腺相关病毒AAV简介
腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
1.安全性高 4.长时程表达稳定
AAV病毒特点
2.免疫原性低 5.物理性质稳定
3.宿主范围广 6.滴度高
AAV与其他病毒的生物学特性比较
腺相关病毒慢病毒逆转录病毒腺病毒包膜无有有无颗粒直径20-30nm90-100nm90-100nm60-90nm 基因组单链DNA双链RNA双链RNA双链DNA 组织表达持续时间>6个月>2个月>2个月~1个月
随机高频整合随机高频整合非整合宿主基因组整合方式定向低频整合或
非整合
AAV不同血清型
各种不同血清型的AA V载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同研究发现AA V具有多种血清型，
的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有12中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，详见下表。
12种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性
血清型组织亲和性
AAV2/1肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织
AAV2/2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，
AAV2/3肌肉，肝脏，肺，眼
AAV2/4中枢神经，肌肉，眼，脑
AAV2/5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺
AAV2/6肺，心脏
AAV2/7肌肉，肝脏
AAV2/8肝脏，眼，中枢神经，肌肉
AAV2/9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经
AAV2/DJ肝脏，视网膜，肺，肾脏
AAV2/DJ/8肝脏，眼，中枢神经，肌肉
AAV2/Rh10肺,心脏，肌肉，中枢神经，肝脏
A.AAV9感染小鼠脑组织（PMID:23503602）
B.AAV2感染大鼠脑组织
C.AAV2感染肾脏（PMID:23216315）
D.AAV感染心脏（PMID:20703310）
E.AAV9感染骨骼肌（PMID:21811247）
F.AAV感染肝脏（PMID:19861950）
光遗传AAV
光遗传技术提供了一个长期的、受欢迎的神经组织的控制水平：非常精确的激活或沉默特定的大脑区域或细胞类型的能力。然而，仅在过去十年中，神经科学才显著将光遗传技术推向前沿。光遗传技术实现
了神经组织的人为控制，非常精确地激活或抑制特定脑区的活动能力。
类别元件名原理作用效果光遗传学
CHR2(H134R）Na+通道神经元激活
Arch3.0H+通道神经元抑制
eNpHR3.0Cl-通道神经元抑制
CHETA Na+通道神经元激活
ArchT H+通道神经元抑制
C1V1Na+通道神经元激活化学遗传学
hM3Dq Gq-DREADD神经元激活
hM4Di Gs-DREADD神经元抑制
Gs-D Gs-DREADD cAMP信号调控
DTR白喉毒素受体细胞毒性
DTA白喉毒素A链细胞毒性
TeTxLC破伤风毒素轻链
细胞毒性
AAV-神经形态学应用
神经科学家发现的CLARITY技术给临床工作带来了一线曙光。有了CLARITY技术，我们就可以更方便地对人类大脑组织进行区别观察，发现其中的异常情况。而配合CLARITY技术，我们先使用形态AAV病毒对脑组织的各细胞进行标记，从而使得区别观察更容易。
类别元件名作用效果
启动子
CAG
CMV
SYN
广泛的通用启动子
广泛的通用启动子
神经元细胞特异启动子CaMKII兴奋性神经元细胞特异启动子VGAT GABA能神经元细胞特异启动子GFAP星型胶质细胞特异启动子
TH多巴胺能神经元细胞特异启动子
形态学
WGA-cre突触顺行示踪syaptophysin-GFP突触逆行示踪荧光双标AAV cre依赖细胞显示绿色，非cre红色彩虹AAV同一区域不同细胞标记不同颜色
功能学
Gcamp6s指示钙活动
Gcamp6f指示钙活动
Gcamp6m指示钙活动
GEVIs指示细胞膜电位
cre Cre蛋白AAV-SaCas9-gRNA
在体基因敲除系统
最新的基因敲除技术SaCas9
SaCas9（staphylococcus aureus cas9）来自金黄色葡萄球菌，基因长度由经典的spCas9（Streptococcus pyogenes）的4400bp缩短为3300bp，基因大小大幅减少了25%。SaCas9可以被装载进入腺相关病毒（AAV）而不影响AAV的包装和活力，因此提供了一个非常方便有效的在体基因操作工具
Cas9作用模式图
2015年Nature杂志最新报道的可有效在体敲除基因的SaCas9
根据SaCas9的PAM序列NNGRRT设计合成靶向目的基因的guide RNA序列，通过BsaI酶切位点连入AAV载体质粒，包装纯化AAV病毒之后即可注射动物感染目的组织进行目的基因的在体基因敲除
AAV-mRFP-GFP-LC3在体自噬流检测系统
自噬简介
细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。
自噬过程是动态变化的，自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程称为自噬流（Autophagy flux）。自噬流的检测最有效的方式是通过mRFP-GFP-LC3工具来反映。黄色荧光点代表自噬小体阶段，红色荧光代表自噬小体和自噬溶酶体阶段
GFP RFP Merge
最有效的在体自噬流检测工具：AAV-mRFP-GFP-LC3
汉恒生物技术工程师构建RFP-GFP-LC3双标的腺相关病毒（AAV）载体，包装成双标的腺相关病毒，可在体观察自噬，实时检测自噬流的强弱，更加准确、清晰、直观！弥补了LC3自噬双标腺病毒在体转染的缺陷，并且可根据组织器官的亲和性，选择不同的AAV血清型，是最有效的载体自噬流检测工具！
图2.AAV-mRFP-GFP-LC3指示载体脑组织自噬流
（Cell Death Dis.2013Nov14;4:e917）
AAV的多个血清型对心脏都有很好的亲和性。可以通过尾静脉注射、颈静脉注射和心肌原点注射等方式在体注射AAV感染心脏。大量的动物实验和临床实验研究表明通过携带治疗基因，AAV对心血管疾病如心衰和心肌肥大等慢性心脏病均有积极效果。
心脏适用启动子
表达特点
CMV广谱高表达
CAG广谱高表达
cTNT心肌细胞特异表达
U6广谱基因下调
不同血清型AAV感染心脏效率比较
Gene Therapy(2011)18,43–52
注射方式注射量
尾静脉1011v.g/100μL
颈静脉1011v.g/100μL
心肌原点注射（多点）1010v.g/20μL/点
AAV可以通过视网膜下注射或玻璃体腔注射感染眼部组织细胞，目前研究认为AAV 能使外源基因有效地导入感光细胞并能在细胞中长期稳定表达并对细胞无毒性，多项临床实验研究表明通过携带治疗基因，AAV可以有效改善Leber先天黑朦症。AAV有望成为眼部疾病最有效的基因载体工具之一。（一下图片修改过）
通过玻璃体腔或视网膜下注射AAV感染视网膜
不同血清型AAV对眼部和视网膜的感染效果比较
Invest Ophthalmol Vis Sci.2007Sep;48(9):3954-61.
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答 1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？ 有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的 外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。 2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？ 腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完 整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右. 3、如何提高腺病毒的活性？ 提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。 4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？ UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。 5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？ 参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。 Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。 6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？ 1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。 2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。 3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。 4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。 5）感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。 6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。 7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？ 是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会
腺病毒的包装和感染PDF
腺病毒的包装，纯化和感染 技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。 所需试剂： ●293细胞； ●重组好的腺病毒质粒； ●Pac I限制性内切酶； ●质粒回收相关试剂； ●细胞培养、转染相关试剂； ●TBS：10mM Tris,0.9%NaCl,pH8.1; ●40%CsCl：28.45g CsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存； ●15%CsCl：9.085g CsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存； ●Beckman离心管：14*89mm，SW41转头； ●Polybrene(sigma)，10mg/ml； ●透析袋：Spectrum Co.（成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属）， MW=8000~14400； ●灭菌甘油。 操作流程： 1.293细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells在转染前24小时接种 于1或2个60mm培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%； 2.在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm细胞盘需要6μg DNA）。 处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中； 3.用PEI或其他转染试剂将6μg Pac I处理过的质粒转染细胞；
人腺病毒分子生物学常用检测技术
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2017, 6(2), 11-16 Published Online June 2017 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/109188251.html,/journal/amb https://https://www.wendangku.net/doc/109188251.html,/10.12677/amb.2017.62002 The Molecular Biological Techniques for Human Adenovirus Detection Ye Li1,2, Tuo Dong1,2, Vladimir I. Zlobin3, Oleg Reva4, Zhangyi Qu1,2* 1Department of Microbiology, School of Public Health, Harbin Medical University, Harbin Heilongjiang 2Department of Natural-Foci Diseases, Institute of Environment-Associated Diseases, Sino-Russia Joint Medical Research Centre, Harbin Heilongjiang 3Research Institute for Biomedical Technologies, Irkutsk State Medical University, Irkutsk, Russia 4Department of Biochemistry, Bioinformatics and Computational Biology Unit, University of Pretoria, Pretoria, South Africa Received: May 12th, 2017; accepted: May 30th, 2017; published: Jun. 2nd, 2017 Abstract Adenovirus is one of the major viruses causing human respiratory diseases. The effective and rapid method in adenovirus detection is helpful to strengthen the surveillance of adenovirus in-fection, to investigate the epidemic trends timely, and to control the virus infection. The current molecular biological methods for adenovirus detection both used in laboratory and clinical are reviewed in this paper. The principle, characteristics and application of these techniques are commented. Keywords Adenovirus, PCR, Molecular Biological Detection 人腺病毒分子生物学常用检测技术 李烨1,2，董妥1,2，Vladimir I. Zlobin3，Oleg Reva4，曲章义1,2* 1哈尔滨医科大学，公共卫生学院，卫生微生物学教研室，黑龙江哈尔滨 2中俄医学研究中心，环境相关疾病研究所，自然疫源性疾病研究室，黑龙江哈尔滨 3俄罗斯伊尔库茨克国立医科大学，生物医学技术研究所，伊尔库茨克，俄罗斯 4南非比勒陀利亚大学，生物信息学与计算生物学部，生物化学系，比勒陀利亚，南非 收稿日期：2017年5月12日；录用日期：2017年5月30日；发布日期：2017年6月2日 *通讯作者。 文章引用: 李烨, 董妥, Vladimir I. Zlobin, Oleg Reva, 曲章义. 人腺病毒分子生物学常用检测技术[J]. 微生物前沿,2017,
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别？ 腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，包括分裂和非分裂细胞，而无需与宿主基因组整合。它们两之间有几个主要区别：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。 腺病毒简介 腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。表达的发作时间可早于感染后16-24小时。腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。尽管如此，由于它们对大多数组织有高效转导作用，仍被广泛用于研究中。 腺病毒不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达。它可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染。其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低，表达水平还是比较高的。 腺病毒优势 宿主范围广：能够感染分裂期细胞与静止期细胞；对上皮细胞有高度嗜性，尤其适用于感染原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞类型 感染效率高：优于其他病毒载体和转染系统的高感染能力，能达到近100%的效率 包装容量大：最高可插入7.5 kb的外源片段 表达水平高：1-2d即开始高水平表达 安全系数高：去除病毒蛋白编码序列，降低细胞毒性和免疫反应；双质粒转染系统，生物安全性高 无整合风险：无插入致突变性 腺相关病毒简介 AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。 AAV的趋向性也可以通过不同的血清型增强。 AAV的主要缺点是其对目的基因的包装容量较小，并且表达起效较晚（体外2-7天，体内3-21天），然而，该传递系统所产生的免疫应答水平却非常低。 腺相关病毒可以稳定整合至宿主基因组，并且可以在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点。它能对分裂期及非分裂期细胞进行感染。其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1013TU/mL，片段越大，滴度越低。腺相关病毒可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平也是比较高的。 腺相关病毒优势
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则5 4.2.2 共转化方法5 4.2.3 预期结果5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常用技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10 5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表达26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基
腺病毒的一些常见问题及解答
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！ 1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。 同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等： 这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加
的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。 同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。 正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。 以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？ H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高， 二是不用筛选直接用于实验。但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因 素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细 胞传代，外源基因会逐渐丢失。 当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞 相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大 培养。
腺相关病毒知识(汇编)
第一节AAV病毒的生活周期 腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4. 7~6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类（De pendovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。 从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。 AAV的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。 AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,1992; Samulski et al. 1993）。研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV）中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA（Muzyczka 1 992），但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物（DNA聚合酶和末端酶）。1型单纯疱疹病毒（HSV-1）提供辅助功能的情形则有些不同,不仅涉及与HSV病毒基因调节有关的基因包括ICP0和ICP4，还需要HSV病毒DNA复制的所必需的基因产物包括HSV螺旋酶－引物酶复合物（UL5，UL8，UL52）和主要DNA结合蛋白UL29的参与（Weindler F et al. 1991）。这种在辅助功能方面的不同可能反映了腺病毒感染和疱疹病毒感染期间对宿主DNA合成机制的不同影响。 目前的关于AAV工作模式有以下要点：（1）AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒；（2）通过潜伏感染, 病毒基因组得以同细胞共存；（3）只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；（4）如果细胞受到刺激，细胞内环境发生改变而表达应激基因；（5）导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达，从而使AAV病毒复制；（6）产生子代病毒并释放，又感染新的正常宿主细胞，建立新的潜伏状态。 用某些可损伤基因的因素如紫外线照射、γ射线照射、各种化学致癌剂或某些代谢抑制剂处理某种类型的哺乳动物细胞，可使之在无辅助病毒存在的情况下能够发生AAV产毒性感染。虽然这种情形比有辅助病毒存在时每个细胞产生AAV病毒的量要低几个数量级，但上述实验提示AAV病毒并不是一种缺陷性病毒，而是一种强烈偏向于潜伏的病毒。 返回标题 第二节AAV病毒的基因组结构和功能 人2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）的基因组为4681 个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DN A均可被包装到AAV病毒颗粒中。AAV-2基因组的结构如图3-1所示。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Re p蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。
腺病毒防治知识
6－8月，是腺病毒发病高峰期 市疾控专家：掌握预防知识，能够有效防控 腺病毒是新型病毒吗？它有什么特征？ 专家：腺病毒不是新型病毒。它于自上个世纪50年代就被发现并成功分离。目前，已陆续发现了人腺病毒40多个血清型,分为A、B、C、D、E和F六个亚群。我国主要的流行株是B组腺病毒3型和7型。1958年我国长春地区首次出现腺病毒感染的大规模流行，近十年来，全国多个地区有腺病毒暴发和流行的报道。 腺病毒外周没有包膜，对消毒剂如酸和乙醚不敏感，但它怕热，56℃、30分种就能灭活它。腺病毒,在室温中可存活10天左右，显示对理化因素的较强抵抗力。 腺病毒好发季节在什么时间？ 专家：腺病毒感染可常年流行，冬季和春季因人群聚集活动，容易出现腺病毒感染在局部地区的暴发流行；而夏季发生，则常因腺病毒污染游泳池的水，可引起游泳者咽结膜热，也称“游泳池热”。 腺病毒通过哪些环节传染的？ 专家：只要传染源如病人和隐性感染者存在，那么，病毒就能通过呼吸道和眼结膜分泌物、粪便及尿液排出体外，经空气飞沫、密切接触及粪-口途径传播，也能通过水体传播。 哪些人特别容易被传染？ 专家：6个月以上的婴儿和学龄儿童，免疫功能低下者和接受器官移植者容易感染，是腺病毒感染的高危人群，约有一半人感染后没有任何症状，但有传染性。 感染腺病毒后会有哪些症状？ 呼吸道被感染后，会有高热、寒战、咳嗽、鼻塞、咽炎、结膜炎、头痛和肌肉痛等身体不适。 游泳者咽喉结膜热是怎么回事？ 专家：这次游泳儿童咽结膜热是一种腺病毒感染引起的病毒性疾病，潜伏期为3至6天，好发于儿童，可出现持续性高热、咽部充血、单侧或双侧眼睑红肿及结膜充血、扁桃体肿大，可伴有全身酸痛，精神萎靡，食欲不振等全身症状，部分患者有腹泻症状。夏季6至8月为发病高峰期，主要通过呼吸道飞沫及接触方式传播，传播速度较快，多是由于游泳池水被污染，感染游泳者的咽和结膜而引起的。所幸的是，此病愈后良好，一般不留后遗症，病程10天左右，感染后有一定免疫力。 预防腺病毒感染，有哪些好的措施？ 专家：疫苗是最好的预防手段，但是，腺病毒疫苗正在研制中，目前尚无安全有效的疫苗可以使用。 加强卫生管理：加强游泳池的卫生管理，严格执行卫生消毒制度，定期消毒、定期监测水质，保证游泳池设施完善并能正常使用，做好有可能引发疾病传播者的健康筛查，如发热者，腹泻病人、眼结膜炎患者或皮肤病患者等不得入池游泳，以防传染他人。暴发流行期间，相关管理部门可根据疫情控制需要，暂时关闭游泳池、浴池等公共场所，避免疫情扩散。 轻症病人注意事项：应居家治疗休息，自觉避免进入公共场所或参与社交活动。 密切接触者注意事项：病人的洗漱用具等物品要严格与其他家庭成员或同居室人员分开，不能混用，避免交叉污染。病人接触过的物品应擦拭消毒或煮沸消毒后再使用。 注意个人卫生：养成勤洗手、不共用洗漱用品等良好个人卫生习惯。不去卫生条件差、不规范的游泳池、浴池等场所。
人腺病毒
人腺病毒 1基本知识 1.1什么是人腺病毒？ 最初由人体腺样组织分离到的一种DNA病毒。属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，目前已经发现了51个血清型能感染人类。 1.2如何杀灭腺病毒？ 病毒对脂溶剂、胰酶、木瓜酶、RNA酶以及DNA酶有抵抗，对酸碱度和温度的耐受范围较宽，紫外线照射30分钟可灭活,56℃30分钟可将病毒灭活。 1.3腺病毒能引起哪些疾病？ 人腺病毒的51个血清型中，约1/3与人类疾病相关。腺病毒可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等。 l呼吸道感染腺病毒呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等，包括以下4种不同的综合征。? 急性发热性咽喉炎通常为婴儿和儿童发病，出现咳嗽，鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状，这些表现难以与其他病毒引起的轻型呼吸道感染鉴别。 ? 咽结膜热症状与急性发热性咽喉炎相似，但常同时发生结膜炎。咽结膜热有暴发流行倾向，预后尚好，一般无后遗症。 ? 急性呼吸道疾病这一综合征由咽炎、发热、咳嗽和全身不适为特点，常在军队的新兵中流行，多因突然紧张、劳累、聚集等所致。
? 肺炎据国内外研究报道腺病毒肺炎约占婴幼儿期肺炎的10％，大多由腺病毒3、7型引起；在青年人腺病毒肺炎的病死率为8～10％；腺病毒也是引起新兵肺炎的病原之一。腺病毒14型变异株在美国纽约、奥勒冈、华盛顿和德克萨斯等4个州引起急性呼吸道疾病暴发，美国媒体报道，截至2007年12月13日此变异株在美国已造成超过1000人感染，并导致10名重症肺炎患者死亡。 l眼部感染腺病毒致轻型眼部感染是呼吸道感染和咽喉炎的并发症。滤泡性结膜炎可由许多型腺病毒引起，多为自限性。角膜结膜炎为重型感染，具高传染性，以急性结膜炎开始，扩至耳前淋巴结，随后发生角膜炎。 l胃肠炎许多腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出，但大多数血清型与胃肠道疾病无关。腺病毒可引起婴幼儿的胃肠炎，致腹痛、腹泻。l其他疾患腺病毒能引起儿童急性出血性膀胱炎，尿中出现病毒。可引起女性宫颈炎和男性尿道炎，常由性传播感染。在免疫功能低下者可引起偶发或严重的病毒感染，尤其在器官移植病人中发生严重呼吸道感染和病毒性肝炎。艾滋病患者可感染腺病毒。 1.4腺病毒患者的传染性怎样？ 腺病毒角膜结膜炎有很高的传染性,腺病毒肺炎也可造成医院内感染。 1.5腺病毒的传播途径有哪些？ 传播途径主要为呼吸道飞沫和直接接触，也可通过粪口传播。 1.6什么样的人容易感染腺病毒？
Addgene---2016年最火的慢病毒质粒和腺病毒质粒
Addgene---2016年最火的慢病毒质粒和腺病毒质粒 2016年七月，Addgene推出了病毒服务，开始为世界 各地的科学家提供可立即使用的慢病毒和腺相关病毒（AAV）。最初只有几种有限的产品可以在美国供给，但到 了2016年底，Addgene扩大其病毒库存至：25种慢病毒和25种腺病毒。这些病毒被包装成200多个包裹，然后分发 到全球20多个国家。在初步的成功后，Addgene将继续提供和扩大这种多样化且有用的工具组合，使世界各地的研究人员可以加快他们的工作。那么，你是否好奇：到 目前为止，全球研究人员发现最有用的是哪种病毒质粒？为此，Addgene对现有的病毒服务进行了数据统计，并找到了2016年最火的慢病毒质粒和腺相关病毒质粒。TOP慢病毒质粒: lentiCas9-Blast TipsAddgene大部分 病毒库存是基于CRISPR工具，虽然我们提供一些非CRISPR相关的包装后病毒。Cas9是大多数CRISPR应用的头条新闻，并且可以在你选择的细胞系转然这种病毒后进行表达。而各种已设计完成的Cas9突变体可以完成独特的编辑任务，如lenticas9-Blast表达的经典Cas9核酸酶，可以介导DNA双链断裂。Lenticas9-Blast （https://https://www.wendangku.net/doc/109188251.html,/52962/）是一个Cas9表达载体，是由Broad Institute 的张锋实验室发表的（Sanjana et al.，
2014）。它是一个二元载体系统，即通常需要与一个传递gRNA的第二载体结合使用，例如：lentiGuide-Puro。而单载体系统通常在同一个质粒中表达Cas9和gRNA。 lenticas9-Blast病毒可以用来产生Cas9的表达细胞系，可 用于筛选（using pooled CRISPR knockout libraries）和个别基因的敲除（using gRNA lentiviruses）。Cas9的表达有 典型的细胞毒性，所以，在得到高滴度的Cas9慢病毒时会遇到困难。当利用lenticas9-Blast产生Cas9表达细胞时，这种细胞毒性也会导致生长率的变化。为了确保这种生长率的影响不混淆你的实验数据，Addgene建议在进行筛选甚至单基因敲除之前，产生单克隆Cas9表达细胞系。 Top AAV: pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry Addgene目前的AAV库存几乎完全来自于北卡罗来纳州大学的Bryan Roth实验室中表达DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）的病毒。这些可以用来研究在特定的细胞类型（典型的神经元）中激活特定的信号通路的影响。而这类病毒几乎都很受欢迎，PAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry （https://https://www.wendangku.net/doc/109188251.html,/44362/）包含一个融合了mCherry的双floxed人毒蕈碱受体4（Gαi耦合）DREADD，其受人突触蛋白启动子的控制。当第一次使用这种病毒时，Roth实验室建议使用前先进行Cre重组酶表达的验证。当
腺相关病毒概述
腺相关病毒 引言 腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AAV-2）。AAV HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。在AAV HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由和人AAV-2载体ＤＮＡ共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。通过消除对活的辅助病毒的需求，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。 野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。在AAV Helper-Free System中，rep和cap 基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2 ITRs仍位于病毒载体中。AAV rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。本系统可以容纳最大插入3kb。 在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。在本系统中，包含AAV-2末端重复序列的质粒(pAAV-MCS, pAAV-LacZ 和pAAV-hrGFP 以及 pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap 基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2。为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。特殊情况下，只能用pAAV-RC作为rep和cap基因的来源和包含ITR的载体进行共转。 在AAV载体生产和AAV储存液滴度测定步骤中，AAV Helper-Free System都消除了对野生型腺病毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统。而传统的AAV载体滴度测定时，需要野生型腺病毒和AAV载体储存液进行共感染。由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳MOI值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂。在我们AAV Helper-Free System中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。 重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。AAV Helper-Free System具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AAV具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的。AAV Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥107病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。浓缩及纯化方法见参考文献）。 AAV-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AAV-2在长期基因表达方面有特别重要的价值。缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AAV-2基因组于染色体上，并能稳定表达。高速分裂期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因组，并因此失去基因表达能力。病毒整合进基因组也会
腺病毒转染过程
腺病毒转染过程 腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。因为人腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体即CAR（coxsackie/adenovirus receptor）。接下来病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合，通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体。在溶酶体的酸性环境下，腺病毒衣壳的构象将发生变化，被从溶酶体中释放出来，躲过溶媒体的消化作用。最后，腺病毒颗粒转位到细胞核，通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内。相对于脂质体转染，腺病毒基因组进入细胞核是一个非常高效的过程，一般可以达到40%，前者虽然进入胞质的效率与后者相当，而DNA进入细胞核的效率却只有前者的1/1000。一旦病毒基因组进入细胞核，就将进行一系列的复杂而有序的逐级放大的剪切和转录过程。一般的，以病毒DNA开始复制为分界线，按转录时间的先后，将腺病毒基因大致区分为早期（E1~4）和晚期转录单位（L1~5）。各种腺病毒基因又可以进一步地分为更小的转录单位，如E1区可以进一步分为E1A和E1B，每个转录单位都至少有一个独特的启动子。腺病毒基因组进入细胞核后，细胞转录因子首先与E1A区上游的增强子结合，表达E1A蛋白，该蛋白的作用是调节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制。E1A蛋白还可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的启动子，其中E2B驱动另外三个与病毒复制有关的早期基因转录单位末端蛋白前体（pTP, precursor terminal protein）、单链DNA结合蛋白（ssDBP, single-stranded DNA binding proteins）以及DNA聚合酶（DNA pol, DNA polymerase）的表达，这三个基因的表达产物紧密地结合成一个复合物，与至少三种细胞蛋白相互作用，启动病毒基因组的复制。一般而言，DNA的复制是由RNA启动的，而在腺病毒却是所谓的蛋白启动（protein-priming）。如前所述，腺病毒双链DNA的每条单链的5′端有pTP蛋白结合，pTP通过其Ser-OH与DNA 5′端的dCMP 5′磷酸之间形成磷酸二脂键。腺病毒的DNA复制首先是以5′端结合有pTP的dCMP作为引物，以3′端的末端反向重复序列（ITR）为模板，进行链置换（strand displacement）合成，置换出的单链分子可以自我退火环化，形成锅柄样环形分子，然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链DNA分子。病毒基因组复制通常在感染后数小时开始，同时早期基因的转录和翻译被关闭，晚期基因开始表达。大部分的晚期基因的转录是以一个共同的主要晚期启动子（MLP, Major Late Promoter）调控的。实际上，MLP的活性与病毒基因组复制密切相关，有研究表明一旦腺病毒基因组开始复制MLP的活性将明显增强，对此我们将另外行文详述。晚期基因主要编码腺病毒的结构蛋白。病毒结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。腺病毒有明显的种属特异性，人的野生型5型腺病毒（wtAd5）感染其他的非人类细胞（如鼠类细胞）后可以表达早期基因，基因组也可有一定程度的复制并能够形成一些不成熟的病毒颗粒，却不能形成成熟的病毒颗粒，也不能二次感染其他细胞。
人腺病毒知识问答
人腺病毒知识问答 发布时间：2012-02-25 20:19来源：中国CDC网站 1.病原与疾病特征 1.1 什么是人腺病毒？ 最初由人体腺样组织分离到的一种DNA病毒。属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，目前已经发现了55个血清型能感染人类。 1.2 如何杀灭腺病毒？ 病毒对脂溶剂有抵抗，对酸碱度和温度的耐受范围较宽，紫外线照射30分钟可灭活，56℃30分钟可将病毒灭活。 1.3 腺病毒能引起哪些疾病？ 人腺病毒的55个血清型中，约1/3与人类疾病相关。腺病毒可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等。 呼吸道感染腺病毒呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等，包括以下4种不同的综合征： 1 急性发热性咽喉炎。通常为婴儿和儿童发病，出现咳嗽，鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状，这些表现难以与其他病毒引起的轻型呼吸道感染鉴别。
2 咽结膜热。症状与急性发热性咽喉炎相似，但常同时发生结膜炎。咽结膜热有暴发流行倾向，预后尚好，一般无后遗症。 3 急性呼吸道疾病。这一综合征由咽炎、发热、咳嗽和全身不适为特点，常在军队的新兵中流行，多因突然紧张、劳累、聚集等所致。 4 肺炎。据国内外研究报道腺病毒肺炎约占婴幼儿期肺炎的10％，大多由腺病毒3、7型引起；在青年人腺病毒肺炎的病死率为8～10％；腺病毒也是引起新兵肺炎的病原之一。腺病毒14型变异株在美国纽约、奥勒冈、华盛顿和德克萨斯等4个州引起急性呼吸道疾病暴发，美国媒体报道，截至2007年12月13日此变异株在美国已造成超过1000人感染，并导致10名重症肺炎患者死亡。 1.4腺病毒患者的传染性怎样？ 腺病毒角膜结膜炎有很高的传染性, 腺病毒肺炎也可造成医院内感染。 1.5腺病毒的传播途径有哪些？ 传播途径主要为呼吸道飞沫和直接接触，也可通过粪口传播。 1.6什么样的人容易感染腺病毒？ 各个年龄组均可感染，但以婴幼儿和老年人以及免疫功能缺陷者和接受器官移植者容易感染。健康成年人大多不易感。
第七章 腺相关病毒载体
腺相关病毒载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AA V)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒（adeno-associated virus，AA V）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。AA V 能感染多种细胞。Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。 重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。 优点： 以潜伏感染为主；AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。 缺点： AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比逆转录病毒载体低。 在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。 AA V选择的条件 1. 治疗基因的长度不能过大。AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；
腺病毒的一些常见问题及解答整理自丁香园
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答! 1.目前,对于基因治疗的载体选择,很难有一个统一的结论,文章也很多,我将在如下给出。?本人认为,无论选择哪种载体,关键在于此载体在局部的表达效率。无论就是采用ＩN ＶIVO或者ＥＸVIVO的方法,因为我们最终的目的就是要在局部表达我的目的基因,并且使其具有一定的作用。而对于载体的副作用,目前较为公认的就就是病毒载体转染效率高,但副作用大;质粒载体毒性小,但转染效率比较低。 同时,对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体,pEGFＰ、ｐDsReｄ、pEＹＦＰ与pECFP等: 这些载体如果用于细胞水平的检测,也许会更加的方便、直观,但就是,如果用于体内的基因治疗,那就不就是一个理想的载体了。而传统的表达载体如IＮVITROGEN公司()的pCDNＡ载体系列,会更好一些。 同时,为了获得更加高效的表达,一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体,以增加外源基因的分泌表达。? 正如一个疾病的治疗一样,治疗的方法越多,就证明还没有一个最有效地治疗手段。基因治疗的载体也就是同样,很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。 以上就是本人的一点愚见,还请各位同道指正。? ２、转染过小鼠肝癌细胞H２2,请赐教:用什么方法可以达到最佳效果,脂质体、电转还就是重组病毒？如果用脂质体,哪家的最好? Ｈ２２细胞为悬浮细胞,用病毒(逆转录病毒与腺病毒)最为理想,一就是转染效率高, 二就是不用筛选直接用于实验。但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%,且影响因 素多,而腺病毒感染效率高,几乎可达１00%,但只能短期表达(7-1０天),随着细?胞传代,外源基因会逐渐丢失。 当然,H2２也可用脂质体进行转染,筛选应在96孔板上进行,由于培养液少、细胞 相对静止,两周后可见细胞克隆生长,在倒置显微镜下用吸管吸取克隆,进行扩大?培养。 ?3、重组腺病毒作基因治疗,因为不就是很了解,用ＡdEaｓy系统可以不?具体的 实验步骤就是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？ 、BIOgenｅ公司有整个系统,从质粒到细胞都有,我AｄEａsy的基本原理请参阅文献 Ｐroc、Naｔl、Acad、Sci、ＵSＡVol、95、pp、２５０9-2５1４,March 1９98? 4、以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染,查文献,病毒滴度测定用噬斑法,但所用细胞不统一,就是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行不? ?只有能反式提供Ｅ1的细胞才能用来测腺病毒滴度,一般用ＨEK293细胞,用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑。 1)腺病毒E1区有转化细胞能力,出于安全性的考虑,也就是为了增加载体的包装容量,现在通行的腺病毒载体就是E1区缺失的。?２)由于E1区就是复制必需区,所以需要包装细胞系反式提供Ｅ１蛋白,这种细胞系最常见的就就是293系列与９1１细胞。 3)病毒感染性滴度的测定方法有几种。一般就是通过噬斑记数来测定的,所以需要能够支持病变的细胞基质。如果您的病毒带有荧光或颜色标记,可以用一般的细胞系进行滴度测定,前提就是病毒可以感染这种细胞。??５、腺病毒主要通过ＣAＲ介导感染细胞,感染效率不仅与MOＩ有关,而且与靶细胞表面的ＣＡR 表达量相关,例如对于单核细胞,由于CAR表达量很低,无论MOI有多高,感染率都很低;但对于其她多种细胞类型,腺病毒介导的基因转染效率都很高。而对于脂质体介导的转染来说,脂质体与基因载体的用量都有一定的限制,超量使用对细胞的毒性很明显。我个人认为这两种方法的可比性不强,而且后者在大多数情况下转染效率低于前者。 “腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞表面的ＣＡR表达水平与感染时所选定的ＭOＩ“的含义就是什么？?外壳蛋白未经过改造的腺病毒载体对细胞的有效感染需要细胞膜上表达有两个必要的受体,即负责腺病毒与细胞粘附接触的柯萨奇－腺病毒受体(CＡR)与负责将腺病毒内化的整合素型受体(αⅤβ３、αⅤβ５或αⅢβ１)。?上述所说应该就是5型Ad(属于A组腺病毒)。对于B组腺病毒如Ad3５,其细胞受体就是CD４6,