开放实验莲藕

莲藕酶促褐变的抑制及保鲜藕片的制作

1 实验目的:

为有效控制莲藕褐变,试验研究了温度、pH值、底物浓度以及抑制剂对莲藕多酚氧化酶(PPO)的影响。结果

表明:莲藕PPO最适pH值为7.5,最适温度为35℃,以邻苯二酚为底物,米氏常数盂★为0.0273 mol/L。亚硫酸钠、抗

坏血酸(vc)对莲藕PPO活性具有较好抑制作用,乙酸、柠檬酸、植酸、木瓜蛋白酶、半胱氨酸也对莲藕PPO活性具

有一定抑制作用。0.2%Vc+2%7--,酸+o.03%亚硫酸钠抑制剂处理对莲藕褐变的抑制效果最佳。可以通过浸泡亚硫酸钠和抗

坏血酸(vc)、调节pH值、低温贮藏等方法来抑制莲藕PPO活性,控制莲藕褐变。

2 实验原理

本试验以邻笨二酚为底物,用与前人不同试验方法

进行温度试验,测定了pH值、底物浓度、扩大酶抑制剂

的选择范围及抑制剂组合对莲藕PPO活性的影响,并采

用扫描仪无损检测的方法,研究抑制剂对莲藕褐变的影

响,为当地绍兴花红藕生产的保鲜、防褐变提供技术措施。

3实验仪器及材料

1.1试验材料和试剂

莲藕品种为绍兴花红藕,采收于诸暨市,采后12 h

内到达实验室,莲藕带微量泥土,正常大小,清洗后外

观洁白,挑选组织完整、无损伤、无变色部分供试验用:

邻苯二酚、抗坏血酸(u)、柠檬酸、醋酸、亚硫酸

钠、半胱氨酸、木瓜蛋.与酶、植酸、磷酸、磷酸氢二钠、

磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、盐酸、氢氧化

钠、醋酸钠、硼砂,均为分析纯。

1.2试验仪器

721型分光光度计(上海市第三分析仪器厂);

PHS.29A型数显酸度计(上海雷磁仪器厂);LD4—2型离

心机(北京医用离心机厂);MP200B电子天平(上海精

科天平厂);H.H.S电热恒温水浴锅(上海沪南科学仪器

联营厂);SQ6U型扫描仪(上海中晶电脑有限公司)。

4实验步骤

1.3 PPO粗酶液的制备

每个处理准确称取莲藕20.0 g,切碎后加入50.0 mL

磷酸缓冲溶液(pH6.5)冰浴研磨后,低温下离心5 mill

(3000 r/rain),取上清液得粗酶液。

1.4 PPO活性的测定

采用分光光度法测定PPO活性。在l cm比色皿中,加入1.5 mL pH7.0的磷酸盐缓冲溶液,再加入O.1 mol邻苯二酚溶液1.0mL,迅速加入PPO粗酶液0.5mL,混

匀。在420nm波长处测吸光度,每10 s记录1次吸光度

(0/)420)随时间的变化值。最后确定30 s和l min时检

测,在室温下测定PPO的活性(27℃),测定OD420值。以最初直线段的斜率(△OD/t,卜时间,min)计算酶

活力。一个相对酶活性单位定义为:该酶液在测定条件

下每分钟引起吸光度值改变0.001所需的酶量。

PPO相对活性=各处理组吸光度值/同组最佳处理组

吸光度值×100%。

1.5温度对PPO活性的影响

在l cm比色皿中,加入浓度为O.05 mol/L,pH值为

7.0的磷酸盐缓冲溶液1.5 mL,0.1 mol/L的邻苯二酚溶液

1.0 mL。在20"-50℃(间隔5℃一个处理)下保温10 min,

加入相同温度下保温10 mill的PPO粗酶液0.5 mL。在

30 S和l trim。测定03420值。样品重复3次。

另将酶液反应体系分别置于90和100℃恒温水浴下

保温0~70 S,每隔5 s,分别取出试管,冰水冷却,测定

PPO活性,得到PPO对温度的稳定性。试验重复3次。/L

邻苯二酚溶液1.0mL,迅速加入PPO粗酶液0.5mL,混

匀。在420nm波长处测吸光度,每10 s记录1次吸光度

(0/)420)随时间的变化值。最后确定30 s和l min时检

测,在室温下测定PPO的活性(27℃),测定OD420值。以最初直线段的斜率(△OD/t,卜时间,min)计算酶

活力。一个相对酶活性单位定义为:该酶液在测定条件

下每分钟引起吸光度值改变0.001所需的酶量。

PPO相对活性=各处理组吸光度值/同组最佳处理组

吸光度值×100%。

1.5温度对PPO活性的影响

在l cm比色皿中,加入浓度为O.05 mol/L,pH值为

7.0的磷酸盐缓冲溶液1.5 mL,0.1 mol/L的邻苯二酚溶液

1.0 mL。在20"-50℃(间隔5℃一个处理)下保温10 min,

加入相同温度下保温10 mill的PPO粗酶液0.5 mL。在

30 S和l trim。测定03420值。样品重复3次。

另将酶液反应体系分别置于90和100℃恒温水浴下

保温0~70 S,每隔5 s,分别取出试管,冰水冷却,测定1.6 pH值对PPO活性的影晌

配制0.05 mol/L的柠檬酸.磷酸二氢钾缓冲溶液(pH

3.0、3.5),0.05 mol/L的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0、4.5、

5.O、5.5),0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH6.0、6.5、

7.0、7.5、8.0、8.5),O.05 moFL的硼砂.盐酸缓冲溶液

(pH9.0、9.5、10.0),测定PPO活性。试验重复3次。

1.7底物浓度与PPO活性的关系

用浓度为0.05 mol/L,pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液

配置浓度为0.01、O.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、

O.09、0.10 mol/L的邻苯二酚作为底物,在l cm比色皿中,

加2.5 mL不同浓度的邻苯二酚溶液,O.5 mL PPO粗酶液。

在室温下测定PPO的活性。根据Lineweaver-Burk作图

法【lo】得米氏常数^乙(其值酶反应速度为最大速度一半时

的底物浓度,如值愈大,酶与底物的亲和力愈小;%值

愈小,酶与底物亲和力愈大)和最大反应速率Vmax值。

1.8抑制剂对PPO活性及褐变的影响

1.8.1单抑制剂对PPO活性的影响

分别将O.1%抗坏血酸、醋酸、柠檬酸、植酸、亚硫

酸钠、半胱氨酸以及木瓜蛋白酶7种抑制剂溶液与PPO

酶液等体积混合,室温下静置5 min,测定PPO活性。

1.8.2复合抑制剂对莲藕褐变的影响

将整个莲藕用相同体积的12种复合抑制剂浸30 min,取出沥干,常温贮藏,为防止干耗,用聚乙烯薄

膜覆盖,但薄膜不接触莲藕。

半胱氨酸类组合3种:处理1:pH2.44的0.5%半胱

氨酸+2%柠檬酸:处理2:pH2.66的l%半胱氨酸+1%柠

檬酸;处理3:pH2.49的1%半胱氨酸+2%柠檬酸;

植酸类组合3种:处理4:pH2.35的0.1%植酸;处

理5:pH2.27的O.1%植酸+l%柠檬酸;处理6:pH2.42

的0.1%植酸+2%乙酸;

Vc类组合4种:处理8:pH2.65的0.2%Vc+2%乙酸;

处理9:pH2.72的0.3%Vc+l%乙酸:处理10:pH2.41泡的0.3%Vc+1%柠檬酸;处理l 1:pH2.53的O.3%Vc+o.5%

柠檬酸;

亚硫酸钠和Vc类组合2种:处理7:pH2.83的

0.2%Vc+2%乙酸+o.03%亚硫酸钠:处理12:pH2.93的

O.2%Vc+0.5%柠檬酸+0.1%亚硫酸钠。

扫描仪使用红、绿、蓝(R、G、B)3种光源捕捉彩

色图像,RGB值可用Photoshop软件直接读出,并继续在

室温下放置60 h,每隔12 h测定RGB值,对照组采用蒸

馏水处理。用王向阳【16】、施青红【|7】等方法将RGB值换算

成H(hue angle,色度角)值,两者之间的差值反映出莲

藕褐变的程度。

Ⅳ值变化率=(0h时日值-60 h时日值)/0 h时Ⅳ

值×100%、

五.结果与分析

2.1 温度对莲藕PPO相对活性的影响

如图l所示,莲藕中PPO相对活性先随温度升高而

上升,在35℃时达到最大值100%,而后又随温度的升高

而下降,在低于20℃、高于50℃时,PPO相对活性比较

小,因为莲藕PPO在最适温度才处于完全激活状态,而

高温使蛋白质变性。因此,莲藕PPO的最适温度为35℃,

可采用低温贮藏来抑制莲藕PPO活性,延缓褐变。

2.2 pH值对PPO相对活性的影晌

由图3可得,曲线在7.5出现峰值,pH7.0时PPO相

对活性为最大时的85%,莲藕PPO的最适pH值为7.5。

同时在pH5.5处还有一个峰值,说明莲藕PPO可能有同

工酶存在,也可能是因为PPO活性部位含有的His残基

的催化基团咪唑基呈中强酸性,所以在中强酸条件下,

PPO表现出较强的活性。在pH<5.0或pH>8.0时,PPO

相对活性显著下降,pH值为3.0、10.0时,PPO几乎失

活,这是因为PPO是含铜蛋白质,在pH值低于3.0的酸

性环境中,酶中的铜离子被解离出来,与酶蛋白脱离,

使酶失活。而在强碱条件下,铜会解离成氢氧化铜,从

而使酶活性显著降低。因此,调节pH值可有效抑制PPO

活力。

2.3底物浓度与莲藕PPO相对活性的关系

由图4町以看出,随着底物浓度增加,酶促反应速

度呈现增长趋势,当底物浓度增加到一定程度时,反应

速度达到最大值并趋于不变。当『sl≤0.02 moFL时,酶促反应速度与底物浓度成正比关系,表现为一级反应,底

物浓度在0.02~0.09 mol/L之间,反应速度继续增大,表现为混合级反应,当阎>0.09 mol/L时,随着底物浓度的增大,反应速度不再上升,表现为零级反应,反应速度

趋向最大值v雠。由此得出莲藕PPO活性最适反应底物

浓度为0.09 mol/L,并且底物浓度与PPO活性的关系遵

循Michealis.Menten的酶促动力学。

2.4单抑制剂对莲藕PPO相对活性的影响

由图6可以看出,莲藕酶液采用添加PPO抑制剂的

方法来控制其褐变。7种抑制剂中,亚硫酸钠和抗坏血酸

均能在低浓度下对莲藕PPO起到强烈抑制作用,乙酸、

柠檬酸、木瓜蛋白酶也具有一定的抑制作用,其效果分

别为亚硫酸钠的65%、60%和60%,植酸和半胱氨酸抑

制作用较弱,是亚硫酸钠的55%和50%。

2.5复合抑制剂对莲藕褐变的影响

从表l可知,所有处理pH值范围在pH2.27~2.93,

未能发现pH值与褐变的明显关系。也没有发现莲藕明

显伤害。但在夏天嫩藕试验中,发现乙酸浓度过大对嫩

藕有伤害作用。最佳2个处理分别是处理7(0.2%Vc+2%

乙酸+0.03%哑硫酸钠)和处理12(O.2%Vc+0.5%柠檬酸+0.1%亚硫酸钠),两者都含有Vc和亚硫酸钠,再配合

有机酸,pH值相对比较高,分别为2.83和2.93,说明

pH3左右时,是比较适合的。当Vc和亚硫酸钠混合使

用时,在降低抗坏血酸损失的同时使亚硫酸钠直接抑制

酶的作用,延长防褐变效果。Vc与中间产物邻苯二醌作

用生成邻二酸和脱氢抗坏血酸,从而阻止了黑色素的形

成,而亚硫酸钠与酶蛋白发生键合修饰了蛋白质的结

构,对PPO活性产生不可逆抑制。亚硫酸钠对人体健康

有一定的影响,必须考虑其残留量。O.03%亚硫酸钠溶

液浸泡,实际每100 kg莲藕仅仅消耗2--.3 kg液体,所

以残留量是很低的(食品添加剂使用卫生标准规定允许

竹笋、蘑菇里最大添加量为0.6 g,kg,暂无莲藕的残留量规定)。另外,莲藕经过烹饪,S02会进一步挥发。

六结论

1)PPO催化的酶促反应是引起莲藕褐变的主要原

因。莲藕PPO的最适温度是35℃,最适pH值为7.5。100℃

下,热处理25 s即可钝化莲藕PPO的活性。因此,在莲

藕的保鲜过程中,可以通过添加酸味剂,低温贮藏抑制

PPO活性。加工过程中可以通过添加酸味剂,烫漂等方

法来抑制莲藕中PPO的活性,控制莲藕褐变。

2)亚硫酸钠和Vc均能在低浓度下对莲藕PPO起到

较好的抑制作用。其复配效果最好。蛋白酶也有比较好

的效果。乙酸、柠檬酸适合辅助抑制PPO。植酸也有一

定抑制PPO作用,而半胱氨酸抑制莲藕PPO效果不好。

3)最佳防止莲藕褐变的保鲜剂是pH2.83的0.2%vc

+2%乙酸+0.03%亚硫酸钠,其次是pH2.93的

0.2%Vc+0.5%柠檬酸+0.1%业硫酸钠。两者都是含有亚硫

酸钠的保鲜剂,前者亚硫酸钠含量更加低,更加适合用

于莲藕的保鲜。另外也选出不含亚硫酸钠的处理,即

pH2.53的0.3%Vc+0.5%柠檬酸,如果再结合低温和适当

透气真空包装效果会更加好。这些处理对莲藕PPO活性

及莲藕褐变均有很好的抑制作用,作用时间也长。

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