线虫的EMS诱变和突变体筛选2015

线虫的EMS诱变和突变体筛选

摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。

关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体

1.引言

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存

线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。

基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。

目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症(Alzheimer’s, AD)，多囊肾病(polycystic kidney disease)，Duchenne 肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。

甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，

最终获得能够稳定遗传的突变体。

2.材料和方法

2.1材料、试剂和器材

实验材料：N2型秀丽隐杆线虫。

实验试剂：NGM（Nematode Growth Media）固体培养基、LB液体培养基、M9线虫生理溶液。

实验器材：培养皿、报纸、锥形瓶（500ml、300ml、100ml）、15ml离心管、蓝枪尖、黄枪尖、Ep管、5ml的塑料试管、高压蒸汽灭菌锅、离心机、酒精灯、移液枪（1000ml、200ml）。

2.2方法

2.2.1仪器的洗涤、包装与灭菌，相关溶液的配制。

（1）仪器的洗涤与包装

①用自来水洗涤55mm培养皿（我们组一次性洗12个培养皿），晾干后用报纸包装好，以待灭菌。

②洗涤500ml锥形瓶，300ml锥形瓶，100ml锥形瓶，15ml离心管若干，锥形瓶装入液体后，用锡纸封口，15ml离心管用报纸包好，以待灭菌。

③将蓝枪尖和黄枪尖塞入枪尖盒，用报纸包装好以待灭菌。

④将Ep管和5ml的塑料试管管放入玻璃瓶中，用报纸封口，以待灭菌。

（2）相关溶液的配制

①NGM（Nematode Growth Media）固体培养基的配置

按表1配置NGM固体培养基

表1NGM固体培养基的配方

②LB液体培养基的配置

按表2配置LB液体培养基

表2LB液体培养基的配方

③M9

按表3配M9线虫生理溶液

表3 M9线虫生理溶液的配方

(3)

①打开高压蒸汽灭菌锅，设置灭菌温度120℃和灭菌时间10分钟，待压力上升到0.05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀，高压锅继续升温，自动灭菌。

②在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。

2.2.2倾倒NGM平板，摇菌与铺板

（1）倾倒NGM平板

①紫外灭菌无菌操作台5分钟。

②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。

③待固体培养基冷却至60℃，在酒精灯附近逐一倾倒平板，保证每个平板有NGM固体培养基约10ml。

④在培养皿皿盖上做好标记（包括组名，日期），待NGM固体培养基冷却后，如果不用菌液铺板，就用封口膜封口后倒置于4℃冰箱保存，如果菌液已经活化，则可直接铺板。（2）菌种的活化与铺板

①紫外灭菌无菌操作台5分钟。

②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。

③取出两管高压后的15ml离心管，用移液枪吸取液体配养基3ml,加入原始的OP50菌液300μl，过夜摇菌。

④取200~300μl活化的菌液均匀地铺在NGM固体培养基里，用手摇动晃匀菌液，封口膜封口后，平置于操作台上待菌液被吸收。

⑤等菌液被NGM固体培养基吸收后（一般20分钟），在37℃培养箱倒置培养，等细菌长出薄薄的一层（一般12-24hr）即可接线虫或倒置放在4℃冰箱保存。

⑥摇菌剩余的菌种可以与甘油1比1混合，颠倒摇匀，至于-20℃保存。

2.2.

3.怀卵成虫的同步化

（1）选择一个含有大量怀卵成虫的培养皿，用3mlM9洗下，放入5ml的塑料试管，加入0.8ml20%次氯酸钠，0.4ml0.5M的NaOH（事先配置次氯酸钠和NaOH各1ml）。10min后，虫体破裂，溶液变澄清。

（2）3000转离心1min，弃上清。

（3）4mlM9，混匀，3000rpm，离心1min，弃上清。

（4）重复步骤（3）2~3次以去除残留的裂解液。

（5）加入0.2ml M9，混匀。

（6）将液体接种于NGM上，20℃培养，约56hr达到L4或20℃培养24hr,转至25℃培养大约21-22hr达到L4。

2.2.4.EMS诱变和突变体筛选

（1）无菌条件下，将培养皿中处于L4早期的雌雄同体线虫用5ml M9悬浮，用移液器转移至无菌离心管中。

（2）1000rpm离心30s，去除上清，加入2mL M9。

（3）另取一只离心管，加入M9 2ml 以及20μl EMS ，拧紧盖子，振荡混匀。

（4）2mL 含线虫M9倒入2mL 含EMS M9 中，混匀，用封口膜密封。

（5）室温放置4~5 h ，混匀30min 。

（6）1000rpm 离心30s ，去除上清，加入3-4mL M9清洗。

（7）重复（6）3~4次。

（8）自然沉淀，去上清，留下1mL 连同虫子转入NGM 板上,每一个NGM 板上加200ul ，20℃培养2天后至产卵，移去成虫；

（9）继续20℃培养若干天后连续观察，筛选能够稳定遗传的突变体及突变体的子代。

3.结果

在4×（或10×）显微镜下观察到的线虫突变体和对照组如图所示。

3.1运动轨迹变化突变体

图一 运动轨迹变化突变体的筛选 图一所示的是运动轨迹变化的突变体。图1是野生型线虫的运动轨迹，设为对照组，图2至图5是突变后线虫的运动轨迹，设为实验组。图2的运动轨迹较野生型相比更为平缓，图3的运动轨迹较野生型相比更为陡峭，而图4突变体的运动轨迹呈麻花状，图5突变体的运动轨迹极不规则并且十分纠结。这些都是可能是线虫的突变体，但我们发现运动轨迹奇怪的突变体的子代轨迹又往往正常化了，我们做了如下推测：①运动轨迹的突变体是不可遗传的，表现为运动轨迹突变体可能是由环境决定的，或者是线虫发生体细胞突变引起的；②运动轨迹的突变体发生的突变可能是隐形突变，因此在后代所占比例太少，而且运动轨迹在虫子太多的时候又难以观察，所以难以获得稳定的运动轨迹奇怪的稳定遗传的突变体；③运动轨迹奇怪的线虫本身并没有发生突变，可能是由于自身兴奋而产生了奇怪的运动轨迹。

3.2形态特征变化突变体

12

31

4151

1 2 3 4 5 6

图二形态特征变化突变体的筛选

图二是形态特征变化的

突变体。图1是野生型成体

期线虫的形态特征，设为对

照组，图2至图6是突变后

线虫的形态特征，设为实验

组。图2是严重卷曲，极少

移动的成体期线虫突变体，

图3是背部长小泡的成体期线虫突变体，图4是身体细长，并且头尾很尖的L4期线虫突变体，图5是短粗的成体期线虫突变体，图6是只能向左转弯的成体期运动障碍突变体。其中，在这几种突变体中，身体细长，并且头尾很尖的突变体和向左转弯的运动障碍突变体是可遗传的显性突变体，其他几种突变体的后代都是野生型形态的线虫，不是稳定的突变体。

4.讨论

（1）使用高压蒸汽灭菌锅时，一开始当压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后（也可以在5分钟之后），再关闭放气阀，以完全排除锅内空气，使灭菌才能彻底。（2）灭菌完后，如果时间紧急，可在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。

（3）所配置的液体培养基高压后要分装在几个小量程的锥形瓶中，这样如果操作过程中液体培养基被污染，可防止配置的液体培养基全被污染。

（4）摇菌的时候一种菌摇两管，这样可以保证如果一管菌的菌种引入了杂菌，另一管菌液如果没被污染就还能用。

（5）无菌操作台在使用前应该先紫外灭菌5分钟，操作之前双手也应该用酒精消毒，以防止操作过程中造成实验污染。

（6）细菌要倒置培养，防止水蒸气滴到固体培养基上，影响微生物的生长、线虫的运动和杂菌污染。

（7）在用菌液铺板时，如果培养的是野生型线虫，为了让线虫均匀地在培养基上大量生长，需要均匀地铺板，如果是观察诱变体，则将菌液集中滴在中间，使线虫集中生长，利于观察突变体。

（8）在做同步化的时候，一定要观察到培养皿上有大量化卵成虫再做同步化，不然得到的同步化的虫子会特别少。

（9）如果同步化得到的虫子很少，有两种方法补救：①找一个含有大量化卵成虫的皿再做同步化；②在野生型线虫培养基上选取一块线虫生长时期相同的区域，挖下来，接到新的培养基上，多挖几块继续培养，这样数小时后得到的虫子基本还应该是同一时期的。

在做同步化的时候可以多同步化几个板，这样如果一个板同步化失败了，还会有一个板可以补救。

（10）诱变过程中一定要将EMS洗干净，否则诱变时间太长，线虫会死掉。

（11）一定要让菌在37℃培养箱里铺满再接线虫(一般6~16个小时)，否则容易在挑突变体的过程中造成杂菌污染，如果op50在培养基上长满了，就会形成优势菌种，这样就很难造成杂菌污染。

（12）当菌长满培养皿的时候，若不立即接种，可以在4℃倒置放置一段时间，但不要放置时间过长，原因如下：①菌的寿命也有限，时间越长，菌的活性越低；②菌的尸体会影响对线虫的观察。

（13）Op50所生长的NGM固体培养基是没有加氨苄的，操作不当容易长菌。长菌的板容易使线虫诱变，所以在超净台上操作的时候一定要注意不要污染。

（14）在找突变体之前可以先观察突变体线虫的样板，对照着样板的突变体找诱变的突变体，找到突变体之后再将其与野生型突变体对比，以确认找到的突变体是否典型。

（15）找突变体的时候在解剖镜下找，这样好挑线虫，挑线虫的时候要用灼烧过又冷却至室温的的pick挑，以免污染培养基。观察突变体线虫的时候在显微镜下观察。

（16）刚从培养箱或冰箱里拿出来的培养基上可能有少许水，可先将其在桌面上倒置一会儿再使水流到培养皿皿盖，然后再用火烤烤皿盖将水烤干，倘若培养皿上水汽太多，刚刚接入的线虫会成游泳状运动，让人误以为是突变体。

（17）整个实验过程中要估计好线虫生长时间，在20℃，线虫的生长周期大约是4天，如果没有及时挑突变体，可以根据线虫的生长周期推断挑的突变体是F1代突变体还是F2代突变体等，不过这种方法也不能保证诱变的培养基中的突变体是第几代，因为基因突变也可以是自发产生的。因此，培养基一定要事先配好，不要误了挑选突变体的时间，这样才能一步步地筛选能够稳定遗传的突变体。

（18）挑完突变体一定要找同时期的野生型线虫在同一显微镜下作对比，这样可以确保找到的突变体是否真的与野生型不同，在进行对比的时候不要反复地调节细准焦螺旋，因为在调节细准焦螺旋的时候会产生视觉误差，就算是同一只线虫在转换细准焦螺旋观察的时候也会觉得粗细有所变化。

（19）在观察运动障碍的突变体时，只有细心观察才能找到运动障碍的突变体，我们找到的只能向左转弯的运动障碍突变体就需要长时间的观察才能找到，它的头部总是在摇摆，当感觉要向右运动时就突然停止运动，而是向后退，但是大多数情况，这种线虫会向左运动。（20）长菌的培养皿容易诱变出气泡的突变体，由于这种形状是环境诱导的，很可能是不可遗传的突变，因此，长泡线虫的后代几乎观察不到身体上有小泡的线虫。

（21）本实验的连续性强、时间跨度大，因此要注意每步实验操作，避免出现错误（如没有无菌操作、没有及时挑取突变体等），否则就会对实验结果产生影响。

（22）长菌的培养基并不影响线虫生长，只是影响线虫观察影响，尽管少数时候会诱导长泡型的突变体产生，但是千万不能因此去用pick挑走菌落，这样不但会使培养基里长出更多因挑菌而产生的分散的菌落，还极有可能将隐藏在菌里面的线虫突变体或卵挑走。我们实验最后突变体的培养皿中只能观察到很少的突变体可能就是这种挑菌行为造成的。

（23）当转移突变体的时候不慎混入非突变体的线虫，要尽量用pick挑走，否则突变体的后代会混入大量野生型线虫，不利于观察突变体后代。

（23）此次挑选突变体的过程繁琐，可以做如下改进：①在用EMS诱变4~5个小时之后转移线虫至NGM培养基的时候可以每个培养皿放10只虫子，转3~4个皿，转入过多的虫子对后代突变体观察造成障碍②当差不多每个NGM培养基里的亲代线虫产出100个卵的时候，用M9洗走培养皿中的线虫，因为诱变的线虫的最先排出的卵是最容易产生突变体的，这样使后面的筛选工作变得省时省力。③3天之后培养中就长成了F1代成体线虫可供观察，再过20小时，（20℃时，线虫在由卵长到可以排卵的成体线虫需要65个小时，96个小时即达到排卵最大值）便可用M9洗走培养皿中的F1代线虫，等F2代线虫长到特定时期观察突变体。这种方法获得的2代线虫突变体概率多至25%，突变率大大提高。④3天之后便可挑选F2代线虫突变体，将每中突变体挑选一只放到新的NGM培养基中，观察F2代线虫突变体产生的F3代是否也为突变体，如果还是突变体表形，则证明我们获得了能够稳定遗传的突变体，

如果F3代不为突变体表形，那么，就说明我们选取的F2代线虫突变体是不可以稳定遗传的突变体。对于稳定遗传的突变体可至于-80℃长期保存。

参考文献

［1］THE ART AND DESIGN OFGENETIC SCREENS:CAENORHABDITIS ELEGANS. Erik M. Jorgensen* and Susan

E.Mango

［2］张文霞，戴灼华.遗传学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2007.

ISO14001：2015 环境管理体系标准

ISO14001:2015环境管理体系标准 引言 0.1.背景 达到一个平衡的环境,社会和经济被认为是基本满足现代人的需求又不损害后代人满足其需求的能力。可持续发展作为一个目标是通过平衡可持续发展的三大支柱。 社会对可持续发展、透明度和问责的期望已经从环境污染、资源利用效率低下、废物管理不当、气候变化、生态系统退化和生物多样性丧失等方面发展了越来越严格的立法，对环境造成了越来越大的压力。 这使得环境管理组织采用一种系统化的方法通过实施环境管理体系,目的是促进环境可持续发展的支柱。 0.2.环境管理体系的目的 本标准的目的是为组织提供一个框架，来保护环境和应对不断变化的环境条件与社会经济平衡的需要。它指定要求,使一个组织能够实现预期的结果集的环境管理体系。 一个系统的环境管理方法，可以为高层管理人员提供信息，来建立长期的成功和创建选有助于可持续发展的: ——保护环境预防或减轻不良环境影响; ——减轻潜在的不利环境条件对组织的影响; ——协助组织实现合规义务; ——提高环境绩效; ——控制或影响组织的产品和服务的设计、制造、分布式、消费和处理，通过使用生命周期的角度来看,可以防止环境影响生命周期内无意中被转移到别的地方; ——实现财务和运营效益的同时,还实现环保的替代品,加强组织的市场地位; ——环境信息交流有关利害关系方。 本国际标准,就像其他国际标准,并不打算增加或改变一个组织的法律要求。 0.3.成功因素 环境管理体系的成功取决于承诺所有级别和功能的组织,由最高管理层组织利用机会来预防或减轻不良环境影响,提高有益的环境影响,尤其是那些具有战略和竞争的影响。高层管理可以有效地解决其风险和机遇,将环境管理融入到组织的业务流程、战略方向和决策,使他们与其他业务优先级,将环境管理融入其整体管理系统。示范的成功实现本国际标准可以用来向利害

新版环境管理体系内部审核员培训试题(AB卷)

ISO14001:2015版标准内审员培训考试（A/B卷） 一、单项选择题：（从下面各题选项中选出一个最恰当的答案，并将相应字母填在下表相应位置，每题3分，共45分，不在指定位置答题不得分）。 1、实现（）之间的平衡被认为是既满足当代人的需求，又不损害后代人满足其需求的能力的基础。 A.社会、经济和政治 B.发展、环境和社会 C.社会、发展和环境 D.环境、社会和经济 2、ISO14001:2015标准旨在为各组织提供框架，以保护环境，响应变化的（），同时与社会经济需求保持平衡。 A.环境状况 B.环境因素 C.环境污染 D.环境法律 3、ISO14001:2015标准规定了使组织能够实现其为环境管理体系所设立的（）的要求。 A.预期结果 B.最终结果 C.环境目标 D.环境方针 4、下列关于ISO14001:2015标准，下列描述正确的是（） A.采用该标准本身并不保证能够获得最佳环境绩效 B.采用该标准本身并不保证能够获得最佳环境结果

C.只要遵守了法律法规，就可以保证组织能够获得最佳环境绩效 D.只要遵守法律法规，就可以保证组织能够获得最佳环境结果 5、通过将环境管理（），最高管理者就可以有效应对其风险和机遇，一个组织可以通过对本标准的成功实施，使相关方确信其已建立了一个有效的环境管理体系。 A.融入到组织的业务流程，战略方向和决策制定过程 B.与其他业务的优先项相协调 C.纳入组织的整体管理体系中 D.以上都是 6、采纳ISO14001:2015标准本身并不保证能够获得最佳环境结果，本标准的应用可因组织所处环境的不同而存在差异，两个从事类似的活动，但具有不同的（）的组织，均可能满足本标准的要求。 A.合规义务、环境方针和环境目标 B.合规义务、环境方针、环境技术和环境绩效 C.合规义务、环境方针和环境技术 D.合规义务、环境方针承诺、环境技术和环境绩效目标 7、下列关于PDCA.过程与标准框架之间的关系的表述正确的是（） A.环境管理体系的预期结果是环境管理体系的输出 B.环境管理体系输出的结果就是体系的有效性和环境绩效 C.第7章“支持”属于环境管理体系策划阶段 D.相关方的需求和期望是环境管理体系唯一的输入 8、依据ISO14001:2015标准，下述有关标准范围的描述不正确的是（） A.适用于任何组织，无论其规模、类型和性质 B.适用于组织确定的其可控制或能够施加影响的环境因素，不强求考虑生命周期观点 C.环境管理体系的预期结果包括：提升环境绩效，符合合规义务，实现环境目标

诱变剂的作用机理

3．1甲基磺酸乙酯( EMS) EMS分子式CH3SO2OC2H5,中文名为甲基磺酸乙酯,无色液体,分子量124,水中溶解度为8%。pH7条件下在水中半衰期20℃时是93 h, 30℃时26 h。EMS是烷化剂的一种。烷化剂通常带有1个或多个活性烷基,此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去,使碱基许多位置上增加了烷基,从而在多方面改变氢键的能力。EMS被证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似,是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变主要通过两个步骤来完成,首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,成为一个带正电荷的季铵基团,从而发生两种遗传效应:一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,代替胞嘧啶,发生转换型的突变;二是由于鸟嘌呤的N27烷基活化,糖苷键断裂造成脱嘌而后在DNA复制过程中,烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基替换,即G∶C变为A∶T。当然,化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异,但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式。这样的点突变将是品种改良和退化特性恢复的希望所在。诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应,形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断,产生染色体的缺失。这些DNA结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活,而表现出被掩盖的性状。EMS化学诱变产生点突变的频率较高,而染色体畸变相对较少,可以对作物的某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比,EMS诱变后产生的突变频率高,且多为显性突变体,易于突变体的筛选。EMS是目前运用最广泛也是公认最为有效的诱变剂。 3.2叠氮化钠( NaN3) NaN3等电点是pH=4. 18,在pH=3时NaN3溶液中主要产生呈中性的分子HN3,易透过膜进入细胞内,以碱基替换方式影响DNA的正常合成,从而导致点突变的产生。由于NaN3只作用于复制中的DNA,所以处理种子时把种子预浸到种胚中,有利于提高处理效果。NaN3具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点。在酸性溶液中对大麦叶绿素缺失和形态突变诱发非常有效。 3.3平阳霉素(PYM) PYM是一种抗生素,属于博莱霉素的一类,是博莱霉素的A5组分。目前主要作为抗肿瘤药应用于临床,对多种癌症具有较好的疗效。抗生素具有高度选择性,能抑制细胞的生长,其中的大多数对维持生命有重要意义。作为一种新的诱变剂, PYM在许多实验中均被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。与EMS的诱变特点相近,在某些方面优于EMS,很具有开发和应用前景。

环境管理体系审核方法简易版

The Daily Operation Mode, It Includes All The Implementation Items, And Acts To Regulate Individual Actions, Regulate Or Limit All Their Behaviors, And Finally Simplify Management Process. 编订：XXXXXXXX 20XX年XX月XX日 环境管理体系审核方法简 易版

环境管理体系审核方法简易版 温馨提示：本操作规程文件应用在日常的规则或运作模式中，包含所有的执行事项，并作用于规范个体行动，规范或限制其所有行为，最终实现简化管理过程，提高管理效率。文档下载完成后可以直接编辑，请根据自己的需求进行套用。 环境管理体系审核是指组织内部对环境管 理体系的审核，是组织的自我检查与评判。内 审的过程应有程序控制，定期开展。内审应判 断对环境管理体系是否符合预定安排，是否符 合ISO14001标准要求。环境管理体系是否得到 了正确实施和保持，并将审核结果向管理者汇 报。 环境管理体系审核对象是环境管理体系， 一次完整的内审应全面完整地覆盖组织的所有 现场及活动，覆盖ISO14001环境管理体系标准 所有要素，并包括组织的重要环境因素受控情 况，目标批标的实现程度等内容。

环境管理体系审核应保证其客观性、系统性和文件化的要求，应按审核程序执行。内审的程序应对以下内容进行规定： A、审核的范围，可包括审核的地理区域、部门或体系要素； B、审核的频次，应根据组织自身的管理状况和外部机构要求确定； C、审核的方法，一般可包括检查文件及记录，观察现场及*作，与相关人员面谈等； D、审核组的要求和职责，如审核组长及组员的能力与职责等； E、审核报告及结果的要求和报送办法等。在开展每次审核前应制定审核计划（方案），包括人员与时间的安排。审核的内容应立足于所涉及活动的环境重性和以前审核的结果。

线虫的EMS诱变和突变体筛选2015

线虫的EMS诱变和突变体筛选 摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。 关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体 1.引言 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存 线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。 基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。 目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症(Alzheimer’s, AD)，多囊肾病(polycystic kidney disease)，Duchenne 肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。 甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，

环境管理体系的建立过程正式版

Guide operators to deal with the process of things, and require them to be familiar with the details of safety technology and be able to complete things after special training.环境管理体系的建立过程 正式版

环境管理体系的建立过程正式版 下载提示：此操作规程资料适用于指导操作人员处理某件事情的流程和主要的行动方向，并要求参加施工的人员，熟知本工种的安全技术细节和经过专门训练，合格的情况下完成列表中的每个操作事项。文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用。 随着可持续发展战略在全球的实施，环境保护正朝着污染预防的方向发展。这要求组织以主动自觉的方式从其管理职能上推动生命周期的环境管理，将环境保护贯穿渗透到组织的基本活动过程中，以促进组织环境表现的持续改进。实践表明，为实现这一目的，在组织中需要一种系统的结构化管理机制。环境管理体系正是这样一个有效的方法工具。建立环境管理体系，必须以ISO14001标准为规范、 ISO14004标准为指南，并结合国家的法律法规和环境标准。需要特别指出的是：

ISO14001是用于对组织所拥有的环境管理体系进行认证、注册和自我声明的规范标准。因而其对环境管理体系的规定和表述，更侧重于从审核认证或自我声明的角度对环境管理体系的建立和实施提出基本要求。相反，GB/T24004-ISO14004则是一个拟用于对环境管理体系进行认证、注册或自我声明的标准。它作为一个组织由于自身环境管理的需要而自愿选用的支持工具，为组织的环境管理体系的建立、实施及改善提供了具体而广泛的指导。在各类组织的实际应用中，不同的组织所建立的环境管理体系，其特定形式，具体内容等有可能并不完全相同，这取决于组织及其活动，产品或服务过程的具体特点和复杂

2015版环境管理体系标准

2015年环境管理体系标准标准目录 1.范围 2.规范性引用文件 3.术语和定义 4.组织所处的环境 4.1理解组织及其所处环境 4.2理解相关方的需求和期望 4.3确定环境管理体系的范围 4.4环境管理体系 5.领导作用 5.1领导作用与承诺 5.2环境方针 5.3组织的岗位、职责和权限 6.策划 6.1应对风险和机遇的措施 6.1.1总则 6.1.2环境因素 6.1.3合规义务 6.1.4措施的策划 6.2环境目标及其实现环境目标的策划

6.2.1环境目标 6.2.2实现环境目标措施的策划 7.支持 7.1资源 7.2能力 7.3意识 7.4信息交流 7.4.1总则 7.4.2内部信息交流 7.4.3外部信息交流 7.5文件化信息 7.5.1总则 7.5.2创建和更新 7.5.3文件化信息的控制 8.运行 8.1运行策划和控制 8.2应急准备和响应 9.绩效评价 9.1监视、测量、分析和评价9.1.1总则 9.1.2合规性评价

9.2内部审核 9.2.1总则 9.2.2内部审核方案 9.3管理评审 10.改进 10.1总则 10.2不符合与纠正措施 10.3持续改进 4组织所处的环境 4.1理解组织及其所处的环境 组织应确定与其宗旨相关、并影响其实现环境管理体系预期结果的外部和内部问题。这些问题应包括受组织影响的或能够影响组织的环境状况。 4.2理解相关方的需求和期望 组织应确定： a)与环境管理体系有关的相关方； b)这些相关方的有关需求和期望（即要求）； c)这些需求和期望中哪些将成为其合规义务。 4.3确定环境管理体系的范围 组织应确定环境管理体系的边界和适用性，以界定其范围。 确定范围时组织应考虑： a)

EMS诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用

农作物化学诱变育种是人为地利用化学诱变剂，诱发作物发生突变，再通过多世代对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育成生产上能利用的作物新品种。化学诱变具有成本低廉、使用方便、诱变作用专一等特点，是一种迅速发展的农作物育种手段。目前，在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯（EMS ）被认为是应用最好的诱变剂[1～6] 。EM S 诱变技 术在国内外已成为一种成熟的技术，在玉米诱变育 种中得到广泛的应用。 1ＥＭＳ诱变技术 EMS ,即甲基磺酸乙酯，是一种烷化剂，烷化剂EM S 所诱发的突变主要通过以下步骤来完成。烷基化位点主要在G （鸟嘌呤）的N-7位上[6]，由于G 上N-7的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季铵基团产生两个效应：一是促进第一位氨基上氢解离，使G 不再与C 配对而与T 配对，从而造成G:C-A:T 转换（图1）。 二是N-7成为季铵基团后，减弱了N-9位上的N-糖苷键，而产生了去嘌呤作用。大部分的无嘌呤 位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，则在无碱基位置上可以通过插入任何一个碱基，在第二轮复制以后，则原来的G ∶C 对可以变为任何碱基对G ∶C 、C ∶G 、A ∶T 、T ∶A ，既有转换,又有颠换（图2）。此外，它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失[6]（图3）。 EMS 诱变技术及其在创造玉米新种质中的应用 安伟，樊智翔，马海林，米小红，王计虎 （山西农业科学院玉米研究所，山西忻州034000） 摘要：综述了EMS 的作用机制、作用特点及EMS 在创造玉米新种质中的应用等方面的内容，并对EM S 在玉米遗传育种研究中的 利用前景进行了论述。 关键词：EM S ；诱变技术；玉米；新种质中图分类号：S513.032 文献标识码：A 文章编号：1002-2481(2008)12-0037-03 Induced Mutation Technique and Application of EMS to Create New Corn Germplasm AN Wei ，FAN Zhi-xiang ，MA Hai-lin ，MI Xiao-hong ，WANG Ji-hu (Maize Research Institute ，Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Xinzhou Shanxi ，034000，China) Abstract:The mechanism 、property and application of EMS for creation of new corn germplasm etc.was reviewed in the paper.The prospect of EMS utilization in research of corn genetic and breeding was also pointed out. Key words: EMS ；Induced Mutation Technique ；Corn ；New germplasm *收稿日期：2008-11-13 作者简介：安伟（1975-），男，山西代县人，助研，主要从事玉米遗传育种工作。 Journal of Shanxi Agricultural Sciences 山西农业科学2008，36（12）：37～39图1N-7烷基化鸟嘌呤由于N-1位上H 的电 离而与胸腺嘧啶配对,从而导致G:C-A:T 转换 图2N-7烷基化鸟嘌呤通过去嘌呤作用导致转换和颠换 37

ISO14001：2015环境管理体系内审员培训大纲

ISO14001：2015环境管理体系内审员培训（12H） （主讲：上海蓝草咨询） 课程特色： 清晰易懂：课程中穿插行业案例辅助讲解，确保课程内容清晰明了； 实战训练：在课程的每一阶段均设有案例研究时间，供学员发挥，确保学员能够融会贯通； 逻辑思维：课程注重逻辑性，层层渐进； 教学互动：学员均可提出其企业面临的实际问题，讲师将在课堂上进行现场剖析研究，确保技术真正实用易行 第一部份、ISO14001：2015标准培训 一、环境管理体系概要 1、新版标准的关键变化 2、推行新版标准的关键变化给企业带来的作用 3、14001:2015关于文件化信息要求的探讨； 4、术语定义变化； 5、具体描述措词、要求变化 二、环境管理体系基础术语和基本要求 1、以“过程”取代“程序” 2、背景 3、环境管理体系的目标 4、成功因素 5、PDCA循环 6、标准内容 三、ISO14001:2015标准条款讲解 1、范围 2、参考标准 3、新增加的术语和定义 4、组织背景的理解和审核要点

5、领导职责的理解和审核要点 5.1领导的职责的承诺 5.2环境方针 5.3组织的职责、作用和权限 6、策划的理解和审核要点 6.1识别与相关的风险 6.2环境目标和实现环境目标的策划 7、支持的理解和审核要点 7.1资源 7.2能力 7.3意识 7.4信息交流 7.5文件化信息 8、运行的理解和审核要点 运行策划和控制 8.2应急准备和响应 9、绩效评价的理解和审核要点 9.1监视、测量、分析和评价 9.2内部审核 9.3管理评审 10、改进的理解和审核要点 10.1不符合和纠正措施 10.2持续改进 四、与质量标准的整合 1、标准如何有效整合 2、哪些文件可以共用 3、需要建立的体系文件有哪些

EMS诱变

EMS?诱变？ 常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。 小心点，那东西剧毒且致癌。 人工化学诱变技术: 化学诱变技术是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做“化学诱变剂”。其特点有：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基；后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。 诱变剂主要包括5类，他们的特点、机理和应用如下： 1、烷化剂：能使一些碱基烷基化，比如使鸟苷酸甲基化，影响mRNA的转录，从而使蛋白质的表达紊乱，使得蛋白质重组，而改变了性状。临床上应用此类物质作为抗癌药物，具有强烈杀伤癌细胞的作用，所以在应用在于植物上时，也要注意他的强烈杀伤性。 主要有：甲基磺酸乙酯（EMS），是最常用的诱变剂，我们曾用作真菌的遗传标记，诱变率很高。常用浓度0.05-0.5mol/L，作用时间5-60min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。SIGMA公司价格：80元/25ml。 硫酸二乙酯（DMS），也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用，作用机理和使用方法和EMS基本相同。属于剧毒品，受公安局管治。 乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。只要用于大量诱变育种用，使用浓度： 0.0001-0.1%，高度致癌性！使用时需要使用缓冲液配置。 盐酸氮芥，用于抗癌药物，可以从药店买到，但有些地方必须有主任医师的处方。一般是针剂，稍加稀释即可使用，作用时间5-10min，可用甘氨酸作为终止剂和解毒剂。 环磷酰胺、亚硝基胍等物质也可作为诱变剂使用，但较少使用。 2、碱基类似物：分子结构类似碱基，导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有：6-溴尿嘧啶、6-BudR、马来酰肼、2-氨基嘌呤等，同样属于抗癌药物，可到药店买到，稍加稀释即可使用。 3、嵌入剂：是分子生物学比较常用的一类，诱导率较高。原理是这类分子的大小正好可以嵌入碱基分子中，导致错配。最常用的：溴化乙锭（EB），高致癌性！价格较贵，但诱变率很高，是实验室常用试剂，可以到生化实际商店买到，1500元/100mg. 4、无机化合物：比较容易得到，效果一般，危险性较小。常用：氯化锂，白色粉状，使用时配成0.1-0.5%的溶液，作用30min-2d。可到化工商店买到：120元/500克。

环境管理体系建立过程

环境管理体系建立过程 各类企事业单位、公司、政府机关，无论是它们的结合体或部份(以下统称为组织)，无论是何种文化背景和所有制性质，无论它们处于何种环境表现水平和环境管理水平，都可按ISO14001标准的规范要求实施适用于组织自身的环境管理体系(以下简称为EMS)。EMS是个动态的，需不断发展和完善的体系，建立程序与其运作模式没有本质的区别，都遵循著名的"策划-实施-检查-改进"管理循环理论(简称PDCA循环)，通常可分解为如下六个阶段和过程。 一、领导决策与准备：EMS是组织全面管理体系的组成部分，环境保护对于组织具有深远的战略意义，EMS的建立与实施需要投入人、财、物等各种资源，因此，必须首先得到最高管理者(层)的明确承诺和支持。最高管理者应任命环境管理者代表，授权其负责建立和维护体系，并向其汇报体系情况。组织应组建一支精干的EMS工作组，在管理者代表的领导下，在通过国际标准、环境知识、环境法律等培训后，即可着手建立体系。 二、初始环境评审：初始环境评审是组织明确环境管理现状的手段，其结论是建立EMS 的技术基础和前提条件。管理者代表和工作组应精心策划和实施评审，充分调动发挥各部门的积极性和作用，广泛收集信息资源，编制评审报告。初始环境评审的内容主要包括： (1)明确组织应遵守的与环境相关的法律法规标准及其他要求，对组织的环境表现进行评价，确定改进的需求和可能性; (2)利用产品生命周期分析的思想明确组织产品、活动和服务中可以控制和可能施加影响的环境因素，评价出重要环境因素，以作为改进和控制的对象; (3)收集、分析和评审组织现有与环境相关的管理制度、职责、程序、惯例等信息资源和文件，与ISO14001标准要求对照，确认有益合理成份，以作为EMS的基础。(4)对以前的环境条件和市场信息进行分析评审，以避免环境风险，争取竞争优势。

【参考借鉴】完整版ISO14001-2015环境管理体系.doc

RRRRRRR有限公司 环境手册 ISO14001-2015 文件编号：EM-01 A/10 编写： 审核： 批准： 发布日期：2017年9月10日实施日期：2017年9月10日

目录 第1 章概述 1.1 颁布令 1.2 公司简介 1.3 管理者代表任命书1.4 环境手册的管理

第2章管理体系范围 第3章手册引用文件、术语和定义3.1 引用标准文件 3.2 术语和定义 第4章组织的背景 4.1理解组织及其所处的环境 4.2 理解相关方的需求和期望 4.3确定管理体系的范围 4.4管理体系及其过程 第5章领导作用 5.1 领导和承诺 5.2 环境方针 5.3 组织的岗位、职责和权限 第6章质量环境管理体系策划 6.1 应对风险和机遇的措施 6.1.1 总则 6.1.2 环境因素 6.1.3 合规义务 6.1.4 措施的策划 6.2 环境目标及其实现策划 6.2.1 环境目标 6.2.2 实现环境目标措施的策划 第7章支持 7.1 资源 7.2 能力 7.3 意识 7.4 信息交流 7.4.1 总则 7.4.2 内部信息交流 7.4.3 外部信息交流 7.5 文件信息 7.5.1 总则 7.5.2 创建和更新 7.5.3 文件信息控制 第8章运作 8.1 运行策划和控制 8.2 应急准备和响应 第9章绩效评价

9.1 监视、测量、分析和评价9.1.1 总则 9.1.2 合规性评价 9.2 内部审核 9.2.1 总则 9.2.2 内部审核方案 9.3 管理评审 第10章改进 10.1 总则 10.2 不符合和纠正措施 10.3 持续改进

诱变方法

EMS的诱变处理方法： ①EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。 ②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml 菌悬液（107-108ml-1）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含106 ml-1。 ③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。处理的最终浓度为0 .lmol／L。对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。 ④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。 EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。 亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO 和NO2 （一）亚硝酸的诱变机制 脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。A→H，C→U，G→X。A：T→G：C和G：C→A：T。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。 亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。（二）亚硝酸的处理方法 1．试剂的配制 （1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液

（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液 以上试剂用前均要灭菌。 2．处理方法 取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。稀释分离于平板。 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。 羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。 1.羟胺的诱变机制 当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯，也具有诱变作用。 2．羟胺的处理方法 常用浓度为0.1％-5％，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些。 六、金属盐类 用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。 氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时通常加到培养基中。 为了速免受破坏．倒平板时，当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3％-1.5%。实验思路：出发菌株（酶活较大菌株编号）—紫外诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行化学诱变——EMS 和DES诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行氯化锂诱变——最终获得突变菌株 注：每次均需要做对照，测酶活，目的菌株选择：透明圈直径：菌落直径（HC值）较大的菌株进行下一步的诱变。

水稻EMS诱变

水稻EMS诱变 1、EMS诱导水稻中花11突变体的筛选和鉴定,顾佳清，等.上海农业学报，2005，21(1)：7～ll。这篇文献所使用的方法主要是：（1）先用清水浸种16h，再用0.5%的EMS在28℃下处理4h，播种，收种子（M1）。 （2）将M1代种子用清水浸种16h，用0.5%的EMS在28℃下处理4h，再用0.7%的EMS处理4h，播种，收种子M2代。 （3）将M2代播种，筛选突变植株。 在这篇文献中，经两次诱变后，突变率达12.4%，有各种突变体产生，其中有叶片形状的突变。只是两次诱变所花时间长。 2、三种化学诱变剂对不同水稻品种的生物学效应研究，彭波，等.湖南人文科技学院学报，2007年8月，第4期。这篇文献主要使用的方法是： 用三种浓度（0.5%，1.0%，2.0%）的EMS，在26℃的培养箱中处理水稻种子12h，再用清水冲洗4h，播种。其中0.5%的发芽率最高，在80-90%之间，1.0%的发芽率在40%-50%之间，作者认为这种半致死量（1.0%）的浓度为诱导水稻突变的最佳浓度，我想对我们工作来说，我们是寻找表皮和气孔的突变体，所以用0.5%的比较适宜。 3、水稻“9311"突变体筛选和突变体库构建，叶俊，等. 作物学报，第32卷第10期，2006年10月 1525～1529页。这篇文献主要使用的方法是： 将9311种子浸种16 h，用0.4％ EMS处理8h。

4、Selection of stable mutants from cultured rice anthers treated with ethyl methane sulfonic acid.Joong Ho Lee & Seung Yeob Lee. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71: 165–171, 2002。这篇文献主要使用的方法是： 用0.5%的EMS在25±2 ?C下处理，轻微摇晃6h。 所以，我们诱变可以选用0.5%的EMS，在25 ?C下处理6-8h为宜。

EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725

EMS突变体致变基因鉴定 在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。 根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略： 方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。 方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。

变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。 方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量

又可降低测序成本。由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。 水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。该方案一中针对具有明显表型的突变体方案包括以下三个步骤：（1）测序样本的选择及测序深度的确定 选择连续多代自交的突变体植株，以及野生型植株个体，提取基因组DNA，按照标准的Illunima 建库流程，建立插入片段为350bp 的文库，根据不同作物基因组大小进行30X测序。 （2）基因组重测序数据的获得与生物信息学分析 通过对测序数据的质控之后，将获得的reads同野生型基因组序列进行，找出测序数据中的SNP、InDel，对全基因组的SNP纯合度进行分析，找出可能的突变位点，并进一步采用其他分析软件进行确认，从而锁定出突变表型相关位点及基因。 （3）突变位点的鉴定和扩大群体中验证 根据生物信息学获得突变位点信息，利用Sanger测序进一步在突变体中进行验证。

2015版环境管理体系 要求及使用指南资料

2015版环境管理体系要求及使用指南 标准目录 1.范围 2.规范性引用文件 3.术语和定义 4.组织所处的环境 4.1理解组织及其所处环境 4.2理解相关方的需求和期望 4.3确定环境管理体系的范围 4.4环境管理体系 5.领导作用 5.1领导作用与承诺 5.2环境方针 5.3组织的岗位、职责和权限 6.策划 6.1应对风险和机遇的措施 6.1.1总则 6.1.2环境因素 6.1.3合规义务 6.1.4措施的策划 6.2环境目标及其实现环境目标的策划 6.2.1环境目标 6.2.2实现环境目标措施的策划 7.支持 7.1资源 7.2能力 7.3意识 7.4沟通 7.4.1总则

7.4.2内部沟通 7.4.3外部沟通 7.5形成文件的信息 7.5.1总则 7.5.2创建和更新 7.5.3形成文件的信息的控制 8.运行 8.1运行策划和控制 8.2应急准备和响应 9.绩效评价 9.1监视、测量、分析和评价9.1.1总则 9.1.2合规性评价 9.2内部审核 9.2.1总则 9.2.2内部审核方案 9.3管理评审 10.改进 10.1总则 10.2不符合与纠正措施10.3持续改进

4组织环境 4.1理解组织及其环境 组织应确定与其目标相关、并影响其实现环境管理体系预期结果的能力的外部和内部因素。这些因素应包括受组织影响的或能够影响组织的环境条件。 4.2理解相关方的需求和期望 组织应确定： a)与环境管理体系有关的相关方； b)这些相关方的有关需求和期望（即要求）； c)这些需求和期望中哪些会成为其合规义务。 4.3确定环境管理体系的范围 组织应确定环境管理体系的边界和适用性，以界定其范围。 确定范围时组织应考虑： a) 4.1中提及的外部和内部因素； b) 4.2中提及的合规义务； c) 组织的单元、职能和物理边界； d) 组织的活动、产品和服务； e) 组织实施控制与施加影响的权限和能力。 范围一经确定，在该范围内组织的所有活动、产品和服务均须纳入环境管理体系。 应保持体系范围的形成文件的信息，并可为相关方获取。 4.4环境管理体系 为实现包括提升环境绩效在内的预期结果，组织应根据本标准的要求建立实施、保持并持续改进环境管理体系，包括所需的过程及其相互作用。 组织在建立和保持环境管理体系时，应考虑在4.1和4.2中所获得的知识。 5领导作用 5.1领导作用和承诺 最高管理者应通过以下方式证实对环境管理体系的领导作用和承诺。 a)对环境管理体系的有效性承担责任； b)确保建立环境方针和环境目标，并与组织的战略方向和所处的环境相一致；

ISO14000环境管理体系建立的步骤

ISＯ14001体系得筹建工作,从体系得策划设计启动至最终得体系认证,主要分为６个阶段。 一、策划设计阶段 1、了解期望目标，调查现存问题 （1)首先,了解公司最高管理者经营观念与对品质、环境系统得期望; (2)在得到公司最高管理者对环境体系得建立认可得基础上，对公司得主要问题进行调查; ①系统地调查企业组织机构及各部门职能; ②总结现有组织结构存在得问题； ③系统地总结现有品质系统存在得缺陷与问题，提出相应得建议; ④撰写调查报告，确定认证模式； ２、确定环境体系管理者代表，制订咨询计划 (1)结合公司实际情况，详细安排认证咨询时间； （2)由公司高官层在公司管理层中确定环境体系管理者代表,授与其如下职权: ①按标准规范要求建立、实施与维护环境管理体系; ②向最高管理层汇报体系得运行情况以供管理层评审，并为体系得改进提供依据; ③负责协调体系建立与运行过程中各部门间得关系，为最高管理者提出建议。 ④环境管理者代表应就是组织中具有相当级别得管理者,建议至少由具备相关知识得中层管理者,最好就是副总经理级得管理者担任。 （３)由环境体系管理者代表提出对咨询方得具体要求； （4）由环境体系管理者代表组织公司相关人员参加认证咨询与培训。 3、建立取证组织机构 （1)由环境体系管理者代表建立ISO１4000工作小组,确定小组成员; （2）由ISO１4００0工作小组初步确定EMＳ体系职能部门得成员与职责范围； (3）由环境体系管理者代表与ISO14０0０工作小组讨论确定公司得环境方针; 4、部门间得职责分工(ISＯ1400０工作小组负责） （１）制定公司各部门得职责分工表； （２）制订职责分工草案; (３）与各部门负责人开会讨论，确定部门职责分工得方案; (4）与公司高管层讨论，如有修改,再次进行（3）与（４)得循环；最终确定部门职责分工得正式方案； （５）公司董事长审定批准部门职责分工得正式方案。 5、列出文件清单（ISO140０0工作小组负责) (1)列出环境手册得框架结构; （２）列出程序文件清单,指出各部门具体分担得内容; （３）列出工作文件类别； (4）与各部门讨论文件清单，确定各部门具体分担得文件清单。 二、培训辅导阶段（培训由认证咨询部门进行) 1、IＳO140０0工作小组与EMS部门成员培训 (1）由认证咨询师准备教材； (2)安排认证咨询师进行现场培训; （３）讨论手册与程序文件得内容、结构； （４）问题答疑； 2、文件编写人员得培训 (１）确定文件编写人员； (2）由认证咨询师准备教材;

石蜡油-EMS花粉诱变技术

EMS(EthylMethaneSulfonate,甲基磺酸乙酯)是一种烷化剂,其诱变机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变体主要通过两个步骤完成:首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,而后在DNA复制过程中,烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基交换,即G∶C变为A∶T,形成点突变。 早在60年代,人们就已开始采用EMS水溶液处理植物种子,但诱变效率很低。自Neuffer 等(1978)将EMS溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后,石蜡油_EMS处理花粉诱变技术在国外广泛应用起来。Greaves等(1986)采用含0.667×10-3EMS的石蜡油处理玉米自交系的成熟花粉40min,在M2代施以除草剂的筛选环境,获得抗除草剂Pursuit突变体,该突变体含抗除草剂显性基因。1987年美国ICI种子公司用EMS处理花粉获得糯质、甜质玉米突变体。张铭堂(1989)采用该技术获得诱变率为0·2%的糯质基因。据报道,AllenWright等在M3后代中筛选出10个高赖氨酸突变材料。中国农业大学等单位开展了特用玉米突变体的筛选研究。石蜡油_EMS花粉诱变技术,由于诱变剂直接作用于配子,具有诱变率高,诱变范围广,且产生的突变体多为点突变的特点,较传统电离辐射优越。研究表明,石蜡油_EMS处理花粉,平均每个位点上单个基因的隐性和显性突变率可达千分之一和万分之一以上,可以在较大的诱变后代群体中筛选出目标突变体。该技术将是改良自交系和进行种质创新的有效工具。 诱变剂：EMS(甲基磺酸乙酯)，德国产。 载体剂：液体石蜡天津产。 诱变处理：参照Neuffer的花粉诱变方法，具体见参考文献31。 (4)诱变材料种植:为了处理方便和工作人员安全,该处理自交系(Mo)行距加宽到75cm,株距按常规种植; (5)Mo预处理:提前根除杂株;在诱变的前一天下午,雌穗剪苞叶,雄穗去掉老花药后分别套袋。 (6)处理液制备:参照Neuffer的方法。在通风橱内,按照1mLEMS:100mL液体石蜡的比例配制母液,在磁力搅拌器上搅拌1h混合均匀;在大田处理前,配成所需浓度。本试验采用了大多数人认同的浓度0.667×10-3和比它低的1×10-4以及比它高的1×10-3,1.5×10-3,2×10-3共5个浓度;C对照,为纯石蜡油处理。 (7)田间诱变处理:在适当的时间,收集新鲜花粉,过筛除去花药后,按照1体积花粉:10体积处理液的比例于棕色瓶里,在混匀器上间断的混匀,处理45min后,在田间用毛笔把相应的花粉授在相应的花丝上。 (8)后代处理:M0果穗成熟后收获,得到M1种子。M1种子全部按穗行单粒点播,苗期和成株期进行田间观察,并挂牌标记;将全部植株自交后得到M2代种子,并观察子粒突变。 M2代种子按穗行种植,每穗种3行,共60粒,每15行种植CK2行;抽雄时调查抽雄情况及株型和抗性等变异,并进行挂牌标记。将标有变异的植株自交得M3代种子; M3自交种子种成穗行,每5行加一个对照;此代中,观察、记录各穗行的抽雄期及其他性状,将不同穗行同对照比较,选择整齐一致并与CK有明显差异的穗行即为突变纯合体,将有利用价值的突变体自交留种。 (9)生育期突变选择标准:每穗行的抽雄高峰期与CK的抽雄高峰期相差6天以上。 诱变处理先将EMS配成1%母液,保存 备用。参照Neuffer的诱变方法进行诱变。上午9~10时,收集玉米新鲜花粉,去掉花药,加入处理液中,并用医用混匀器间断振荡45min后,再用毛笔把处理的花粉授在相应的花丝上;本试验采用0、0·50、0·67、1·00、1·50和2·00mL/L共6个处理浓度。0为CK,用纯液体石蜡油处理。 诱变后代的处理后代M1、M2采用系普法、单粒点播,各代标记并全部自交保种;将M3