵育10min。孵育过程中，用旋涡混合振荡仪混匀一次。 4.加入260ul乙醇，旋涡混合振荡仪最大速度振荡20sec。12000×g离心10sec，使盖子上的 液体沉于管中。 5.将Hibind DNA结合柱装在2ml收集管中，将第4步离心的上清中所有液体（约760ul） 加入Hibind DNA结合柱装上，8000×g离心1min。卸下收集管，将收集管及其中的液体弃去。 6.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入500ul HB Buffer，8000×g 离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。、 7.向柱中加入700ul DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，卸下收集管，将收集管及其中 的液体弃去。 8.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的收集管中，向柱中加入700ul DNA Wash Buffer， 8000×g离心1min，卸下收集管，倒掉其中的液体后，将收集管重新装在柱子上。 9.将空的Hibind DNA结合柱15000×g离心2min，以去掉其中残余的液体。卸下收集管， 将收集管及其中的液体弃去。----这一步非常重要 10.将Hibind DNA结合柱装在另一个新的无菌1.5ml EP管上（事先做好标记），加入50-100ul 65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min后，8000×g离心1min，洗脱液中即含有病毒DNA。 三、DNA定量： 微量DNA定量仪。取1.5ul用于DNA定量。

病毒基因组DNA提取试剂盒使用说明书

病毒基因组DNA 提取试剂盒 Virus Genomic DNA Kit (目录号：HS0307) 产品包装 自备试剂 无水乙醇 储存条件 蛋白酶K 于-20℃，其他组分室温（15 ~ 25℃） 产品简介 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的血浆、血清和无细胞体液中提取高质量的病毒DNA 。无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提，独特的缓冲液/蛋白酶K 体系能迅速裂解病毒，使病毒蛋白与DNA 分离，在蛋白酶K 的作用下降解病毒蛋白，在高盐状态下将病毒DNA 选择性吸附于硅基质膜上，再通过快速的漂洗、离心步骤，去除蛋白等杂质，最后低盐的洗脱缓冲液将高纯度的病毒DNA 从吸附柱膜上洗脱下来。 本试剂盒操作简单、快速，所得病毒DNA 不含蛋白、核酸酶和其他杂质，可直接用于PCR 、RT-PCR 、Real-Time PCR 、印迹等分子生物学实验。 产品特点 1.简便快速，1小时内可获得高纯度的病毒基因组DNA 。 2.无需有机溶剂抽提，使用安全。 3.重复性好，产量高。 北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.

4.所得病毒DNA纯度高，无污染物和抑制剂，方便下游应用。 注意事项 1.血清或血浆避免反复冻融，否则会使蛋白变性或产生沉淀，导致提取的DNA片段小，提取量下降。 2.如缓冲液Buffer GB、Buffer GD结晶或产生沉淀，可在56℃水浴溶解。 3.所有离心步骤均为室温下操作。 操作步骤 1. 取1.5 ml离心管（自备），加入20 ul的Proteinase K溶液。 2. 向离心管中加入200 ul血清或血浆，然后再加入200 ul Buffer GB，涡旋震荡15 sec。（注意：1、样本体积不足200 ul可以加入0.9% NaCl（自备）补足。2、为确保样本有效裂解，加入Buffer GB后，需将样本与Buffer GB充分混匀。） 3．56℃孵育15 min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。 4. 加入250 ul无水乙醇，涡旋震荡15 sec，室温放置5 min，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底。 (注意：如果环境温度超过25℃，无水乙醇应在冰上预冷后使用。) 5．将一个Spin Columns CG*放入Collection Tubes(2 ml)中，将上一步所得溶液转移到离心吸附柱中，10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中的废液。 6. 向吸附柱内加入500 ul的Buffer GD，室温10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中废液。（注意：Buffer GD中含有乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 7. 向吸附柱内加入500 ul的Buffer PW，室温10 000 rpm离心30 sec，弃收集管中废液。（注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7一次。Buffer PW中含有乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 8．向吸附柱中加入500 ul无水乙醇，10 000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9．室温12 000 rpm离心3 min，甩干残留液体。 （注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用） 10. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 ml塑料离心管（自备）中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3 min，使吸附膜完全变干。加入30 ~ 100 ul的洗脱液，室温放置2 ~ 5 min。12 000 rpm

HIV病毒基因组

编码基因 病毒基因组是两条相同的正链RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb。两端是长末端重复序列（long terminal repeats, LTR），含顺式调控序列，控制前病毒的表达。已证明在LTR 有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列编码了至少9个蛋白，可分为三类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。 1．gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17， P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。 2．Pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。 3．env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。 4．TaT 基因编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。 5．Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列 （Cis-Acting repression sequance,Crs）去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。 6．Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。 7．Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。 8．VPU基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。 9．Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。 HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。

【免费下载】 习题-第四章病毒基因组

第四章病毒基因组 一、A型题： 1. 只含小分子量RNA而不含蛋白质的病毒称（） A. 类病毒（Viroids） B. 卫星（Satellites） C. 类病毒（viroid） D. 朊病毒（Prions） E. 拟病毒（virusoid） 2. 只含蛋白质而不含核酸的的病毒称（） A. 类病毒（Viroids） B. 卫星（Satellites） C. 类病毒（viroid） D. 朊病毒（Prions） E. 拟病毒（virusoid） 3. RNA病毒基因组的帽子结构与第二个核苷酸相连的化学键（） A. 5＇，5＇-三磷酸二酯键 B. 3＇，3＇-三磷酸二酯键 C. 5＇，5＇-磷酸二酯键 D. 3＇，5＇-磷酸二酯键 E. 以上都不是 4. HBV基因组是（） A. 完全双链DNA分子 B. 不完全双链DNA分子 C. 完全双链RNA分子 D. 不完全双链RNA分子 E. 单链DNA分子 5. 具mRNA模板活性的病毒基因组是（） A. 正链DNA病毒 B. 负链DNA病毒 C. 负链RNA病毒 D. 逆转录科的正链RNA病毒 E. 正链RNA病毒（逆转录科的正链RNA 病毒除外） 6. 关于逆转录病毒叙述不正确的是（） A. 迄今发现的RNA肿瘤病毒均属RNA逆转录病毒 B. 嗜肝DNA病毒科属DNA逆转录病毒。 C. 逆转录病毒RNA为正链 D. 病毒颗粒均携带逆转录酶 E. 前病毒DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA中 7. 逆转录病毒基因组的结构特点不包括（） A. 5＇端帽子结构 B. 3＇端poly(A)尾 C. 两端各有一个长末端重复序列（LTR） D. 编码逆转录酶 E. 神经酰胺酶 8. 分段基因组（segmented genome）是指病毒基因组（） A. 由数条不同的核酸分子组成 B. 由数条相同的核酸分子组成 C. 由数条互补的核酸分子组成 D. 由可分成不同功能区段的一个核酸 分子组成 E. 以上都不对 9. HBV基因组序列的利用率（编码基因效

病毒基因组DNA RNA快速提取试剂盒II操作方法及步骤说明书

试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次(RN2201) 裂解液VLB 室温20 ml Poly Carrier -20℃200μl 去蛋白液RE 室温25 ml 漂洗液RW 室温10 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温10 ml RNase-free 吸附柱RA和收集管 室温50套 室温储存12个月不影响使用效果，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 产品介绍： 采用特异性结合病毒DNA/RNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，病毒DNA/RNA提取试剂盒适合于从无细胞体液，包括血浆、血清、腹水、培养细胞上清液、脑脊髓液及尿液等中快速提取高纯的病毒DNA/RNA。该产品可以满足绝大多数的病毒RNA/DNA的同时提取要求，如病毒RNA：HCV（丙肝病毒）,HIV（艾滋病毒）,和HTLV（人类嗜T淋巴细胞病毒）；病毒DNA：HBV（乙肝病毒）和CMV（巨细胞病毒）等等。病毒裂解后，DNA/RNA后在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的病毒DNA/RNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的病毒核酸无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR/RT-PCR分析。 产品特点：

1.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。 3.多次柱漂洗确保高纯度，提取的病毒DNA/RNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用 于各种常规操作，包括PCR/RT-PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。 注意事项： 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2.开始实验前将需要的水浴先预热到特定温度备用。 3.裂解液VLB和去蛋白液RE中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染 皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4.Poly Carrier： Poly Carrier使用方法：如果起始处理量很少，我们推荐使用Poly Carrier，如果预期有较大量核酸产量，用户可以根据需要选择是否加入Poly Carrier。使用时在每个样品提取所需裂解液VLB中加入4μl Poly Carrier储存溶液，将裂解液VLB与Poly Carrier溶液充分颠倒混匀即可(裂解液VLB容易起泡沫，请勿使用涡旋振荡混匀)。也可根据样品数量，在总共需要的裂解液VLB中加入总共需要的Poly Carrier混匀备用。混合液在室温24小时内稳定。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示：第一次使用前请先在10ml漂洗液RW中加入40ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 1.200μl血清等体液（需回复到室温，不足可用0.9% NaCl或者PBS补足）转入上 述1.5ml离心管，加入400μl 裂解液VLB，立刻涡旋振荡充分混匀。

病毒、真核和原核生物的基因组结构特点

病毒、真核和原核生物的基因组结构特点 病毒基因组结构特点： 1.病毒基因组所含核酸类型不同 2.不同病毒基因组大小相差较大 3.病毒基因组可以是连续的也可以是不连续的 4.病毒基因组的编码序列大 5.基因可以是连续的也可以是间断的 6.病毒基因组都是单倍体和单拷贝 7.基因重叠 8.病毒基因组功能单位或转录单位 9.病毒基因组含有不规则结构基因 （1）几个结构基因的编码区无间隔 （2）结构基因本身没有翻译起始序列 （3） mRNA没有 5’端的帽结构 原核生物基因组结构特点： 1.细菌等原核生物的基因组是一条双链闭环的DNA分子 2.具有操纵子结构 3.原核基因组中只有1个复制起点 4.结构基因无重叠现象 5.基因序列是连续的，无内含子，因此转录后不需要剪切 6.编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组，但又远远小于病毒基 因组。非编码区主要是一些调控序列

7.基因组中重复序列很少 8.具有编码同工酶的基因 9.细菌基因组中存在着可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子 10.在DNA分子中具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转 录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的序列，并且含有反向重复序列 真核生物基因组结构特点： 1）真核基因组远远大于原核生物的基因组。 2）真核基因具有许多复制起点，每个复制子大小不一。每一种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体， 即含两份同源的基因组。 3）真核基因都出一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物的单顺反子，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。 4）真核生物基因组中含有大量重复顺序。 5）真核生物基因组内非编码的顺序（NCS）占90%以上。编码序列占5%。 6）真核基因产断列基因，即编码序列被非编码序列分隔开来，基因与基因内非编码序列为间隔DNA，基因内非编码序列为内含子，被内含子隔 开的编码序列则为外显子。 7）真核生物基因组功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远，但即使串联在一起成族的基因也是分别转录的。 8）真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些DNA顺序并无明显生物学功能，似科为自己的目的而级织，故有自私DNA之称，其移 动多被RNA介导，也有被DNA介导的。

RNA病毒基因组提取试剂盒使用说明

RNA病毒基因组提取试剂盒使用说明 货号：R2000 规格：50T/100T 保存：室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。产品内容： 试剂盒组成R2000-50R2000-100 蛋白酶K1ml2ml 洗柱液50ml2ml 结合液25ml50ml×2 漂洗液15ml50ml RNase free ddH2O15ml15ml×2 RNase free吸附柱50个100个 RNase free收集管(2ml)50个100个 产品介绍： RNA病毒基因组提取试剂盒适合于从血清、细胞上清、淋巴液中提取RNA病毒基因组，不适合于细胞等组织内RNA病毒基因组的提取。使用本试剂盒提取的基因组RNA可用于RT-PCR实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入一瓶新开启的无水乙醇，加入到离瓶口约0.5-1cm距离，盖好摇匀。所有离心步骤均在2-8℃条件下进行。 1、取病毒上清液0.5ml，12000rpm离心5min，尽量吸尽上清使用，弃去沉淀（如无沉淀

可省去此步）。 2、向病毒上清中加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化10min，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、吸附柱前处理：从包装中取出吸附柱，放入收集管中，加入700ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中待用。 4、向病毒上清中加入500ul结合液，充分混匀。再向管中加入400ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响RNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。（吸附柱的最大容积为750ul，可分两次加入。一次吸附完离心后再将余下的混合液体加入柱中静置离心。） 5、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。 9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50ul-100ul经65℃水浴预热的RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm离心2min。即可得到高质量的病毒基因组RNA。 注意事项： 1、经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。 2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的RNA提取量也下降。

病毒复制

北京大学医学部
Peking University Health Science Center
病毒的复制
复制（replication） 复制（ li ti ） 病毒在细胞内由病毒基因组引导合成病毒核 酸、蛋白质及其它病毒结构成分，在宿主细胞 质内或核内装配成熟，释放到细胞外的增殖方 式。 复制周期 从病毒体侵入细胞到子代病毒体生成释放， 称为一个复制周期。
病毒复制
The replication of virus
北京大学医学部病原生物学系 邹清华 zouqinghua@https://www.wendangku.net/doc/1a5331118.html,
医学微生物学 精品课程
Medical Microbiology Excellent Curriculum
复制周期
1、吸附 2、穿入 3、脱壳 4、生物 合成 5、组装 6、释放
病毒的复制周期
? 复制早期：识别、吸附、穿入、脱壳。 复制早期：识别 吸附 穿入 脱壳 ? 复制晚期：生物合成、装配、病毒包膜 芽生和释放。 ? 隐蔽期：病毒脱壳后进入复制的生物合成阶段，此时电镜 法在细胞内查不到完整病毒颗粒 血清学方法测不到病毒 法在细胞内查不到完整病毒颗粒，血清学方法测不到病毒 的抗原，也没有感染性，称为隐蔽期（Eclipse?period）。 ? 潜隐期：从病毒进入细胞至释放子代病毒前，细胞外无感 p 染性病毒存在，此段时间称为潜隐期（latent?period）。
病毒的异常增殖
顿挫感染（abortive infection） 顿挫感染（abortive?infection）
病毒基因组不完整或发生了改变。 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶 能量等条件 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶、能量等条件。 以上两方面因素使病毒进入宿主细胞后不能在细 胞内完成增殖的全过程或不能装配出有感染性的 病毒体。 病毒体
伪病毒颗粒 (pseudovirion)
病毒衣壳包裹一段宿主细胞的DNA形成的病毒颗粒。
病毒单周期生长曲线

病毒DNA提取

我要提取一种病毒的DNA，DNA是单链的，外面是病毒的蛋白质外壳包裹。 我的病毒样品是买来的灭活疫苗(vaccine)（干粉状），想用酚/氯仿来抽提DNA，请问病毒干粉要溶解在什么溶液里？ 回复 1、病毒干粉可以溶解在PBS、HBSS或者营养液如1640或MEM中。 2、振荡溶解之后，取上清加入等体积的消化缓冲液(0.5M EDTA pH8.0.1M Tris·HCl pH7.4, 10% SDS) , 再加入蛋白酶K (20mg/ml) 至终浓度50ug/ml, 于50℃消化2 h。 3、取出300ul 的消化产物, 加入等体积的酚抽提一次。 4、用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇再抽提两次,。 5、加入1/10体积的3M 乙酸钠（pH 5.2）和2倍体积的无水乙醇沉淀 6、70% 乙醇洗涤 7、待沉淀干燥后溶于含RNase A (40ug/ml) TE(pH 8.0) 溶液中。 谢谢您回答我的问题，还想请问，从疫苗(vaccine)干粉中提取DNA，跑琼脂糖凝胶电泳，能看到明显的条带吗？病毒干粉要取多少量来提取？另外，我曾经把疫苗(vaccine)中的病毒干粉溶解在无菌高纯水中，结果水变成了红色，应该是有些疫苗(vaccine)佐剂在影响，请问要如何排除疫苗(vaccine)佐剂影响，红色的物质可能是什么？？ 红色的东西应该是保护剂的颜色，保护剂一般是蛋白或其他大分子一类的东西，对DNA提取可能会有一些干扰，如果有条件，可以细胞传代一次最好，不过可能影响也不是很大。疫苗(vaccine)干粉中提取的DNA跑琼脂糖凝胶电泳，能否看到明显的条带，主要与含有的病毒量、提取的DNA量有关。如果后续是扩增基因，微量的可能也就足够了。病毒干粉溶解具体看病毒说明书的推荐，如果没有一般用1-2ml的量来溶解，取多少量来提取DNA，按照说明书一般取300ul左右，如DNAzol。注意提取之前先离心，取上清提取DNA。 血清HBVDNA提取方法 裂解法： 试剂： TES：10mmol/LTris-HCl,pH8.0, 5mmol/L EDTA, 0.5%SDS 150μg/ml蛋白酶K 100μl血清加TES 方法： 65°C3小时 加等体积酚-氯仿-异戊醇,混匀,12000ｒ/ｍｉｎ离心10分钟,将上清吸入一新管 再用等体积氯仿-异戊醇提取一次,在上清中加入1/10体积的2ｍｏｌ/Ｌ乙酸钠和2倍体积的无水乙醇,-20℃放置30分钟(或过夜),沉淀ＤＮＡ,用70%乙醇洗沉淀1次,12000ｒｐｍ/ｍｉｎ离心10分钟,倾去上清,晾干,加100μｌＴＥ缓冲液溶解沉淀 煮沸法提取血清HBV DNA： 吸200ul 血清放入0.5ml EP管中，沸水煮10分钟，10000rpm离心5min

2020年HIV病毒基因组.pdf

学海无涯 编码基因 是两条相同的正链RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb。两端是（long terminal repeats, LTR），含顺式调控序列，控制的表达。已证明在LTR有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列编码了至少9个蛋白，可分为三类：结构蛋白、调控蛋白、。 1．gag基因能编码约500个组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。 2．Pol基因编码前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、，均为病毒增殖所必需。 3．env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和，已证明HIV中和，在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强，能诱导产生抗体反应。 4．TaT 基因编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。 5．Rev是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列（Cis-Acting repression sequance,Crs）去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的蛋白。 6．Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。 7．Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、的产生和体内传播。 8．VPU基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。 9．Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。 HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含基因，但有一功能不明VPX基因。法检查HIV-1与HIV-2的，仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。

血清中病毒DNA提取方法

血清中病毒DNA提取方法。 一煮沸法 从血清中提取病毒DNA，与其它方法比较，此法最为简单，并且很多文献都有报道。 鲁艳芹等在一篇名为《乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒》专利(专利申请号为200610044679)中对六种方法提取血清中乙型肝炎病毒DNA的效率做了比较，得出结果是：NaOH裂解法最佳，其次是直接煮沸法，但该法不适合提取粘稠度较高的血样标本。说明直接煮沸法还是可以的。 另外，陈秀珍等人《采用不同方法提取血清及乳汁中HBV-DNA扩增结果分析》对抽提法、热处理、碱变性法提取乙肝标志物阳性出产妇血清及乳汁中HBV-DNA方法进行评价，发现血清标本HBV-DNA的提取，三种方法无明显差异。 陈秀珍等：取血清100ul，放入0.5ulEP管中，沸水中煮10分钟，10000r/m,离心5分钟，取上清备用。 专利：取血清100ul和100ulPBS，煮沸10分钟，12000rpm, 离心5分钟，取上清备用. 两篇文章所用的煮沸法大致一样,只是是否加PBS的差异。加PBS，这样使得血清在煮10分钟后，不会干掉，没有上清，另外，它不会干扰核酸的提取。加TE是否也可以呢？ 二裂解液煮沸法 郭龙华等《3种方法从血清标本中提取I--IBV DNA 的比较》

比较3种从血清标本中提取HBV DNA方法的效果，选出一种快速、简单、高效提取血清中HBV DNA的方法——裂解液煮沸法，此法提取的HBV DNA模板含量最高，与碱裂解法和蛋白酶K-苯酚抽提法之间的差异显著(P

病毒、细菌基因组结构与功能

泛基因阶段 孟德尔的遗传因子阶段 摩尔根的基因阶段 顺反子阶段 操纵子阶段 现代基因阶段 DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。 一个基因应包含不仅是编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列、5′非翻译序列、内含子以及3′非翻译序列等所有的核酸序列（蛋白质基因和RNA基因）。 根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类 第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因 第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因 是指生物体全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域。原核生物基因组：染色体基因组（chromosomal genome）染色体外基因组（extrachromosomal genome ） 真核生物基因组：染色体基因组（chromosomal genome）染色体外基因组

（extrachromosomal genome ） 生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为 C value paradox，又称C值悖论） 病毒基因组很小，且大小相差较大 病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成 多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成 基因重叠 基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质 形成多顺反子结构 病毒基因组都是单倍体（逆转录病毒除外） 噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的 1981年，美国首先发现获得性免疫缺陷征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），其病原体是一种能破坏人免疫系统的逆转录病毒1986年，命名为：人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV） HIV特异性地侵犯并损耗T细胞而造成机体免疫缺陷 HIV如何感染免疫细胞并复制 捆绑――当HIV病毒的gp120蛋白捆绑到T-helper细胞的CD4蛋白时，HIV 病毒附着到机体的免疫细胞上。滤过性病毒核进入到T-helper细胞内 部，并且病毒体的隔膜融合进细胞壁； 逆转录――滤过性病毒酶，即逆转录酶，将病毒的RNA转化为DNA； 集成――新产生的DNA被病毒整合酶运送到细胞核中，并嵌入到细胞的DNA。HIV病毒被称之为前病毒；

乙肝病毒的复制过程学习资料

乙肝病毒的复制过程 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA 称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA 颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG 及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV 大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着HBv的复制的。 复制的第三步：入核 HBv DNA从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善，形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBv cccDNA)。这个cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝细胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目药物都难以通过这坚韧的核膜，因而对cccDNA 也无可奈何，但cccDNA却掌控着HBv所有的遗传信息，指令着HBv的复制。因此．现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难，这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制，“全部转阴”也只能是一种幻想。 复制的第四步：转录 HBV在这一阶段会以cccDNA为“模子”，像录音带似的把HBv cccDNA上的所有信息全都转录到“信息核糖核酸”(mRNA)上。这个转录过程需要人体内的酶类帮忙，因为所有的