大肠埃希菌中的克隆与表达研究

基金项目:国家传染病重大专项(2008ZX-10003-012)#论著#

Rv2653c在大肠埃希菌中的克隆与表达研究

李邦印孙卫国程小星孙昌文熊志红王仲元王金河苏锐

(解放军第309医院结核病研究室北京100091)

摘要:目的从H37Rv标准株克隆出结核菌Rv2653c基因并进行表达与初步分析。方法根据H37Rv基因组序列合成引物,以PCR方法钓取Rv2653c基因,克隆到pGEM-T上,挑取阳性克隆进行测序,将正确编码基因克隆到pET24b载体上,在BL21大肠埃希菌菌株中以IPT G诱导表达重组蛋白。以金属螯合层析初步分离纯化重组蛋白,采用w estern blo t方法对重组抗原进行抗原性初步分析。结果首先获得了重组的Rv2653c编码的蛋白,表达产率不低于20%,初步纯化纯度约90%,以人血清进行的w estern blo t分析发现,Rv2653c重组蛋白有较好的抗原性。结论获得了Rv2653c重组蛋白为进一步寻探讨其功能及应用价值奠定基础。

关键词:分枝杆菌,结核;大肠埃希菌;细菌蛋白质类;重组蛋白质类

通讯作者:程小星(x c36cn@https://www.wendangku.net/doc/1b5528332.html,)

Clonging and expression of rv2653c gene of M.tuber culosis in E.coli

Li Ban gyi n,Sun W eig uo,Chen g Xiaoxin g,Sun Chan gwen,Xion g Zhihong,

Wan g Zhong yuan,Wan g J in he,Su Rui

The309Hospita l,PLA,Bei jin g100091,Chi n a

Abstract:Objective T o study the expression and pur ification of Rv2653c pr otein of Mycoba c-t er ium tuberculosis ex pressed in E.coli.Methods Rv2653c g enes w ere am plified by po lymerase chain r eaction fr om g enome of Mycoba ct eri um tuber cul osis H37Rv,and first cloned into v ector pGEM T.After the sequence w as confir med,the gene w as subcloned into vecto r pET24b.Recomb-i nant Rv2653c pr otein w as obtained by ex pression and purification.The antig enicity of the fused protein w as analyzed by Western-blo t.Results T he DNA sequences of Rv2653c w ere identical w ith that published by GenBank.The relativ e molecular m ass of the pr otein w as about14kD by SDS-PAGE analysis.The pr otein ex pressed o ccupied more than20%of total bacterial pro teins.T he purity of recombinant pr otein pur ified by N-i NT A w as above90%,and its antig encity w as con-firmed by Western-blot analysis.C onclusions Successful expressio n of Rv2653c gene in E.coli establishes a fo undation o f further function research and it can be a candidate of diagnostic antigens.

Key words:Mycobacter ium t uber cul osi s;Escherichia coli;bacterial proteins;recombinant proteins Correspondence to:Cheng Xiaox ing(x c36cn@163.co m)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycoba cteri um tu-ber culosis)所致的以呼吸道为主的慢性传染病,是目前危害全球人类健康的主要传染病之一。全世界每年约有(800~1000)万新发结核病例。结核病疫情有日益严重的趋势,难于防治,主要原因之一是由于对结核病早期诊断和预防的不足。获得携有足够信

息的结核分枝杆菌抗原,深入研究结核菌基因的功能,从分子生物学角度重新认识结核分枝杆菌凸显其关键性,并持续发掘其免疫诊断工具,变得越来越重要。差减杂交等实验中发现Rv2653c (类似于phiRv2)与phiRv1在部分弱毒和无毒分枝杆菌中是缺失的,且鲜有文献对此进行专门研究[1]。2008年,我们合成了Rv2653c 引物,以H 37Rv 基因组DNA 为模板,用PCR 方法扩增获得了Rv2653c 基因,尝试在pET24b 载体进行了高效表达研究。本实验为进一步研究结核菌的遗传学特征和筛选新抗原奠定了基础。

1 资料和方法

111 菌株和质粒来源 菌株:结核分枝杆菌H 37Rv 株来源于生物制品检定所; E.coli DH 5A 、E.coli BL21(DE3),本室保存。质粒:表达质粒载体pET -24b (N ovagen)。临床抗血清:5例结核病患者血清,结明实验3项检测结果均为强阳性结果,明确诊断为肺结核。

112 主要试剂 EcoR ?,H ind ó,T4DNA Lig -ase (New England Biolabs);琼脂糖、pGEM -T vec -to r System -?、IPT G 、X -Gal 、4@dNTP (Pro -m eg a);Plantinum T aq DNA po lymerase (Invitro -g en);DNA 快速纯化试剂(赛百盛公司);蛋白质分子量标准(Sig ma);Chelating Sepharose Fast Flow 蛋白纯化试剂(A mersham Pharmacia );Wester n blo ting lum ino reag ent (Santa cruz);辣根过氧化物酶标记的羊抗人Ig G(北京中山生物制品公司);引物合成和测序服务(上海生物工程公司)。113 实验方法11311 引物设计 根据结核分枝杆菌基因组序列,针对RV2653c 基因设计一对引物,采用PCR 扩增的方法,以H 37Rv 标准株基因组DNA 为模板,扩增目的基因。直接将基因插入克隆载体pGEM -T 。正义链引物:5c accg gaattcttg acccacaagcgcactaaac;反义链引物:5c g cccaagcttctg tttg ctgtcggg ttcgtc;两端分别采用EcoR I 和H ind III 限制性酶切位点。11312 PCR 扩增Rv2653c 基因 PCR 反应程序:95e @5min;94e @20s,60e @20s,72e @90s,32循环;72e 延伸7min 。

11313 琼脂糖电泳回收DNA 片段 115%琼脂糖电泳结束后,用干净的手术刀片切下约015kb DNA 条带,放入无菌的eppendrof 管中,操作方法参照DNA 回收试剂盒说明。

1

1314 基因克隆与测序 PCR 产物与pGEM-T

连接,参照pGEM -T vecto r Sy stem -?产品说明,克隆载体的鉴定初步采用蓝白斑筛选,然后以PCR 和限制性内切酶酶切的方法鉴定白斑菌落。重组子样品质粒送往测序公司。11315 构建表达载体pET 24b -Rv2与鉴定 EcoR ?和H ind ó限制性内切酶从pGEM-Rv2切下约015kb 大小的基因片段与经过同样双酶切的pET24b 的进行快速连接,然后转化DH 5A ,克隆筛选与鉴定具体方法均参照5分子克隆实验指南6。将pET24b -Rv2重组质粒重新测序。

11316 重组蛋白的表达及其产物鉴定 (1)诱导表达:分别将pET 24b -Rv2阳性克隆质粒转染BL21(DE3),挑单克隆转种于5ml 含50L g/ml 卡那霉素的LB 培养液中,37e 恒温振荡器培养过夜,然后以015%的比例转接到200ml 含50L g /ml 卡那霉素的LB 培养液,37e 培养至OD 600值约018~110时,加入IPTG 至终浓度为011m mol/L,诱导4~5h 。取出,冰浴30m in,离心4000rpm @10m in,收集菌体,用SDS -PAGE 电泳方法鉴定表达产物。(2)纯化重组蛋白末端携6个组氨酸,可通过形成配位键而与金属螯合亲和层析柱上固定化的某些二价金属离子(如镍)结合。试剂及纯化方法参照纯化试剂盒的操作按说明书进行。收集纯化蛋白,用PEG 浓缩后再透析,采用Low r y 法定量蛋白浓度。11317 重组蛋白抗原性分析 取纯化蛋白进行SDS -PAGE,转PVDF 膜,然后以5例临床结核患者血清多抗进行Western blot,采用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 作为二抗,初步分析rRv2653c 的特异性。Western blot 实验操作参照5分子克隆实验指南6和化学发光试剂盒说明进行。

2 结果

211 钓取Rv2653c 基因 以H 37Rv 基因组DNA 为模板,进行PCR 扩增获得了大小约为015kb 的

DNA 片段。

212 Rv2653c 的克隆与鉴定

21211 克隆与PCR 扩增鉴定 由结核菌基因组DNA 扩增来的PCR 片段经纯化后直接与pGEM -T 连接、转化,挑选单克隆菌落快速提取质粒,以此为模板,采用Rv2653c 上、下游引物进行PCR 扩增;鉴定结果见图1。阳性重组子命名为pGEM-Rv2。21212 酶切鉴定 取重组质粒5L l,用EcoR ?和H ind ó双酶切2h;115%琼脂糖凝胶电泳鉴定,重组质粒可以切下约015kb 的片段见图1。21213 序列测定 阳性重组子经测定序列如下:与

报道的序列一致。

1:重组子双酶切;2:marker:200b p,

500bp,750bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp;

3:PCR 方法鉴定重组子

图1 pGEM -Rv2

重组子鉴定

1:marker 250bp,500bp,1500b p,3000b p,5000b p;

2~3:双酶切鉴定重组子

图2 图2pET 24B -Rv2重组子鉴定

213 构建重组表达载体及其重组蛋白的表达和纯化

21311 重组表达质粒的鉴定 采用EcoR ?和

H ind ó双酶切方法鉴定重组子(图2)。发现均可以得到大小约为015kb 的DNA 片段,重组子命名为pET24b -Rv 2,重新测定序列,见图3。序列符合预期。21312 重组蛋白的诱导表达与纯化 pET24b -Rv2重组质粒转化BL21(DE3),用IPT G 诱导表达,收

集菌体,用SDS -PAGE 电泳鉴定表达产物,发现重组蛋白产量约占菌体总蛋白的20%左右。采用Chelating Sephar ose Fast Flow 纯化融合蛋白,最后得到的重组蛋白产品纯度可以达到90%以上(图4)

。

图3 pET 24b -R v2重组子基因序列

1:蛋白分子量标准;2:对照菌体全菌体蛋白;3:重组菌全菌体蛋白;4~7:经过金属螯合层析的重组蛋白样品;8:蛋白相对分子质量标准。

图4 pET 24b -Rv 2重组蛋白的表达与纯化电泳鉴定图谱

21313 重组蛋白抗原性分析 对纯化的融合蛋白进行Western blot 分析,结果见图5。结果显示:重组蛋白与与结核患者血清有较强的反应性,有抗原

性。

1~5:结核病患者的多抗血清。

图5 重组蛋白的wester n blo t 分析

3 讨论

结核分枝杆菌基因组的遗传学演化史就是微生物适应微环境,与时俱进的历史,结核菌不断演化、进化,以适应外环境和人们对结核病的处置方式。部分结核菌菌株测序工作完成后,人们发现结核菌

基因组中有很多外来基因,这些基因可能在结核菌的不同生活时期扮演着不同的角色。

Rv2653c 是我们在强毒菌株与弱毒株间进行差减杂交分析得到的1个基因,基因组大小约10kb,编码107个氨基酸,其富含脯氨酸,与前噬菌体蛋白phiRv1和phiRv2序列有类似性,其蛋白结构与其他细菌中噬菌体包装相关蛋白类似[2-5]

,它们在致病性结核菌如MT B 、牛型分枝杆菌等中存在,而在

非致病的卡介苗等弱毒株的基因组中丢失,有一定的遗传学研究价值,相关文献很少。它们在致病菌中出现而在非(弱)致病菌中缺失的表现非同寻常,值得我们进一步去探索它在结核菌中的功能。目前该蛋白市场上有商品化的国外重组产品,而国内没有相关的研究。

本研究在大肠埃希菌中高效表达Rv2653c 基因,获得了高效表达的工程菌株,得到纯度达到90%以上的重组蛋白。Western blot 分析发现,重

组蛋白与结核病患者血清反应强烈,这充分说明该重组蛋白的抗原性很好。抛开其遗传学的角色概念,该蛋白可能还是一种潜在的诊断用抗原,该蛋白的免疫原性为其血清学检测指示了另外的研究方向。

未来,我们将一方面利用现有的重组蛋白做一些有关其遗传学角色的工作,阐述其在结核菌中的功能;另一方面,我们将进行血清学特异性分析,并尝试作为若干抗原成分之一,开展Elispot 等方面的实验,探讨其是否可作为一种候选的诊断用抗原。

4 参考文献

[1]熊志红,庄玉辉,李国利.差显技术分析结核杆菌H 37Rv 与

H37Ra 差异表达的基因[J].微生物学通报,2005,3(2):57-61.

[2]Bib b LA,H an cox M I,H atfull GF.Integ ration and excis ion b y

the large serin e r ecomb inas e phiRv1integrase[J].M ol M icrob-i ol.2005,55(6):1896-1910.

[3]Bogun AG,Anis imova VA,Stepan shina VN,Sh emiakin IG.

Structur e of deletions detected in th e gen om es of clinical Myco-bacteri um t ubercul osi s s tr ains [J].Probl T uberk Bolezn Legk ,2007,(12):42-47.

[4]Bibb LA,H atfull GF.Integration and excis ion of the Mycobact e -r ium tu bercu losis proph age -like element,p hiRv1[J].M ol M icro -biol.2002,45(6):1515-1526.

[5]H en drix RW,Sm ith M C,Bu rns RN,Ford M E,H atfull GF.

Evolutionary relations hips among divers e bacterioph ages an d prophages :all the w orld .s a phage[J].Proc Natl Acad Sci U S A.1999,96(5):2192-2197.

(收稿日期:2010-07-22)

(本文编辑:范永德)

微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程

微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程 1. 概述 致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。 2. 标本类型 粪便标本。 3. 鉴定 3.1 形态染色与一般大肠埃希菌相同。 3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。 3.3 生化反应与普通大肠埃希菌相似。 3.4 鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。IMViC++--， 3.5 不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。 3.6 操作步骤 3.6.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。 3.6.2 致病型大肠埃希菌的鉴定 肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。

肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA 探针）检测。 肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。 肠出血型大肠埃希菌(EHEC) 早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。 4. 药敏 参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。 5. 质量控制 参见质量管理程序。 6. 检验结果解释与分析 疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。 7. 临床意义

大肠埃希菌

大肠埃希菌 Prepared on 24 November 2020

大肠埃希菌 1.概况：大肠埃希菌是肠道中重要的正常菌群，婴儿出生数小时后就进入肠道中并终生伴随，能为宿主提供一些营养作用的合成代谢产物，宿主免疫能力下降或细菌侵入肠道外组织或器官，即可成为条件致病菌，引起肠外感染，以化脓性感染和泌尿道感染最为常见，某些血清型大肠埃希菌具有致病性，能导致人类腹泻。 2.形态：中等大小的革兰阴性杆菌无芽孢，多数菌株有周身鞭毛，能运动；有菌毛包括普通菌毛和性菌毛 3.体内分布：大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下（如侵入肠外组织或器官）可致病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关，它们是病原性大肠杆菌，正常情况下极少存在于健康机体。 4.培养：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通的琼脂平板37℃培养24小时后，埃希菌形成圆形凸起灰白色S型菌落。在液体培养基中均匀浑浊的生长。 5.生化反应：能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸并产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，可与沙门菌，志贺菌等区别。吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC 试验）为++--，IMViC试验为此结果，可判断为典型的大肠埃希菌，表明被检物已被粪便污染，有传播肠道传染病的危险 6.抗原构造：大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种，已确定的大肠杆菌菌体（O）抗原有173种，表面（K）抗原有80种，鞭毛（H）抗原有56种。O抗原凝聚相对较慢，呈颗粒状。H抗原刺激机体主要产生IgG类抗体，H抗原的凝集出现较快，呈絮状。K抗原位于O抗原外层，为多糖，与细菌侵袭力有关。

7.生物学特性：本属细菌对干燥、腐败、日光等因素具有一定的抵抗力，在外界条件下可以生存数周或数月。对化学消毒剂的抵抗力不强，一般常用消毒剂和消毒方法均能达到消毒目的。通常情况下，对多种抗菌药物敏感。但由于长期滥用抗生素，对常用抗生素耐药现象普遍，不仅影响该病防制效果，而且亦成为公共卫生关注的问题。 8.致病物质 定植因子：又称黏附素（adhesin），可与黏膜表面细胞的特异性受体相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。 外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，最为人所知的是ETEC产生的由质粒编码的不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。LT有抗原性，分子量大，65℃经 30min即被灭活，可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，增加环腺苷酸（cAMP）产生，使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST无抗原性，分子量小，100℃加热30min而不失活，可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性的鸟苷环化酶，增加环鸟苷酸（cGMP）产生，同样引起分泌性腹泻。 K抗原：具有吞噬作用 9.肠道外感染： 败血症：由大肠埃希菌尿道和肠道感染引起的。 新生儿脑膜炎：大肠埃希菌和B组链球菌是婴儿中枢神经系统感染的主要致病菌，约75%大肠埃希菌新生儿脑膜炎分离株具有K1荚膜抗原 泌尿道感染：引起该病的大肠埃希菌多来源于结肠，污染尿道，上行至膀胱，甚至到肾脏和前列腺。 10.肠道感染

大肠埃希菌

大肠埃希菌 1.概况：大肠埃希菌是肠道中重要的正常菌群，婴儿出生数小时后就进入肠道中并终生伴随，能为宿主提供一些营养作用的合成代谢产物，宿主免疫能力下降或细菌侵入肠道外组织或器官，即可成为条件致病菌，引起肠外感染，以化脓性感染和泌尿道感染最为常见，某些血清型大肠埃希菌具有致病性，能导致人类腹泻。 2.形态：中等大小的革兰阴性杆菌无芽孢，多数菌株有周身鞭毛，能运动；有菌毛包括普通菌毛和性菌毛 3.体内分布：大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下（如侵入肠外组织或器官）可致病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关，它们是病原性大肠杆菌，正常情况下极少存在于健康机体。 4.培养：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通的琼脂平板37℃培养24小时后，埃希菌形成圆形凸起灰白色S型菌落。在液体培养基中均匀浑浊的生长。 5.生化反应：能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸并产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，可与沙门菌，志贺菌等区别。吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为++--，IMViC试验为此结果，可判断为典型的大肠埃希菌，表明被检物已被粪便污染，有传播肠道传染病的危险 6.抗原构造：大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种，已确定的大肠杆菌菌体（O）抗原有173种，表面（K）抗原有80种，鞭毛（H）抗原

有56种。O抗原凝聚相对较慢，呈颗粒状。H抗原刺激机体主要产生IgG类抗体，H抗原的凝集出现较快，呈絮状。K抗原位于O抗原外层，为多糖，与细菌侵袭力有关。 7.生物学特性：本属细菌对干燥、腐败、日光等因素具有一定的抵抗力，在外界条件下可以生存数周或数月。对化学消毒剂的抵抗力不强，一般常用消毒剂和消毒方法均能达到消毒目的。通常情况下，对多种抗菌药物敏感。但由于长期滥用抗生素，对常用抗生素耐药现象普遍，不仅影响该病防制效果，而且亦成为公共卫生关注的问题。 8.致病物质 定植因子：又称黏附素（adhesin），可与黏膜表面细胞的特异性受体相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，最为人所知的是ETEC产生的由质粒编码的不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。LT有抗原性，分子量大，65℃经30min即被灭活，可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，增加环腺苷酸（cAMP）产生，使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST无抗原性，分子量小，100℃加热30min而不失活，可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性的鸟苷环化酶，增加环鸟苷酸（cGMP）产生，同样引起分泌性腹泻。 K抗原：具有吞噬作用 9.肠道外感染： 败血症：由大肠埃希菌尿道和肠道感染引起的。 新生儿脑膜炎：大肠埃希菌和B组链球菌是婴儿中枢神经系统感染的

pRSET-EmGFP大肠杆菌表达载体说明

pRSET-EmGFP 编号 名称 北京华越洋VECT--‐310 pRSET--‐EmGFP pRSET--‐EmGFP载体基本信息 载体名称: pRSET--‐EmGFP 质粒类型: 大肠杆菌表达载体；克隆载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 启动子: T7 载体大小: 3.6 k b 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag (6x)；Xpress E pitope T ag 载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin） 克隆菌株: DH5alpha，TOP10F' 表达菌株: BL21(DE3)系列，推荐BL21Star（DE3) 备注: pRSET--‐EmGFP载体的功能是克隆荧光报告基因EmGFP或荧光蛋白EmGFP的表达和纯化，菌体裂解物在紫外灯下肉眼可见荧光。 含 EK (Enterokinase)识别位点。 稳定性: --‐--‐ 组成型/诱导型: 诱导型（IPTG) 病毒/非病毒: 非病毒 pRSET--‐EmGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息

pRSET--‐EmGFP载体序列 ORIGIN 1 CGCGAAATTA ATACGACTCA CTATAGGGAG ACCACAACGG TTTCCCTCTA GAAATAATTT 61 TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACATAT GCGGGGTTCT CATCATCATC ATCATCATGG 121 TATGGCTAGC ATGACTGGTG GACAGCAAAT GGGTCGGGAT CTGTACGACG ATGACGATAA 181 GGATCGATGG GGATCCGAAT TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG 241 GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC 301 CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC 361 CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTGACCTACG GCGTGCAGTG 421 CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA 481 AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC 541 CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT 601 CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAAGGT 661 CTATATCACC GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA CCCGCCACAA 721 CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA 781 CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA 841 CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC 901 TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAACT CGAGAAGCTT GATCCGGCTG CTAACAAAGC 961 CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT AACCCCTTGG 1021 GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATCTGG 1081 CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC

环境监测原始记录表

环境监测原始记录表 环境保护监测中心站 2012年

目录 1. 地表水采样原始记录表19.离子选择电极原始记录表 2. 大气采样原始记录表20.分光光度法分析原始记录表 3. 降水采样原始记录表21.原子吸收分光光度法分析原始记录表 4. 降尘采样原始记录表22.气相色谱分析原始记录表 5. 土壤采样原始记录表23.离子色谱分析原始记录表 6. 底质（底泥、沉积物）采样原始记录表24.细菌总数测定原始记录表 7. 污染源废水采样原始记录表25.粪大肠菌群测定原始记录表 8. 固定污染源排气中气态污染物采样原始记录表26.区域环境噪声监测原始记录表 9. 固定污染源排气中颗粒物采样原始记录表27.城市交通噪声监测原始记录表 10.烟气烟色监测现场记录表28.污染源噪声监测原始记录表 11.pH值分析原始记录表29.机动车排气路检原始记录表 12.电导率分析原始记录表30.一般试剂配制原始记录表 13.色度分析原始记录表（铂钴比色法）31.校准曲线配制原始记录表 14.色度分析原始记录表（稀释倍数法）32.标准溶液配制与标定原始记录表 15.重量分析原始记录表33.样品交接记录表 16.容量法分析原始记录表34.样品分析任务表 17.五日生化需氧量分析原始记录表35.样品前处理原始记录表 18.一氧化碳分析原始记录表36.大气采样器流量校准原始记录表

xx 省环境监测原始记录表（ 1 ） 地表水采样原始记录表 采样目的： 方法依据：GB12998-91 采样日期： 年 月 日 枯 丰 平 pH 计型号及编号： DO 仪型号及编号： 电导仪型号及编号： 采样： 送样： 接样： .第 页 共 页

大肠杆菌基因工程菌常用类型

1、大肠杆菌DH5a菌株 DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr 4、大肠杆菌JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5、大肠杆菌TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr) endA1，nupG 6、大肠杆菌HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7.XL10-Gold菌株：所制备的感受态细胞是目前转化效率最高的感受态细胞，缺失几乎所有已知的限制酶切系统；同时缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性，提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型。

大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α、DH10B

DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’ 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1

大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC化验员。 4.程序： 4.1.简述 4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(36±1℃) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2. 5. 显微镜(1500X)

pMAL-c5x大肠杆菌表达载体说明

pMAL-c5x 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4370 pMAL--‐c5x pMAL--‐c5x载体基本信息 载体名称: pMAL--‐c5x 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5677bp 5' 测序引物及序列: MalE引物: G GTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC; MBP--‐F:GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG 3' 测序引物及序列: 根据实际需要设计 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin氨苄青霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ pMAL--‐c5x载体质粒图谱和多克隆位点信息

pMAL--‐c5X载体简介 The vector pMAL--‐c5X is designed to produce maltose--‐binding protein (MBP) fusions, where the protein of interest can be cleaved from MBP with the specific protease Factor Xa (NEB #P8010). MBP fusions made with this vector are expressed cytoplasmically. The MBP has been engineered for tighter binding to amylose resin. A gene or open reading frame is inserted into a restriction site of the vector polylinker, in the same translational reading frame as the malE gene (encoding maltose--‐binding protein). The fusion protein thus produced can be purified by amylose affinity chromatography. The sequence coding for the four amino acids Ile--‐Glu--‐Gly--‐Arg is present just upstream of the XmnI site. This allows the protein of interest to be cleaved from maltose--‐binding protein with the specific protease Factor Xa. Fragments inserted in the XmnI site (cleaves GAAGG↓ATTTC) will produce a fusion protein that, after Factor Xa cleavage, contains no vector--‐derived r esidues o n t he p rotein o f i nterest. pMAL--‐c5X载体序列 ORIGIN 1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA 61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG 121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA 181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC 241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC 301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG 361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC 421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA 481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA 541 CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC 601 TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG 661 CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG 721 CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA 781 ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA 841 TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATTTCGGTA GTGGGATACG 901 ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC 961 GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA

pET-31b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-31b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4390 pET--‐31b(+) pET31b载体基本信息 别名: pET31b, p et--‐31b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5742 b p 5' 测序引物: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: C--‐His, N--‐KSI 载体抗性: 氨苄 备注: 融合表达有N端酮类固醇异构酶，有助于提高蛋白及小肽的 产量; A lwNI单克隆位点可以用来插入单向重复多肽序列。 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET31b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET31b载体简介 pET--‐31b(+)载体(Cat. N o. 69952--‐3)是设计用来高水平表达蛋白质的载体，载体融合表达有125个氨基酸的酮类固醇异构酶(ketosteroid i somerase p rotein) 。载体上面的AlwN I 单克隆位点允许单向插入串联重复的通过蛋氨酸（methionine）分隔开的多肽序列。 pET31b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 R NA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. N o. 69337--‐3)的作用下终止蛋白翻译。 pET31b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGCAGCATC TGGCATGCGT 181 GAATATTCTT CTCGCCAAAC AAGGCGCGGA TGCTCACCAC CTTGCCGGCG CCATTGAAGC 241 GAAAGTGATC GATGGGCGCA ACTACGGTCT TGCGGCCCTG ATACTCGAAG CTGACGGTGA 301 AAGCGAAGGC CGCTTCGTTG GCGACCGCGC GTACCTCCTG CGTCAGCTCC ACCGCCAAAG 361 GCAGTTTGAG CGAGTTGGCG TAAAACTCAC GAATCGCAGC CGTACCGGAC CTGGGCTCGG 421 AACCCACGGG GTCTTCCACC GTGGCGTCAT CGGCAAACAG CGCGACGATG CCGTCCAGAT 481 CGCCGGCATT GAGCGCAGCC ACAAAGCGCT GTACCACGGC GGTGATGTGT TCTGGGGTAT 541 GCATATGTAT ATCTCCTTCT TAAAGTTAAA CAAAATTATT TCTAGAGGGG AATTGTTATC 601 CGCTCACAAT TCCCCTATAG TGAGTCGTAT TAATTTCGCG GGATCGAGAT CTCGATCCTC 661 TACGCCGGAC GCATCGTGGC CGGCATCACC GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT 721 ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT 781 TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG

第三章原核生物分子克隆载体

第三章分子克隆载体 §3.1 质粒载体 质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。 质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。 质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。 一、质粒的一般特征 1.质粒DNA编码的表型 质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状： a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。 b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；…… c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成； 2.质粒DNA的转移 ①接合型质粒和非接合型质粒 *接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因； *非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。 ②质粒DNA的转移过程 质粒自主转移 质粒的辅助转移 质粒的重组转移 3.质粒DNA的复制类型 根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：

常用大肠杆菌感受态的区别

常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的

LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lac Ⅹ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI

pSP73大肠杆菌表达载体说明

pSP73 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5380 pSP73 pSP73载体基本信息 载体名称: pSP73 质粒类型: 大肠杆菌克隆载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 2464bp 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillian） 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ pSP73载体质粒图谱和多克隆位点信息

pSP73载体简介 The p SP73 V ector o ffers a w ide r ange o f r estriction s ites, p roviding g reater v ersatility in cloning a nd t ranscription o f R NA i n v itro. T he p SP73 V ector c ontains t he S P6 a nd T7 R NA polymerase promoters and a unique multiple cloning region, which includes restriction sites for BglII, EcoRV, ClaI, EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, PstI, SphI, HindIII, PvuII and XhoI. The pSP72 and pSP73 Vectors are essentially identical except for t he o rientation of t he m ultiple c loning r egion. pSP73载体序列 ORIGIN 1 GAACCAGATC TGATATCATC GATGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGGATCC TCTAGAGTCG 61 ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT CAGCTGCTCG AGGCCGGTCT CCCTATAGTG AGTCGTATTA 121 ATTTCGATAA GCCAGGTTAA CCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT 181 TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG 241 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG 301 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG 361 GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA 421 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT 481 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC 541 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CAATGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG 601 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC 661 TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA

pGEX-4T-3大肠杆菌表达载体说明

pGEX-4T-3 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4240 pGEX--‐4T--‐3 pGEX4T3载体基本信息 别名: pGEX--‐4T--‐3, p GEX4T3, p GEX 4T 3 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: Tac 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4968 b p 5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3' 测序引物及序列: pGEX3': C CGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 载体标签: N--‐GST 载体抗性: 氨苄 备注: 复制子是pMB1 稳定性: 瞬时表达 组成型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pGEX4T3载体质粒图谱和多克隆位点信息

pGEX4T3载体序列 ORIGIN 1 ACGTTATCGA CTGCACGGTG CACCAATGCT TCTGGCGTCA GGCAGCCATC GGAAGCTGTG 61 GTATGGCTGT GCAGGTCGTA AATCACTGCA TAATTCGTGT CGCTCAAGGC GCACTCCCGT 121 TCTGGATAAT GTTTTTTGCG CCGACATCAT AACGGTTCTG GCAAATATTC TGAAATGAGC 181 TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT GTGAGCGGAT AACAATTTCA 241 CACAGGAAAC AGTATTCATG TCCCCTATAC TAGGTTATTG GAAAATTAAG GGCCTTGTGC 301 AACCCACTCG ACTTCTTTTG GAATATCTTG AAGAAAAATA TGAAGAGCAT TTGTATGAGC 361 GCGATGAAGG TGATAAATGG CGAAACAAAA AGTTTGAATT GGGTTTGGAG TTTCCCAATC 421 TTCCTTATTA TATTGATGGT GATGTTAAAT TAACACAGTC TATGGCCATC ATACGTTATA 481 TAGCTGACAA GCACAACATG TTGGGTGGTT GTCCAAAAGA GCGTGCAGAG ATTTCAATGC 541 TTGAAGGAGC GGTTTTGGAT ATTAGATACG GTGTTTCGAG AATTGCATAT AGTAAAGACT 601 TTGAAACTCT CAAAGTTGAT TTTCTTAGCA AGCTACCTGA AATGCTGAAA ATGTTCGAAG 661 ATCGTTTATG TCATAAAACA TATTTAAATG GTGATCATGT AACCCATCCT GACTTCATGT 721 TGTATGACGC TCTTGATGTT GTTTTATACA TGGACCCAAT GTGCCTGGAT GCGTTCCCAA 781 AATTAGTTTG TTTTAAAAAA CGTATTGAAG CTATCCCACA AATTGATAAG TACTTGAAAT 841 CCAGCAAGTA TATAGCATGG CCTTTGCAGG GCTGGCAAGC CACGTTTGGT GGTGGCGACC 901 ATCCTCCAAA ATCGGATCTG GTTCCGCGTG GATCCCCGAA TTCCCGGGTC GACTCGAGCG 961 GCCGCATCGT GACTGACTGA CGATCTGCCT CGCGCGTTTC GGTGATGACG GTGAAAACCT 1021 CTGACACATG CAGCTCCCGG AGACGGTCAC AGCTTGTCTG TAAGCGGATG CCGGGAGCAG 1081 ACAAGCCCGT CAGGGCGCGT CAGCGGGTGT TGGCGGGTGT CGGGGCGCAG CCATGACCCA 1141 GTCACGTAGC GATAGCGGAG TGTATAATTC TTGAAGACGA AAGGGCCTCG TGATACGCCT 1201 ATTTTTATAG GTTAATGTCA TGATAATAAT GGTTTCTTAG ACGTCAGGTG GCACTTTTCG 1261 GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC 1321 GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG 1381 TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT 1441 TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT 1501 GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA 1561 ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTGT 1621 TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA 1681 GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAG 1741 TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGG 1801 ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG 1861 TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGC 1921 AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG 1981 GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC 2041 CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG 2101 TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC 2161 GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT 2221 GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA 2281 ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAA 2341 AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG 2401 ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC 2461 GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC