TNHH对大鼠全脑缺血再灌注损伤的抗氧化性保护作用
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T NHH 对大鼠全脑缺血再灌注损伤的抗氧化性保护作用
于晓彦,魏欣冰,陈 琳,张岫美
(山东大学医学院药理学研究所,山东济南250012)
摘 要:目的观察T NHH 对大鼠全脑缺血再灌注损伤的抗氧化性保护作用。方法以改良的四血管阻塞法
(Pulsinelli four 2vessel occlusion m odel )建立大鼠全脑缺血模型,于缺血30min ,再灌注48h 后进行脑组织超氧化物歧化
酶(S OD )、丙二醛(M DA )、髓过氧化物酶(MPO )测定。结果T NHH 能显著降低大鼠缺血损伤脑组织中M DA 含量,降低MPO 活性,提高S OD 活性。结论T NHH 对大鼠全脑缺血再灌注损伤的具有明显的抗氧化作用。 关键词:脑缺血再灌注损伤;T NHH ;抗氧化
中图分类号:R965 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0120036203
Antioxidant effects of TNHH on whole brain ischemia/reperfusion injury in rats
Y U X iao 2yan ,WEI X in 2bing ,CHE N Lin ,ZH ANG X iu 2mei
(Department o f Pharmacology ,School o f Medicine ,Shandong Univer sity ,Jinan 250012,China )
Abstract :Purpose T o investigate the antioxidant effects of T NHH on global cerebral ischemia reperfusion injury in rats.Methods M odified Pulsinelli four 2vessel occlusion m odel in rat was prepared to produce the cerebral ischemia reperfusion injury.A fter ischemia for 30min and reperfusion for 48h ,superoxide dismutase
(S OD )activity ,malondialdehyde (M DA )level ,and myeloperoxidase (MPO )activity in brain tissue were mea 2sured.R esults T NHH produced significant reductions in M DA content ,MPO activity and elevation in S OD activity.Conclusion T NHH possesses the antioxidant effects in whole brain ischemia reperfusion injury in rats.
K ey w ords :brain ischemical reperfusion injury ;T NHH ;antioxidation
收稿日期:2008205205
作者简介:于晓彦(19832),女,山东菏泽人,硕士研究生,研究方向为脑血管药理学;张岫美,男,通信作者,教授,博士生导师,T el :
0531288383146,E 2mail :zhangxm @https://www.wendangku.net/doc/1313653706.html, 。
全脑缺血是由于多种原因所致脑动脉管腔狭窄,血流减少甚至完全阻塞,脑部血液循环障碍,脑组织受损而发生的一系列症状,其发病机制尚不完全清楚。现已知缺血后再灌注是脑卒中病理改变的重要环节,再灌注所引起的炎症反应及氧化应激在脑缺血再灌流损伤中起重要作用。T NHH 是白细胞抑制因子[neutrophil inhibitory factor ,NIF ,特征表述为NIF 2G ly (5～10)]与水蛭素(hirudin )经基因工程重组表达和纯化等技术形成的重组双功能嵌合蛋白(NIF 2hirudin hybrid ,NHH ),基础实验证明对局灶性脑缺血损伤均具有明显的治疗作用(待发表)。本实验采用改良的四血管阻塞法(Pulsinelli four 2vessel oc 2
clusion m odel )建立大鼠全脑缺血模型[1],观察T NHH
对全脑缺血再灌注脑组织丙二醛(M DA )含量与髓过氧化物酶(MPO )、超氧化物歧化酶(S OD )活性的影响,以探讨其抗脑缺血损伤的作用机制。1 材料与方法1.1 试剂与仪器
T NHH (批号:20070801),重庆富进生物医药有限公司提供;M DA 试剂盒(批号20071215)、S OD 试剂盒(批号20071217)、MPO 试剂盒(批号20071217),均为南京建成生物工程研究所生产。
多功能酶标仪(VARI OSK AN ),美国热电公司产品;尤尼柯UV21022PCS 紫外分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司生产;TG L 216G 型冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂生产。1.2 动物与实验分组
Wistar 大鼠80只,雌雄兼用,体重180～220g ,
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SPF级,合格证号:SCXK(鲁)2003004,山东大学实验动物中心提供。实验室适应性喂养1周,随机分为5组,即空白对照组、假手术组、脑缺血再灌注模型组、T NHH组和溶媒对照组。由于全脑缺血模型有一定的死亡率,故空白对照组和假手术组每组10只大鼠,模型组、T NHH组及溶媒对照组每组20只大鼠。
1.3 大鼠全脑缺血模型(Pulsinelli four2vessel occlu2 sion m odel)制备
大鼠以1.5%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,俯卧位固定,于颈后正中切一长约2cm的切口,显露第1颈椎侧的翼孔,于手术显微镜下使用微型磨钻,向头端及中线方向扩大翼孔,暴露其中的椎动脉切迹,插入微型双极电凝镊,直视下闭塞双侧椎动脉,缝合伤口,置笼喂养,自由饮食。24h后同法麻醉,仰卧位固定,颈前正中线切一长约2cm切口,暴露双侧颈总动脉,游离后用微型动脉夹夹闭,以大鼠出现意识障碍、翻正反射消失为脑缺血指标。30 min后放开动脉夹,恢复血液供应,缝合伤口。术中术后室温控制在(22±2)℃,相对湿度为(50±10)%。假手术组大鼠麻醉及手术相同,但只暴露而不电凝及夹闭血管。
1.4 给药方法
正常对照组、假手术组和模型组给予生理盐水(NS)0.5m L/只;T NHH组给予T NHH6.75mg/kg,T NHH冻干粉溶于4%甘露醇[含10mm ol/L磷酸盐缓冲液(P BS),pH7.0]溶液中;溶媒对照组给予4%甘露醇(含10mm ol/L P BS,pH7.0)0.5m L/只。模型制备成功再灌注1h后尾静脉注射给药,再灌注9h后同法再次给药;术后第2天尾静脉注射给药2次,每次给药间隔8h。
1.5 脑组织生化指标的测定
于再灌注48h后断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干,切取一侧大脑半球制成10%脑组织匀浆,3000r/min离心10min,取上清备用。
按照试剂盒说明书,以多功能酶标仪及紫外分光光度计测定脑组织中S OD、MPO活性和M DA含量。
1.6 数据的统计学处理
各组数据均用(x±s)表示,统计分析采用方差分析(ANOVA),多个实验组之间比较采用t检验,P <0.05为统计学差异有显著性。
2 结 果
由表1可以看出,与模型损伤组比较,T NHH可显著降低大鼠全脑缺血再灌注引起的脑组织M DA 含量升高(P<0.05),可显著抑制全脑缺血再灌注引起的MPO活性升高(P<0.05),并提高S OD的活性(P<0.05);溶媒对照组与模型组比较,无显著性差异(P>0.05);空白对照组与假手术组比较,也无显性差异(P>0.05)。
表1 T NHH对大鼠全脑缺血再灌注损伤脑组织中M DA含量、S OD及MPO活性的影响(x±s)
T ab.1 E ffects of T NHH on malondialdehyde(M DA)level,superoxide dismutase(S OD)activity and myeloperoxidase(MPO)activity in rats injured by whole brain ischemia reperfusion(x±s)
组别剂量n M DA/(nm ol/mg pr)S OD/(U/mg pr)MPO/(U/g)空白对照组NS0.5m L10 5.56±1.33103.84±26.110.157±0.026假手术组NS0.5m L10 5.40±1.44102.65±16.820.158±0.021模型损伤组NS0.5m L117.31±1.25172.63±27.5410.190±0.0341 T NHH组T NHH6.75mg/kg13 5.58±1.142102.09±13.4720.163±0.0192溶媒对照组溶媒试剂0.5m L11 6.18±1.3088.30±15.580.197±0.017
与假手术组比较:1P<0.05;与缺血损伤组比较:2P<0.05
1P<0.05vs sham group;2P<0.05vs whole brain ischemia2reperfusion group
3 讨 论
脑缺血再灌注时,重新供氧可引起氧自由基大量增加,同时自由基清除功能低下,脂质过氧化反应加剧,导致细胞抗氧化防御功能紊乱,细胞膜被加速破坏,细胞崩溃坏死,神经细胞尤为敏感[223]。S OD 是体内有效的自由基清除剂,其活性高低可间接反映机体清除自由基的能力,大量自由基的产生导致S OD活性下降。M DA是细胞膜脂质过氧化反应的代谢产物,其含量间接反映了细胞受自由基攻击的脂质过氧化程度。在本实验中,缺血再灌注模型的M DA含量显著升高,S OD活性显著降低。T NHH组给药后显著降低M DA值,增加S OD活性,表明T NHH对缺血再灌注脑组织的保护机制之一是通过提高抗氧化酶的活性,清除自由基,从而抑制脑组织的过氧化程度而起到保护作用。有研究表明,水蛭素可起到抑制脑缺血再灌注后自由基损伤的作用[425],故推测T NHH的抗氧化作用是通过其成分中的水蛭素发挥的。
炎症反应在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,中性粒细胞的浸润是反映再灌注后炎症反应的
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中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics2009年第30卷第1期
标志之一。MPO主要存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中,测定MPO活性可以评价中性粒细胞的浸润程度。研究表明,中性粒细胞的浸润是脑缺血继发损害的重要因素[627]。再灌注时中性粒细胞与血管内皮细胞黏附并聚集,阻塞微血管导致“无复流”现象,使缺血区不能得到充分灌注,同时大量浸润到脑组织的中性粒细胞释放溶酶体酶使组织蛋白水解破坏,产生大量自由基,加重缺血后的氧化应激反应,另外激活的中性粒细胞分泌多种炎性细胞因子形成再灌注后的炎症级联反应加重脑损伤[829]。实验中, T NHH可显著降低全脑缺血模型MPO的活性,说明T NHH可抑制缺血后中性粒细胞的浸润从而起到抗炎作用,这可能与其活性成分中白细胞抑制因子抑制白细胞黏附活化的作用有关。实验结果显示, T NHH的抗炎作用可能对急性脑缺血损伤的治疗具有重要价值。
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葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化
金慧英,唐治华
(南京军区军事医学研究所,江苏南京210002)
摘 要:目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA2ZZ的pET232a2ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET322ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(S DS2PAGE),并用Q2Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA2ZZ的pET322ZZ 表达载体,表达产物经S DS2PAGE检测相对分子质量为41000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA2ZZ的应用奠定了一定的基础。
关键词:葡萄球菌蛋白A;抗体结合区;克隆;表达
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0120038203
Cloning,expression and purification of Staphylococcal Protein A antibody2binding
fraction gene
J I N Hui2ying,T ANG Zhi2hua
(Institute o f Military Medicine o f Nanjing Command P LA,Nanjing210002,China)
收稿日期:2008206230
作者简介:金慧英(19662),女,江苏丹阳人,副研究员。
83中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics2009年第30卷第1期
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)制备方法.pdf
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备 前言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到 大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997 年 Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60] 也对该方法进行了研究。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元 对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
脑缺血再灌注
什么是脑缺血?脑的短暂性血液供应不足并出现症状就叫做短暂性脑缺血发作，是一种 常见的急性脑血管病。病人突然发病，类似脑出血或脑梗塞的表现，一般在24小时内完全 恢复正常，常使家人虚惊一场，但可以反复发作。短暂性脑缺血发作病人一般在1～5年内 可能发生脑梗塞。而脑梗塞的病人中的1/3～2/3曾经发生过短暂性脑缺血发作脑缺血 - 再 灌注也可造成脑功能严重受损。脑缺血时脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一 定时间后再灌注，慢波持续并加重。颞叶组织内神经递质性氨基酸代谢发生明显变化，即兴 奋性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)随缺血 - 再灌注时间延长而逐渐降低，抑制性氨基酸(丙 氨酸、γ- 氨基丁酸、牛黄酸和甘氨酸)在缺血 - 再灌注早期明显升高。缺血再灌注损伤 时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显：线粒体肿胀，有钙盐沉积， 并可见线粒体嵴断裂、核染色质凝集、内质网高度肿胀，结构明显破坏、星型细胞肿胀， Nissl 体完整性破坏、胶质细胞、血管内皮细胞肿胀，周围间隙增大并有淡红色水肿液、白质纤维 间隙疏松，血管内由微血栓、髓鞘分层变性，呈现不可逆损伤。 多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemi-a-reperfusion injury)。 缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注，确能收到良好的治疗效果。但在一定条件下（取决于缺血时间）再灌注反而引起更加严重的后果。这不仅见于临床，而且也为不同种属（兔、大鼠、豚鼠、狗、猪等）的大量动物实验所证明。这是一种反常（paradox）现象，称之为再灌注损伤（reperfusion injury）。
缺血性脑损伤的病理生理基础和脑梗塞的治疗原则
缺血性脑损伤的病理生理基础和脑梗塞的治疗原则 急性缺血性脑损伤、神经元坏死的发病机制和防治经历过长时间的研究过程，从选择性神经的细胞死亡至迟发性神经元坏死（DND）以及至近年缺血半暗带，缺血治疗时间窗研究和溶栓治疗进展，为急性脑硬塞的治疗提供光明前景。一、迟发性神经元坏死（DND）早在1925年Spielmeyer提出选择性神经细胞易伤性，表现在不同的脑区，如海马cal区，小脑蒲金野细胞和大脑皮层Ⅲ-Ⅳ层等神经细胞损伤，曾有多种理论解释，诸如血管理论，特异性易伤性、血管结构和神经元理化特性等学说，也曾进行多种动物模型研究，直至Pulsinelli（1979）[1]首先建立四血管阻断全脑缺血再灌注模型，促进了脑缺血的实验研究。迟发性神经元死亡，Kirino（1982）[2]应用沙土鼠两血管阻断再灌注全脑缺血模型，发现海马cal区2-7天后出现神经元坏死称为迟发性神经元死亡，同年Pul sinelli[3]用大鼠4VO再灌模型取得相同的结果，即海马ca4区为缺血性细胞改变，ca3菊反应性改变，而cal区则为DND改变。自此得到公认并进一步深入病理形态，超微结构，理化改变研究对DND 发生机制取得突破性进展： 1 自由基（FR）与DND 自由基FR广泛存在于生物体内，正常生理情况下FR处在生成和清除平衡状态不损害机体具有毒物降解作用，生物体内的FR 有：氧化自由基，过氧化氢和羟自由基等，实验研究证明FR 代谢失平衡是脑缺血再灌注DND过程中的一个最基本特征[4，
5]。脑缺血再灌注氧自由基过多，特别是超氧化阴离子过多造成组织损伤，有血管内皮细胞损伤血脑屏障遭破坏产生脑水肿；神经细胞、胶质细胞的膜磷脂损伤、C a2+、Na+、流入细胞内、Ca2+超载；兴奋性氨基酸NMDA受体神经毒作用，造成神经元损伤等[6]。临床上应用维生素C、E的抗氧化作用保护和治疗受损神经细胞。 2 细胞Ca2+超载与DND 细胞内Ca2+超载是缺血再灌注造成DND的主要原因[7]。正常生理状态下细胞内外Ca2+浓度相差近万倍，多种Ca2+通道维持这种正常递度包括NMDA受体通道。电压依赖Ca2+通道，内质网Ca2+通道、线粒体Na/Ca2+交换Ca2+-ATP酶和钙调蛋白等[8 ]。当脑缺血缺氧病理状态下，EAA受体过度兴奋，引起溶质重排Ca2+细胞内流增加；高能磷酸化合物耗尽，离子泵受损，胞内Ca2+不能泵出，线粒体和内质网对Ca2 +的摄取和钙结合蛋白调蛋白的结合能力下降，造成细胞内Ca2+超载发生DND。 3 兴奋性氨基酸与DND 兴奋性氨基酸有谷氨酸和天门冬氨酸，在脑内的Glu为最多是CNS中的兴奋性递质参与多种生理功能包括感光信息处理，协调运动，认知过程的学习和记忆等。正常Glu细胞内高于细胞间隙1000倍，实验证明缺血5min，细胞间隙Glu升高 1 5-20倍，再灌注5min可恢复正常，但缺血20minGlu升高达20-100倍，继续再灌注2 0min亦不能恢复到正常水平，激活AMPA受体通过开放使细胞内能量和ATP耗尽，细胞外K+浓度增加导致细胞膜去极化Na+在细胞内堆积Cl-和
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
大鼠灌注固定的方法
大、小鼠灌注固定的方法 准备物品： 1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺） 2、医用输液器 3、500ml输液用玻璃瓶 4、血管钳 5、剪刀 6、生理盐水 7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制 大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。如此灌注约需1小时时间。 充分暴露升主动脉
套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉 1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。 2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。相对来说，剪开右心耳更为方便。我们就是这样做的。 3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。 4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。有条件的话可加点肝素。 5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。小鼠灌注固定方法： 采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20 mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20 mL 生理盐水。推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。
中药对缺血性脑损伤保护作用的研究进展
?综述与编译? 087 中药对缺血性脑损伤保护作用的研究进展 吴正国 综述 吴以岭 审校 河北以岭研究院附属医院（石家庄 050091） 缺血性脑血管病约占脑血管疾病的67%～78%，目前针对脑血管病的研究也以缺血为主。近年来研究发现，在脑梗死时，缺血、缺氧造成的能量代谢障碍，兴奋性神经介质释放，钙过量内流，自由基损伤等一系列连锁反应，是导致缺血性脑损伤的中心环节。近年来中药对脑保护作用的研究发展迅速，就此综述如下。 1 清除自由基的作用 自由基损伤不仅可以促进动脉粥样硬化、脑梗塞的形成，且可加重脑梗塞后的神经细胞损伤［1］，中枢神经系统富含多价不饱和脂肪酸，易受自由基攻击。丙二醛（MDA）是脂质过氧化作用的终末产物，比较稳定，其含量可以反映脂质过氧化水平。而超氧化物歧化酶（SOD）则有清除自由基的作用，抑制脂质过氧化，检测其水平可反应清除自由基的程度。 采用半夏天麻汤治疗脑梗塞患者60例，与内科常规治疗对照，治疗后SOD明显升高，MDA含量明显降低［2］。研究发现，大鼠在缺血30min再灌注24h时，海马的MDA比假手术组及正常组明显升高，并持续到72h，脑梗通口服液可使再灌注72h时海马MDA明显降低［3］。通过观察姜黄素对脑缺血再灌注时脑组织中MDA、亚硝酸盐、SOD含量的影响，发现姜黄素对缺血－再灌注的保护作用与抑制自由基的生成和促进自由基的清除有关［4］。研究银杏叶（FGE）提取物对反复脑缺血－再灌注损伤的保护作用时发现，FGE可明显改善脑缺血－再灌注小鼠的学习、记忆功能，并可不同程度地减少脑组织中异常增加的MDA、NO、PGE2的含量，并可明显增强脑组织中降低的SOD和过氧化氢酶的活性［5］。 2 对钙离子通道及细胞内钙超载的影响 脑缺血时由于膜功能的紊乱，细胞外Ca2＋大量进入细胞内，同时细胞器中Ca2＋外漏到细胞浆中而造成细胞内Ca2＋浓度梯度的破坏，这是导致神经损伤引起细胞死亡的中心环节和最后共同途径。细胞内钙超载是神经元迟发性死亡的主要原因，利用钙拮抗及降低细胞内钙可以减轻或避免脑组织的缺血性损伤。 研究脑缺氧损伤机制时发现，缺血缺氧致大鼠大脑皮质L-型钙通道开放时间增加，开放概率增加，人参二醇皂苷能抑制正常和缺氧时钙通道的开放时间和开放概率［6］。脑缺血20min后，突触体内游离钙含量明显高于缺血前的水平，给予灯盏花注射液后，缺血及再灌注期突触体内游离钙含量均低于未给药组［7］。大鼠脑缺血－再灌注后，有明显脑水肿及海马神经元损伤，脑组织含水量、Ca2＋及兴奋性氨基酸含量明显升高，而中风脑得平冲剂对此有不同程度的抑制作用，从而保护神经元以减轻损伤［8］。胡国恒等观察中药康脑神颗粒对缺血大鼠脑组织内皮素－Ⅰ（ET-1）、Ca2＋、Na+及脑组织含水量的影响。结果发现，模型对照组较假手术组脑组织ET-1、Ca2＋、Na＋及脑组织含水量显著升高，而康脑神颗粒组缺血大鼠脑组织ET-1、Ca2＋、Na＋及脑组织含水量较模型对照组明显减少，提示康脑神颗粒可能通过抑制Ca2＋内流抑制ET的合成及释放，进而抑制脑水肿防治脑缺血性神经元损伤［9］。
缺血性脑损害的病理机制
血栓形成的发病机制 l急性脑缺血通常起因子脑血管被血栓形成或栓 塞所闭塞。近代血栓形成的发病机制最早由 Rudolph virchow(1845)提出，就是著名的血栓 形成三大因紊：血管壁、血流及血液构成的改 变。事实上，这一概念在上一世纪已经被 JohnHunter暗示过。 l(一)血管内皮损伤目前已公认血管内皮损伤 (如由动脉粥祥硬化斑块溃疡、破裂或出血引起 的)是诱发血栓形成主要导因。 二、脑血流障碍与脑梗塞灶形成的病理机制 (一)缺血时间窗无论由血栓或栓塞引起的脑血管闭塞，结果都是引起局部脑血流障碍，使脑缺血、缺氧。脑细胞是人体最娇贵的细胞，血流一旦完全阻断，6秒钟内神经元代谢即受影响；2分钟脑电活动停止；5分钟起能量代谢和离子平衡被破坏，ATP耗尽，膜离子泵功能障碍：K+流出，Na+Ca2+和水大量进入细胞内；持续5—10分钟神经元就发生不可逆损害。可见，要挽救脑组织就必须在不可逆损害发生前的短短时间内恢复血流供应。 近来的研究认为功能和代谢紊乱有更复杂的血流阈值模式：随着血流下降，蛋白合成首先受抑制(大约血流阈值为45ml(100g·min))，刺激无氧代谢(约35ml(100g/min)，神经介质释放、能量代谢紊乱[约20ml(100g/min)]，最后缺氧性去极化[＜15ml(100g·min)。除缺血程度外，缺血时间也起决定作用(缺血阈值与其交叉)。当脑血流长期减至10ml/100g／min，细胞传导机制和神经介质系统衰竭，神经毒性介质释放(如L-谷氨酸)，氧自由基和过氧脂质形成，神经元释放有神经毒性的血小板活化因子，这些均可损害细胞功能。 三、缺血半影带概念电机能衰竭与膜机能衰竭两个阈值的发现，导致半暗带概念的产生，即在严重缺血脑组织中心周围还存在无电兴奋性但仍存活的脑细胞。在这区域脑灌流处于“临界”水平，神经元功能由于组织代谢需要不能满足而降低，但细胞仍能维持离子平衡而存活。由于局部灌流储备利用达到最大程度，灌流压任何进一步下降，都可使仍存活的缺血半暗带神经元死亡．但也可因再灌流或放保护治疗而免于死亡。因此半暗带可定义为：有潜在可救活脑细胞的缺血边缘区。但半暗带并不完全是一个解剖学区域，更主要是一个血流动力学过程。在任何一个急性脑梗塞病人，无法知道。其缺血半暗带可能有多宽?会维持多久?以及在血流恢复后有多大程度的复原?但从近来PD的研究证明，在缺血脑卒中后有相当容积的、潜在存活的团组织，相对持久地存在。目前还不清楚多长的缺血时间重灌溉可以救活脑细胞或者可以从梗塞区中挽救神经元。换言之，有效治疗时间窗多长，仍不清楚
脑缺血再灌注损伤治疗的研究进展
脑缺血再灌注损伤治疗的研究进展 向军 同济大学医学院，上海（200433） E-mail: Chelsea_JX@https://www.wendangku.net/doc/1313653706.html, 摘要：缺血性脑血管是现代社会致死致残的最主要疾病之一，其治疗原则及时恢复缺血区的血液再灌注，而随之而来的再灌注损伤又成为一大难题。笔者对近年来脑缺血再灌注损伤的治疗研究综述如下。 关键词：脑缺血再灌注损伤；治疗；进展 缺血性脑血管病是现代社会致死、致残的最主要疾病之一，其治疗原则是及时的恢复缺血区的血液灌注。然而在某些情况下缺血后再灌注不仅没有使组织功能恢复，反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，这种现象即缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury），抑制再灌注损伤已成为缺血性中风治疗的重要环节。近年来针对脑缺血再灌注损伤的治疗研究取得一定成果，现将其综述如下。 1．自由基研究 自由基（free radical）是外层轨道上有单个不配对价电子的原子、原子团和分子的总称，其化学性质极为活波，可与各种细胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）发生反应，导致细胞功能障碍和结构破坏。在脑缺血再灌注时，机体的自由基产生和清除系统遭到破坏，导致大量自由基的存在，造成脑组织损伤和功能障碍。由于再灌注治疗窗十分短暂(仅1-3小时)，因此清除自由基应在再灌注前或者再灌注早期即开始。 自由基的清除主要靠自由基清除剂，包括酶性自由基清除剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、Prion蛋白（PrPc）等;低分子自由基清除剂，如维生素C、维生素E、谷胱甘肽等；其他如甘露醇、糖皮质激素等。 有研究表明，褪黑素（Melatonin MT）能够清除羟自由基、过氧亚氮阴离子、降低单线态氧毒性和自由基引起的脂质过氧化反应，是有效的自由基清除剂和间接抗氧化剂，具有较好的神经元保护作用[1-2]。Cesario等[3]通过体内外实验观察发现，褪黑素的减轻脑缺血再灌注损伤作用，还与其对胶质细胞的保护作用有关，且胶质细胞对治疗比神经元更敏感。别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过阻止次黄嘌领转化为黄嘌呤，进而阻断自由基的产生。Allport等[4]的实验证明别嘌呤醇能够减少大鼠脑缺血再灌注模型的梗死面积和比率，对脑缺血和再灌注引起的脑损伤都具有保护作用。EGB761是银杏叶提取物的标准制剂，其主要活性物质是24%黄酮苷和6%萜烯内酯，具有较好的抗氧化作用。A. Ur′?kov等[5]的实验证明EGB761能够抑制脑缺血再灌注时的脂质过氧化反应，减轻自由基氧化作用对大鼠前脑的损害。 2．钙超载研究 脑缺血再灌注时，ATP供应不足、N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体过渡兴奋介导与其偶联的钙通道开放、细胞膜通透性增大以及Na- Ca2＋交换异常等因素导致细胞内游离钙（[Ca2＋]i）浓度升高。细胞内钙超载一方面使血管收缩，进一步加重脑缺血缺氧；另一方面引起细胞结构和功能的破坏，导致细胞死亡。[Ca2＋]i浓度升高既是脑损伤的后果，同时又是
中医药对心肌细胞损伤保护作用的研究(一)
中医药对心肌细胞损伤保护作用的研究(一) 对缺糖缺氧损伤的保护作用大量实验研究表明，培养的心肌细胞如缺糖缺氧6小时，则迅速引起细胞内能量耗竭，导致细胞功能受损，LDH 等酶溢出，并伴有细胞超微结构损害。研究发现，中药能有效地对上述损害起保护作用。张家新〔1〕研究发现：在LDH酶水平显著高于正常对照组(P＜0.01)的缺糖缺氧心肌细胞培养液中，加入玫瑰茄提取液后，培养液中的LDH显著低于未加药物的缺糖缺氧组(P＜0.05)，提示该药物能较好的对缺糖缺氧损伤起保护作用。陈兴坚〔2〕等将中药提取物酸枣仁总皂甙分别用两种浓度(33μg/ml和11μg/ml)加入模型组中，结果发现高浓度组可减轻缺糖缺氧心肌细胞LDH的释放，低浓度组则没有这样的作用，说明该药对心肌细胞的保护作用存有量效关系。值得一提的是：培养的心肌细胞对不同中药的浓度反应也有较大差异，杜锐生〔3〕研究发现，100μg/ml与250μg/ml的三七总皂甙均能减少缺糖缺氧组心肌细胞的LDH与α-羟丁酸脱氢酶(α-HBD)的释放，但作用以100μg/ml浓度为明显，250μg/ml的浓度反有减弱的趋势，提示中药保护心肌细胞与适宜的浓度相关，过大过小均不能达到最大效应。有关中药保护心肌细胞缺糖缺氧损伤机理的研究，近年来也取得了长足的进展。洪行球〔4〕采用中药复方何氏心悸方(党参、五味子、麦冬等)观察其对细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响，该酶是三羧酸循环及线粒体氧化磷酸化有关的主要酶。实验发现，缺糖缺氧组细胞内SDH 染色示活性明显降低，加入该药抽滤液后可明显提高SDH的活性，且
使细胞搏动恢复，说明何氏心悸方是通过改善心肌细胞内代谢起到保护心肌细胞作用。汪长华〔5〕等采用计算机技术和SDH染色相结合的方法。将该酶活性量化，并检测LDH.心肌细胞内总磷酯和总胆固醇含量以及Ca2+—Mg2+ATP酶活性进行综合分析发现，大豆磷脂脂质体可抑制心肌细胞培养液中LDH的活性和心肌细胞内SDH的反应性增加，减轻心肌细胞Ca2+—Mg2+ATP酶活性的降低，提高心肌细胞总磷脂和总胆固醇的含量，说明大豆磷脂脂质体减轻培养心肌细胞缺糖缺氧性损伤，可能与其作用于细胞膜脂质有关。近年来，有关中心肌细胞保护作用机理研究已达到分子水平。杜锐生〔3〕用同位素标记法研究发现，三七总皂甙可以减少缺糖缺氧心肌细胞DNA合成的降低。王玮〔6～7〕用精制血府胶囊(柴胡、赤芍、红花、桃仁等)取药给兔灌胃后，心脏采血，分离含药血清，研究其对缺糖缺氧心肌细胞的保护作用，发现该药可以提高缺糖缺氧心肌细胞的3H—urid(尿嘧啶核苷)及3H—Leu(亮氦酸)的掺入率，提示中药能够减轻缺糖缺氧心肌细胞的DNA、RNA、蛋白质等大分子物质的合成，起到保护心肌细胞的作用。王玮进一步研究显示，该药能够改善心肌细胞-氧化氦合成酶(NOS)基因的表达，可能亦是精制血府胶囊保护心肌细胞的重要机理之一。心肌细胞超微结构的研究，进一步对中药保护心肌细胞提供形态学依据。陈家畅〔8—10〕发现缺糖缺氧6小时的心肌细胞核畸形，染色体边缘浓缩，线粒体肿胀，嵴消失，甚至出现空泡变性，此外，肌原结构破坏，有些区域偶见Z膜和A带，I带模糊不清或消失。有些肌原纤维有
1 细胞凋亡与缺血性脑损伤
1 细胞凋亡与缺血性脑损伤 内质网（endoplasmic reticulum，ER）在细胞内分布广泛，是真核细胞中重要的细胞器，其内膜表面积占细胞所有膜结构的50 %，体积占细胞总体积的10 %，参与重要的生理功能的维持，其基本生理功能包括负责蛋白质的合成转运、信号肽识别、糖基化修饰等过程以及钙离子的贮存和调节，信号转导及细胞内钙的再分布。内质网巨大的膜结构为细胞内活性物质的反应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控中起到关键作用。最近的研究表明，内质网是细胞凋亡调节中的重要环节［1］。 细胞应激涉及线粒体、内质网、细胞核等细胞器的应激，他们既相对独立，又相互作用［2］。内质网是细胞加工蛋白质和贮存Ca2+的主要场所，对应激极为敏感，其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态，称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［3］。ER非常敏感，葡萄糖/营养素缺乏、蛋白质糖基化抑制、二硫键形成障碍、蛋白质转运异常、Ca2+耗竭等刺激都可导致ER功能失调，发生内质网应激。内质网应激主要激活三条信号通路：未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR）、内质网超负荷反应（endoplasmic reticulum overload response，EOR）和固醇调节级联反应。前两者是由于蛋白质加工紊乱所致，后者则是在ER表面合成的胆固醇损耗所致。 凋亡(apoptosis)又叫程序性细胞死亡，是指机体在生理条件下受到刺激后，经过多种信号传递导致细胞产生一系列生态和生化方面的改变而引起细胞程序性死亡的过程。自1972年John Korr第一次提出凋亡概念后，经三十多年的研究，目前已知有三条主要的细胞内信号转导通路来调控细胞凋亡:(1)线粒体通路;(2)死亡受体通路;(3)内质网通路。传统的观点认为，线粒体受损后能释放多种促凋亡物质，从而导致细胞凋亡。最近的研究表明，脑缺血后损伤内质网，导致内质网应激，最终通过多种途径致使神经元凋亡［4］。 脑血管病是危害人类生命和健康的常见病和多发病，其中缺血性脑中风占75 %—85 %。有关缺血性脑损伤的基础研究和临床治疗方面均取得很大进展。新近研究证实，在缺血半暗区确实发现有凋亡细胞和神经细胞再生。与急性缺血性神经元坏死相比，半暗区的侧枝循环尚未完全中断，因此，缺血性中风的治疗关键在于延长治疗时间窗和及时挽救缺血半暗带尚未死亡的神经元［5］。缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）时，缺氧、酸中毒、ATP 耗竭、钙超载及大量自由基生成等均可作为诱导ERS的刺激因素，ERS在I/R损伤的发生发展中具有重要意义［6］。 2 脑缺血诱导的内质网应激及其引发的细胞凋亡 2.1 脑缺血后Ca2+浓度变化对内质网的影响及其引起的细胞凋亡 Paschen等发现，细胞在短暂性脑缺血时的变化与神经元内质网Ca2+稳态受到破坏后，都出现了内质网应激，显示内质网Ca2+稳态紊乱参与了缺血性脑损伤的病理生理学过程，内质网应激可能是脑缺血细胞损伤的关键环节［8］。
灌流取脑
大鼠灌注固定取脑 准备物品： 37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤 1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。 2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。 3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。 4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。 5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。时,剪开右心耳,使血液排出。观察肝脏逐渐变为白色为止 6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。 7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。 8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。插入时动作要慢,针尖方向不要偏向右侧,以免刺入右心房,如果感到有阻力,则将针退后、调整方向重新进针,直到进入主动脉,灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置,灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米,然后用丝线扎紧。切勿将灌注针放在左心室内,这样由于主动脉瓣的关闭,灌注液很难进入主动脉,而是沿着心室的切口流出,致使灌注失败。另外,灌注针插入成功后,一定要用剪刀剪开右心耳而不是右心室,这是灌流液的出口。剪开心尖的位置一定要掌握好,不能偏右使灌注针插入右心室。 2、配4％多聚甲醛PBS缓冲液：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 加热至60～65℃固然融解的快，只需要15分钟左右，不过容易挥发，气味难闻，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置，就基本没有气味散发的问题。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！。如果不着急，可先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密
大鼠线栓(MCAO)模型+灌注取脑+TTC染色
第一部分 线栓模型制作 1、实验器材（从左到右）： 第一行：干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛＋注射器、碘伏＋棉签 第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材 第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针＋大头针） 2、麻醉： 可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回头）。 效果图
3、麻倒后绑在手术台上。 4、剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒。 5、沿经部正中切开皮肤。 说明：切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好（后面会用到）。
6、钝性分离皮下组织。 如图：大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线。 7、分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。
8、分离动脉鞘。 如图：分离好后见光滑的颈总动脉。 9、分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的。
10、夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口。 11、插入鱼线，鱼线进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90%以上）。 说明： （1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。我们的经验是：250g以
下的选0.26mm的线，250-300g的选0.26mm蘸腊的或0.28的都可以。 （2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过4例这种情况的大鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm的鱼线。 （3）通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，熟练的话，从切开到缝合完毕也就是15分钟，算上准备工作（如麻醉、消毒等）半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10只大鼠不成问题。 （4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容易出现蛛网膜下腔出血。我们曾试过0.26mm 的鱼线（不带腊）在250g以下的大鼠进入深度足有2.5cm 12、成功后结扎中间那根线，可见第一个标记距动脉分叉约2mm。 13、缝合。
全脑缺血再灌注模型探讨
大鼠四血管阻断全脑缺血模型探讨 作者：blue_snowlotus 近年来，利用啮齿类动物复制全脑缺血模型，在缺血性脑损伤的研究中，特别是在海马缺血选择性易损性的研究等方面应用较为广泛。该模型的共同特点是缺血能暂时广泛的影响各个脑区，但病理改变多发生在选择性易损区域，这在治疗药物的开发研究上应用较多。我做的是大鼠四血管阻断法全脑缺血模型，因此在此主要探讨大鼠四血管阻断全脑缺血模型。 大鼠四血管阻断全脑缺血模型：即双侧椎动脉和双侧颈总动脉阻断，方法有很多，比较公认的是Pulsinelli法，适用于脑缺血的急性和慢性实验研究。该方法需要做两步手术，具体方法是：大鼠10%水合氯醛（300mg/kg,ip）麻醉后，俯卧位固定，在枕骨后切开皮肤，暴露第一颈椎两侧的翼小孔，用尖端直径为0.5mm的电凝器插入翼孔，烧灼双侧的椎动脉，造成永久性闭塞。待动物适应24h 后，在颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，用动脉夹夹闭阻断，10-15min后松开动脉夹可恢复血流，进行再灌注实验，以大脑皮层、纹状体和海马缺血最为明显。 模型制作的关键步骤是凝断双侧椎动脉，有些大鼠翼孔很小，电凝器根本插不进去，可以用牙科微型小磨钻，将翼孔扩大，直视下用电凝器凝断双侧椎动脉，用磨钻扩大翼孔也要注意，容易损伤椎动脉造成出血。另外，电凝针插入翼孔的角度也要掌握好，向外下（约于大鼠脊柱正中线呈50度角）插入翼孔，不然容易损伤脊髓。 高血糖可加重脑损伤，增加梗塞面积1.4倍，所以做手术前大鼠禁食12h.还可以防止麻醉过程中呕吐物窒息呼吸道。另外在实验过程中需注意控制脑温，因为脑温每降低10℃，大脑代谢率可降低50％。一般控制在37℃±0.3℃。 判断模型成功的标准很多，最客观的指标应该是多普勒血流检测仪，探头安置于右侧顶叶皮质，深度l mm，监测局部脑血流，一般夹闭颈总动脉后脑血流降低大于5O为模型成功。国内多用的指标是脑电图的检测，银制电极固定于前囟后，中线旁2mm，参考电极可置于对侧对称部位，夹闭颈总动脉30s后脑电图即有变化，逐渐变为等电位线，以脑电图变为等电位线为模型成功标准。另外还有行为学上的成功标准：1min后呼吸加快，动物无反应，意识丧失；翻正反射
细胞的保护机制
细胞的保护机制 林诗俊 （新疆乌鲁木齐建设路26号设计院，830002） 林瑞峰 （湖北黄岗职业技术学院，生物工程系03级2班） 摘要：本文通过对细胞的结构对水分子的速度与随机脉冲涨落的抑制作用的分析讨论了细胞的保护机制。同时提出了细胞内水分子的速率趋同效应的概念。 关键词：细胞，生物膜系统，碰撞加速，分子，随机脉冲涨落。 在《碰撞加速原理》[] 一文中对分子之间如何通过碰撞使某些分子获得较大的速度的机理进行了较为详细的分析，现简述如下：设分子A ，B 的质量分别为速度分别且碰撞是垂直碰撞的情形时，不论A ，B 的速度如何只要相遇，碰撞总会发生，为方便计，假设是B 碰A ，由动量守恒和矢量的平行四边形法则知，A 被碰后的速度为： 121,m m 21,u u 2 2212212??? ?????++=u m m m u u （1） 这就是说不管B 的速度如何，只要B 碰到A ，A 就会在垂直方向上得到一个分速度，这个分速度与原速度的矢量和按矢量的平行四边形法则，其大小一定大于被碰前的大小。即A 的速度被垂直碰撞后一定增大。 当A ，B 为同种分子时（1）式为： 2221u u u += （2） 在这种情况下，分子B 碰撞分子A 后静止，动量和能量全部传递到分子A 上。若分子A 依次被n 个同种分子垂直碰撞，则分子A 最终速度为： ∑+=+=++++=1122123222 1n i i n u u u u u u L （3） 在这种情况下，所有参与碰撞的分子的动量和能量全部传递到分子A 上。若01321u u u u u n =====+L 则由（11）式得： 01u n u += （4） 从（3），（4）式可知，即使是垂直碰撞A 的所有分子的速度都很小，当参与的分子很多时，分子A 的速度仍然可以被加速到很高的速度，理论上可以无限大。当然，分子A 的速度不仅受到整个系统的总能量的限制，而且应该以光速为上限，考虑到分子有一定形状，不为刚https://www.wendangku.net/doc/1313653706.html,
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型改良与评价
万方数据
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线栓法大鼠脑缺血再灌注模型改良与评价 作者：吴远华， 朱广旗， 胡蓉， 仲秀艳， 苏红梅， 欧阳泠星， 吴帮启， 舒遵华， 王强 作者单位：吴远华,朱广旗,胡蓉,仲秀艳(贵阳中医学院第一附属医院神经内科,贵阳,550002)， 苏红梅(山东临沂市人民医院中医科,临沂,276000)， 欧阳泠星(广东清远市人民医院中医科,清远 ,511500)， 吴帮启(天津中医药大学第一附属医院针灸科,天津,300193)， 舒遵华(长春中 医药大学附属医院,长春,130021)， 王强(湖北襄樊市中医院,襄樊,441000) 刊名： 中国实用神经疾病杂志 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF PRACTICAL NERVOUS DISEASES 年，卷(期)：2010,13(18) 参考文献(11条) 1.Garcia JH A reliable method to occlusion a middle cerebral artery in wistar rats 1993(09) 2.Zea Longa E;Weinsten PR;Carlson S Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 1989 3.Koizu mi J;Yoshida Y;Nakazawa T Experimental studies of ischemic brain edema:A new experimental model of cerebral embolis m in rats in which recirculation can be induced in the ische mic area[外文期刊] 1986 4.刘亢丁实验性局灶性脑缺皿再灌注动物模型的改进及评价 1997(02) 5.关云谦;孙明;徐超大鼠颈内动脉线栓法制备局灶性脑缺血模型及影响因素[期刊论文]-国外医学(脑血管疾病分册) 2001(03) 6.Belayev L;Alonso OF;Busto R Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture.Neurological and pathological evaluation of an improved model 1996(09) 7.Memezawa H;Minamisawa H;Smith ML Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the rat 1992(01) 8.李小凤;孙圣刚;童萼塘大鼠可逆性局灶性脑缺血模型复制方法的改进[期刊论文]-华中医学杂志 2000(04) 9.何学令插线法制作大鼠局灶性脑缺血再灌流模型方法的改进[期刊论文]-四川动物 2003(03) 10.王春霞;刘春风;包仕尧大鼠局灶脑缺血再灌注模型改良后的实验研究[期刊论文]-苏州医学院学报 1999(02) 11.Holland JP;Sydserff SGC;Taylor WAS Rat models of middle cerebral artery ischemia 1993(09) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/1313653706.html,/Periodical_hnsysjjbzz201018002.aspx