流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群

流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群

早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明

Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。

由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T 淋巴细胞。因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。

材料与方法

试剂

PMA（Sigma）

贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。

工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1μg/ml。

Ionomycin（Sigma）

贮存液：Ionomycin 溶于DMSO 浓度为1mg/ml -20℃保存。

工作液：贮存液1:20 稀释于RPMI 1640 培养基中，此时为50μg/ml。

GolgiStop（内含Monensin ，BD Pharmingen）

Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均购自BD Pharmingen。

抗体

细胞表面标记抗体：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC。抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。

细胞内因子抗体：抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC。抗鼠IL-4-PE, IFN-γ-FITC。以上抗体均购自BD Pharmingen。

实验方法

1 外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。弃去上清，细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细

胞浓度。

2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA （10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7μl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。

3 不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin 使终浓度分别为100ng/ml和1μg/ml，同时加入0.7μl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h 分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。

4 流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA 和500ng/ml 离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10μl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200μl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500μl洗涤两次。最后以300μl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及

CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。

5 流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1μg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10μl，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。

结果

1 不同浓度的PMA对人外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表达明显下降，已经不能区分出CD4阳性T淋巴细胞，而CD8和CD3的表达未受明显影响。重复5次检测，典型的检测结果见图1。

2 不同时间的PMA刺激对小鼠外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。PMA刺激8h后CD4阳性T淋巴细胞的表达没有明显下降。PMA刺激12h后，CD4阳性T淋巴细胞的表达明显下降。而CD8表达在8h和12h均没有明显下降。典型的检测结果见图2。

3 正常人外周血Th1细胞和Th2细胞。采用CD3+CD8-的T淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞（IL-4+）的百分比。典型检测结果见图3。

4 正常Balb/c小鼠外周血Th1细胞和Th2细胞。采用CD4＋淋巴细胞为Th细胞，设门分析

Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞的百分比（IL-4+）。典型检测结果见图4。

讨论

从Rostaing等[2]发表流式细胞术检细胞内细胞因子的方法后，陆续有人研究了流式细胞术检测细胞内因子方法的可行性及重复性等问题。虽然活化T淋巴细胞有各种各样的方法，如：PMA、PHA、Con A、CD3、CD2和CD28等。但是目前公认的较好的方法仍然是PMA和钙离子载体的联合刺激。研究发现在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表达就达到一个较高的水平，因而适合进行流式检测。我们的研究结果发现，人的外周血T淋巴细胞表面的CD4表达受PMA的影响非常大，在刺激后2h即明显下降，4h已经难于区分CD4阳性T淋巴细胞，因此这就难于确定Th细胞。虽然国内部分学者认为在PMA的刺激下，CD4仍可以维持一定的表达[3,4]，但是我们的结果和国内部分[5]及国外的大多数[2,6]研究结果表明，在PMA的刺激下，CD4表达迅速下调，此时采用CD4来标记Th细胞已经不能准确的检测Th细胞，因而不能准确的反应Th1和Th2细胞的比率。而CD3和CD8的表达受PMA等刺激因子的影响很小，因此，目前，国外推荐的方法是采用CD3和CD8设门，区分CD4阳性T淋巴细胞。由于多色荧光标记流式检测技术的发展，笔者认为采用4色标记技术检测人Th细胞是目前最好的方法。这种方法可以实现一个检测管，同时观察Th1细胞和Th2细胞；可以检测CD8＋细胞的细胞内因子的表达；还可以观察IL-4和IFN-γ双阳性细胞。一个检测管同时染色，节约了抗体和劳动量等检测成本。但是由于多色染色技术对流式的操作者有较高的要求，实施过程要注意补偿调节等具体问题，我们曾经采用CYC标记的CD8和APC标记的CD3联合设门区分Th细胞，由于CYC和APC在BD公司的流式细胞仪上，仪器的补偿调节非常困难，最终放弃该方法，改用PerCP标记的CD8才解决这一问题。目前，国内一些流式细胞仪型号相对落后，不能进行4色染色标记技术，笔者认为可以采用双管标记检测法，即采用CD3、CD8和IFN-γ3色标记一管用于检测Th1细胞；采用CD3、CD8和IL-4 3色标记一管用于检测Th2细胞。采用这种方法的缺陷是每个样品检测管数增加，造成检测成本增高，而且不能同时观察IL－4和IFN-γ双阳性细胞。国外有报道采用IFN-γ、IL-4和CD3进行3色标记[7]，这种方法只能观察T淋巴细胞表达的细胞因子的变化，不能区分CD4＋和CD8＋细胞，笔者认为是一种不可取的方法。

我们在Balb/c小鼠实验发现在PMA的刺激下，CD4表达虽然下调，但是其表达持续时间比人的持续时间明显增长，在刺激8h后，仍然能维持一个较高的水平，因而能够有效的区分Th细胞。因此，在Balb/c小鼠采用CD4和IFN-γ、IL-4进行3色标记技术就能有效的检测Th细胞亚群。当然由于CD3和CD8的表达受PMA的影响很小，采用CD3、CD8和IFN-γ、IL-4进行4色标记技术也非常有效。另外，由于CD4不仅在T细胞上表达，还在单核细胞上表达，单独用CD4设门容易受单核细胞的干扰，解决这个问题的一个办法就是采用FSC和SSC散点图来设门区分单核细胞和淋巴细胞，采用CD4直方图区分CD4阴性和阳性细胞，最后采用既位于淋巴细胞区，有位于CD4＋区的细胞来定义为Th细胞，这样可以有效的避免单核细胞的干扰。当然采用4色标记也是一种非常有效的避免单核细胞干扰的方法。

由于T淋巴细胞表达的因子非常多，检测其它细胞因子可以参照检测IL-4和IFN-γ的方法进行。凡是采用PMA等作为刺激剂的检测方法均应考虑到PMA等刺激剂对于细胞表面抗原表达的影响，从而选择最佳的荧光抗体标记，这是进行准确的检测的基础。

参考文献

1.Mosmann TR, Cherwinski H, Bond BW, Gieldlin MA, Coffman RL. Twotypes of murine

helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokines activities and

secreted proteins. J Immunol 1986;136: 2348–57.

2.Rostaing L, Tkaczuk J, Durand M, Peres C, Durand D, de Preval C, Ohayon E,Abbal M.

Kinetics of intracytoplasmic Th1 and Th2 cytokine production assessed by flow

cytometry following in vitro activation of peripheral blood mononuclear cells. Cytometry.

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＋细胞的变化。上海医学检验杂志，2003，18（1）：24-25

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细胞类型与疾病活动指数的相关性，中华风湿病学杂志2001,8月5(4)216-219

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Measurement of intracellular interferon-gamma and interleukin-4 in whole blood T lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Immunol Lett , 2000 Nov 1;74(3):207-10

图1 10ng 、20ng 、50ng PMA 和500ng/ml Ionomycin 共同刺激4h 后人外周血T 淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。

图中A 、B 、C 系列分别是10ng 、20ng 、50ng PMA 刺激后CD4、CD8和CD3的表达。各种浓度的PMA 刺激后均不能有效的区分CD4阴性和CD4阳性细胞，而CD3和CD8的表达受影响很小，可以有效的区分阴性和阳性细胞。

图2 不同时间的PMA 刺激对小鼠外周血T 淋巴细胞抗原表达的影响。PMA 刺激8h 后T 淋巴细胞CD4的表达有轻度下降，但是仍能有效的区分CD4阴性和CD4阳性细胞。PMA 刺激12h 后，CD4阳性的表达明显下降。而CD8表达在8h 和12h 均没有明显下降。

A B C

8h 12h

图3 流式细胞仪检测人外周血Th1和Th2细胞。A 为FSC 和SSC 的散点图，R1区为淋巴细胞区；B 为CD3和CD8的散点图，R2区为Th 细胞（CD3＋CD8－），R3区为Tc 细胞（CD3＋CD8＋）。C 为以“R1 and R2”设门，IL-4和IFN-γ的散点图， IFN-γ＋和IL-4＋细胞分别为Th1和Th2细胞。D 为以“R1 and R3”设门，IL-4和IFN-γ的散点图。

图4 小鼠外周血Th1、Th2细胞。A 为CD4直方图，R2为CD4＋细胞，B 为IL-4和IFN-γ的散点图。 A B A B C D

淋巴细胞亚群(详细资料)

机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T、B和NK淋巴细胞的水平。 T细胞主要包括T辅助细胞（Th）和T抑制细胞（Ts）细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和，但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+，这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞（真正Th细胞）和CD3-CD4+细胞（非Ts细胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+56+细胞（一部分NK细胞）和CD3-CD8+CD16+56-（未知细胞）。由此可见，真正的TH细胞是CD3+CD4+细胞，真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞，因此，用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。 首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。NK细胞的表面无T细胞和B细胞表面标志，但有CD16和CD56等标志，用CD16+56抗体能鉴定出NK细胞（一定是CD3阴性），CD3-CD16+56+细胞才是真正的NK细胞。根据是否表达CD8，又可将NK细胞分为CD3-CD8+CD16+56+细胞（所占比例小，不影响CD8比例）和CD3-CD8-CD16+56+细胞（主要成分）。 B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但 CD3+CD19+细胞很少，可忽略不计，所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。 在抗肿瘤效应中，CD4和CD8分别是T淋巴细胞的辅助／诱导细胞亚群与抑制/细胞毒细胞亚群，CD4细胞的主要功能是通过其分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答过程，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞，B细胞等共同发挥抗肿瘤作用，CD4细胞的减少，导致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标，其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。 CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者；CD8降低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病；CD4/CD8比值升高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应、病毒感染等；CD4/CD8比值降低见于艾滋病(常小于0.5)。监测器官移植排斥反应时，CD4/CD8比值升高预示可能发生排斥反应。

淋巴细胞亚群分析与临床---陈建林

一、流式淋巴细胞亚群检测的临床意义 1.了解不同情况下机体免疫功能状态 肿瘤（手术、放化疗患者的免疫功能检测） 感染（脓毒血症、重症监护患者等） 自身免疫病、免疫缺陷病等 不孕不育 某些血液系统疾病 其他：慢性肾病、骨髓移植恢复期等 2.辅助临床疾病的诊断 3.探索疾病的发病机理、病程及预后 4.观察监测疗效，指导临床建立治疗方案 二、淋巴细胞的分类及功能 B细胞(CD19+)：体液免疫 辅助/诱导T细胞(Th):介导和增强免疫应答 (CD4+) 淋巴细胞T细胞(CD3+）细胞毒性(Tc) /抑制性T细胞(Ts): 抗病毒、抗肿瘤 (CD8+) 调节性T 细胞(Treg):抑制免疫应答、维持免疫耐受 (CD4+CD25+) NK细胞：抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 (CD16+/CD56+) 三、流式淋巴细胞亚群检测的临床应用 淋巴细胞亚群检测与儿科疾病 （一）评估机体免疫功能状态 多种小儿疾病原发或继发疾病均存在T细胞异常，观察T细胞变化，对小儿疾病病因、发病机制以及协助临床诊断与治疗等具有重要价值。 类型指标CD3+ CD4+CD8+CD4+/CD8+细菌性肺炎↓↓↓↓↑↓↓ 支原体肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 病毒性肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 传单增多症↑↑↓↓↑↑↓↓ 支气管哮喘↑↓↑

T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合退热、消咳、肺罗音消失时间观察T 细胞变化，特别针对儿科患者可合理调节抗生素使用，改善预后，避免药物损伤. （二）原发性免疫缺陷病的早期识别和干预 1.流式细胞仪分析T细胞亚群(包括CD3+、CD4+和CD8+)、B细胞(CD19+) 和NK细 胞(CD16+/CD56+)比例等主要检查项目,可对大多数原发性免疫缺陷病患儿作出诊断。 2.评估免疫接种前机体免疫状态 案例：T/B细胞联合免疫缺陷患 儿，未评价免疫系统功能，直接 接种灭活疫苗，造成严重感染T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合患儿科反复感染的临床症状及时检测； 在疫苗接种前2-3天作出评估。 淋巴细胞亚群检测在肿瘤临床的应用 恶性肿瘤的发生、发展、转移与人体免疫功能下降密切相关。人体的抗肿瘤免疫以细胞 免疫为主，体内发挥抗肿瘤免疫作用主要由CD4和CD8细胞完成。 （一）评价肿瘤患者的整体免疫功能 1．肿瘤患者处免疫抑制状态，T淋巴细胞降低。 2．肿瘤患者T淋巴细胞与病程相关，随病程逐渐降低。 CD3、CD4、CD4/CD8细胞数下降程度：Ⅳ期> Ⅲ期> Ⅱ期>Ⅰ期3．肿瘤患者T淋巴细胞持续低下，转移率高、易复发

T淋巴细胞亚群检测操作程序

一、目的： 保证流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证正确的T淋巴细胞亚群检测标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。 二、修改程序： 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。 三、适用范围： 外周血中T淋巴细胞亚群的绝对计数检测。 四、实验原理： 人的T淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为二大类：辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。辅助/诱导T淋巴细胞表达CD3和CD4；抑制/细胞毒T细胞表达CD3和CD8。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料以及绝对计数管，即可以把T淋巴细胞区分为两种亚型，进面得到各亚群的绝对值。 六、主要试剂： CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 (美国BCs公司；CAT:IM3548)， 七、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： （1）标本管编号A，取一只流式专用管A1。 （2）A1管加入CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 20ul。 （3）A1管中再加入全血100ul，混均。 （4）置室温，避光孵育15min。

（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 （6）300g离心5min，弃上清液。 （7）PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。 八、参考值： 总T细胞（CD3+）：59.4-84.6 辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+): 28.5-60.5 抑制/细胞毒T细胞(CD3+CD8+): 11.1-38.3 Th/Ts: 0.9-3.6 九、临床意义： T淋巴细胞可以分为辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。测定CD4和CD8可用于化疗、自身免疫病的免疫监视。在造血干细胞移植患者中，CD4+细胞恢复晚于CD8+细胞，导致Th/Ts比例显著下降。HIV及某些病毒感染（EB病毒、SARS病毒等）患者Th/Ts比例也下降显著。 十、质量控制： 1、先用标准微球调整仪器，正确设置电压、补偿。 2、健康人CD4+细胞加CD8+细胞总数应大约等于CD3总数；免疫病、淋 巴瘤可能有较大差异。 3、收集细胞太少（少于500个）、碎片污染太多（超过10%）、门中淋巴细 胞不纯（小于90%）可能引起实验结果不正确。 4、建议使用逻辑设门方法（CD45-SSC设门与FSC-SSC设门）减少杂质的 干干扰。

淋巴细胞亚群检测

淋巴细胞亚群检测 检测对象 原则：免疫功能受损者均应常规评估淋巴细胞亚群 免疫功能包括： 免疫防御功能 免疫自稳和耐受功能 免疫监视功能 免疫防御功能受损 易发生感染 反复感染 严重感染 多种病原与特殊病原感染 常规治疗效果不佳的感染 除了宿主免疫防御受损容易造成上述少见感染状况之外，感染本身也可造成继发性免疫防御受损，因此免疫评估应注意原发和继发两方面的问题。 免疫自稳和耐受功能受损 过敏性疾病：并非所有这类患者都需要进行淋巴细胞亚群的检测。对于一些严重的过敏患者应考虑淋巴细胞亚群的检测。

①婴幼儿时期全身严重湿疹样表现。 ②嗜酸性粒细胞显著增多 ③血清IgE水平明显增高（IgE>1000IU/L） ④伴有反复、严重感染的患者 自身免疫和自身炎症性疾病 ①存在难以控制的自身免疫反应情况及出现明显的自身免疫性淋巴增殖情况 ②合并反复感染的患者 ③存在自身炎症反应 ④长期免疫抑制药物、生物制剂使用前后 免疫监视功能受损 主要引起肿瘤 血液系统肿瘤：儿童时期最为多见的是血液系统肿瘤 其他肿瘤及实体瘤：其他系统肿瘤患者也应酌情进行淋巴细胞亚群的检测，既可能存在原发性淋巴细胞亚群的异常，也可能出现继发性改变，尤其是进行各种化疗时，淋巴细胞亚群大多会受到影响 其他特殊情况 血常规中淋巴细胞明显异常 家族成员中有免疫缺陷病史

长期使用免疫抑制剂者 淋巴细胞亚群分析结果判读，应对淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数分别进行判别。 结果分析 (一)基本数据判断 1．相对计数的3个基本公式： FCM检测淋巴细胞亚群结果应首先根据下述3个公式进行评估[15]。公式1: CD3＋%＋CD19＋%＋CD16＋/CD56＋%＝100%±5% 公式2：CD4＋%＋CD8＋%＝CD3＋%±5% 公式3：CD4＋/CD8＋比值>1.0(1.5～2.0，新生儿期可达4.0) 2．相对计数基本公式意义： (1) CD3＋%＋CD19＋%＋CD16＋/CD56＋%明显大于或小于100%±5%，提示检测系统异常或存在明显淋巴细胞亚群异常。(2) CD4＋%＋CD8＋%之和明显大于或小于CD3＋%±5%，提示存在双阳性(CD4＋CD8＋)或双阴性(CD4-CD8-)T淋巴细胞。(3)一般情况CD4＋/CD8＋比值>1，年龄越小CD4＋/CD8＋比值越大。CD4＋/CD8＋比值<1，提示T淋巴细胞亚群存在异常。 3.绝对计数的判断： 绝对数标准不同仪器和年龄段及人群存在差别。个体间变化也比较大。各个实验室所采用的标准有所不同。应根据实验室的参考范围进

流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用

?５０?垦竖垫墼堕堂垄查！！！！生！旦箜！！鲞箜！塑丛』！坐！！型！』竺！！！型垫！！！ｙ堕：！！：垒坠！ ?临床研究?流式细胞术检测体液Ｔ淋巴细胞亚群的临床应用 莫扬１，许小东２ （华中科技大学同济医学院附属裹樊医院检验科，湖北襄樊４４１０２１；２．卫生部北京医院流式细胞仪室１００７３０） 【摘要】目的探讨胸水、腹水、肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群的榆测方法及临床价值。方法采用流式细胞术检测良、恶性疾病患者的５０例胸水、４６例腹水、４７例肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中Ｔ淋巴细胞亚群的水平并分组进行比较。结果１）胸水：结核性胸膜炎组胸水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（２７．３６±６．４１）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６７．９８±７．４１）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为２．６０±０．６４，肺部恶性肿瘤组胸水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６７．９７士４．２０）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３７．６１±４．８０）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为０．４７－４－０．１０，与结核性胸膜炎组比较，恶性组Ｔｈ、Ｔｈ／Ｔｓ比值显著Ｆ降（Ｐ＜０．０１）而Ｔｓ显著升高（Ｐ＜０．０１）；２）肺泡灌洗液：肺良性疾病组肺泡灌洗液Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（４４．５４－４－９．５６）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（４９．２８－＋４－１２．８８）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为１．１３±０．２９，肺部恶性肿瘤组肺泡灌洗液Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６５．１１±７．７７）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３４．５７±６．６５）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为０．５４－４－０．１９，与良性病变组比较，恶性组Ｔｈ卜．降（Ｐ＜ｏ．０５），Ｔｈ／Ｔｓ比值显著卜．降（Ｐ＜０．０１），而Ｔｓ显著升高（Ｐ＜０．０１）。３）腹水：结核性腹膜炎组腹水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３３．１１±３．３４）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６６．６９±３．７８）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为２．０３士０．２８，恶性组腹水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（５６．６４±９．３４）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３５．８６士３．３０）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为０．６５±０．１０，与结核性腹膜炎组比较，恶性组Ｔｈ、Ｔｈ／Ｔｓ比值显著Ｆ降（Ｐ＜０．０１），而Ｔｓ显著升高（Ｐ＜ｏ．０１）。结论胸腹水、肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群检测可用于分析性质并有助于评估患者局部免疫功能状态。 【关键词】支气管肺泡灌洗液；流式细胞术；Ｔ淋巴细胞哑群 中图分类号：Ｒ４４６．６１文献标识码：Ａ文章编号：１６７３—４１３０（２０１０）０１—００５０—０２ ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎｆｌｕｉｄｏｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＭＯＹａｎｋｌ，ＸＵＸｉａｏ－ｄｏｎｇ２ （１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＡｆＪ’ｉｌｉａｔｅｄｘｉａｎｇＪａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴＤ竹ｇＪｉ ＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｌｌｅｇｅ， ＨｕａｚｈｏｎｇＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｎｇｆａｎ，Ｈｕｂｅｉ４４１０２１，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｆｌｏｗｅｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎｂｏｄｙｆｌｕｉｄｏｆｔｈｅｐａ—ｔｉｅｎｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＩｎｏｖｄｅｒｔｏｇｅｔＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｂｙ３－ｃｏｌｏｕｒｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｕｔｉｌｉｚｉｎｇＳＳＣ／ＣＤ３Ｐｅｒｃｐａｎｔｉｂｏｄｙ，４７ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄａｎｄ５０ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ１）ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（６７．９８±７．４１）％，Ｔｓ（２７．３６士６．４１）％ａｎｄＴｈ／Ｔｓ（２．６０±０．６４）ｉｎＢＡＩ。Ｆｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ。ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（３７．６１士４．８）％，Ｔｓ（６７．９７±４．２０）％，ａｎｄＴｈ／Ｔｓ（０．４７士０．１０）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。ａｎｄｔｈｅＴｈｃｅｌｌｓｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｐ＜０．０５）。ａｎｄｔｈｅＴｈ／ＴｓｒａｔｉｏｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｗｈｉｌｅｔｈｅＴｓｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＢＡＬＦｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（Ｐ＜０．０１），ｅｏｍｐａｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ；２）ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（３５．７６＋－７．７１）％ａｎｄＴｓ（６４．３１士７．３７）％ａｎｄＴｈ／Ｔｓ（０．５７土０．１８）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（４９．２７土１２．８８）％，Ｔｓ（４４．５４士９．５６）ｏＡ，ａｎｄＴｈ／Ｔｓｉｓ（１．１３±０．２９）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ．ＴｈｅＴｈｃｅｌｌｓｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｐ＜０．０５），ｔｈｅＴｈ／ＴｓｒａｔｉｏｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒａｎｄｔｈｅＴｓｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＢＡＬＦｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（Ｐ＜０．０１）ｃｏｍｐａｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ；３）ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（３５．７６士７．７１）％，Ｔｓｉｓ（６４．３１±７．３７）％ａｎｄＴｈ／Ｔｓａｒｅ（０．５７士０．１８）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（４９．２７土１２．８８）％，Ｔｓｉｓ（４４．５４±９．５６）％，ａｎｄＴｈ／Ｔｓｉｓ（１．１３±０．２９）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅＴｈｃｅｌｌｓｉｎ ＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎ ｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｐ＜０．０５），ｔｈｅＴｈ／Ｔｓｒａｔｉｏｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗ— ｅｒａｎｄｔｈｅＴｓｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＢＡＬＦｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（Ｐ＜０．０１）ｃｏｍｐａｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｃｏｎ‘ｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｍｍｕｎｉｔｙｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅａｐｐｒｏａｃｈｉｓｖａｌｕａｂｌｅｉｎａｎａｌｙｚｉｎｇＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎＢＡＩ。Ｆ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ；Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓ 恶性浆膜腔积液确诊的金标准是在积液巾找到肿瘤细胞。然而在临床上，常有高度怀疑为恶性积液但未能找到肿瘤细胞的情况，从而影响到诊断的最终判断。笔者通过对患者胸水、腹水、肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群的分析判断其性质，为临床恶性积液的诊断提供了一种检测指标，现报道如下。 资料与方法 １．标本来源病例为２００６年６月至２００７年１２月在襄樊市巾心医院及卫生部北京医院呼吸科、消化科、肿瘤科住院治疗的相应疾病患者。１）胸水来源：肺癌２０例（均经病理最终证实），年龄３１～６９岁，男１７例，女３例。组织学分型：鳞癌１４例。腺癌４例，小细胞癌２例；结核性胸膜炎３０例，年龄２６～６８岁，男１８例，女１２例。刷检见结核杆菌（抗酸染色阳性）确诊。２）肺泡灌洗液来源：肺癌组２５例（男１５例、女１０例），均经病理证实，年龄３９～７１岁；肺部良性疾病组２２例（男１５例、女７例），年龄２８～７０岁，其中肺结核８例、肺炎ｌｌ例、肺结节病３

流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程

流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程 一、编号：JS0604 二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程 三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程 四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作 五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。 六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。 七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。 八、操作步骤 1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。 2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。 3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。 九、注意事项 1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。

BD流式临床检测分析-外周血淋巴细胞亚群分析

BD流式细胞术临床应用研究—外周血淋巴细胞亚群分析 临床背景： 淋巴细胞是机体细胞免疫和体液免疫应答的重要细胞成分。正常情况下，各淋巴细胞亚群（包括T细胞、B细胞、NK细胞等）可维持一定数量和比例，相互作用，稳定调节，维持着机体的正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的量及功能发生异常改变时，机体会产生一序列病理变化和免疫功能障碍，导致疾病的发生。相反，测定淋巴细胞亚群的变化，也能对疾病早期诊断和控制、临床治疗指导等提供理论依据和数据支持。利用流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群分析已广发应用月多种疾病的辅助诊断，如恶性肿瘤、血液病、自身免疫和免疫缺陷病等，对分析发病机理、观察疗效及监测预后等也具有重要意义。 检测目的： 分析外周血淋巴细胞亚群，了解患者免疫功能的异常，辅助临床诊断和治疗 常用检测项目及抗体使用： 总T细胞（CD3+）：正常值50-84%。细胞降低见于恶性肿瘤、自身免疫疾病、先天性免疫缺陷等；细胞增高见于慢性活动性肝炎、重症肌无力等；所需抗体为CD3。 总B细胞（CD3-/CD19+）：正常值5-18%。细胞增多见于自身免疫性疾病；细胞降低见于传染性单核细胞增多症等；所需抗体为CD3和CD19. T辅助/诱导淋巴细胞（CD3+/CD4+）：正常值27-51%。细胞减少见于恶性肿瘤；抗体为CD3和CD4。 T抑制/毒性淋巴细胞（CD3+/CD8+）正常值15-44%。细胞增多见于自身免疫性疾病；抗体为CD3和CD8

T辅助：T抑制细胞（CD4+：CD8+）：正常值1.4-2.0。比值降低见于艾滋病、SLE肾病、传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、骨髓移植恢复期等；逼孩子增高见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等； NK细胞（CD3-/CD16+/CD56+）：正常值7-40%，细胞降低见于恶性肿瘤特别是中晚期伴转移的肿瘤，免于缺陷病及使用免疫抑制剂等；抗体为CD3、CD16和CD56。 自然杀伤性T细胞（CD3+/CD56+/CD16+）：正常值2-13%，具有NK细胞和T细胞的标志，参与对细菌和寄生虫的反应，在控制病毒性感染中也发挥作用；抗体同6。 活化总T细胞（CD3+/HLA-DR+）和活化的单核细胞（CD14+/HLA-DR+）：正常值1.2-5.8%；抗体为CD3、CD14和HLA-DR。 调节性T细胞（CD4+/CD25+/Foxp3+）：正常值为占CD4+淋巴细胞的比例5-10%。Treg 细胞的数量减少或者功能异常具有可能导致自身免疫病的发生，可用于骨髓移植术前术后的跟踪；抗体为CD4、CD25和Foxp3。 细胞毒T细胞（CD8+/CD28+）和抑制性T细胞（CD8+/CD28-）：正常值分别为8.6-15.5%和9.9-24.8%。可作为一些自身免疫性疾病、艾滋病及免疫缺陷的免疫检测指标，CD28+亚群随HIV病程发展时数量降低，急性乙肝患者外周血CD8+/CD28+细胞呈现明显的升高；抗体为CD8和CD28。 T辅助细胞诱导亚群（CD4+/CD45RO+）：正常值9.8-26%；某些病毒感染性疾病处于进展期是它的数量增加，接收抗病毒治疗后数量会下降；抗体为CD4和CD45RO。 抑制细胞诱导亚群（CD4+/CD45RA+）：正常值15-25% 凋亡亚群（CD95+）：正常值为占CD4+淋巴细胞的比例20-50%；CD95是介导细胞凋亡的主要受体，凋亡亚群可评价细胞的凋亡情况。抗体为CD95。 血液标本要求

流式细胞术分析比较癌症患者新鲜和冻存复苏后外周血淋巴细胞亚群的实验研究

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/1b18042685.html, 流式细胞术分析比较癌症患者新鲜和冻存复苏后外周血淋巴细胞亚群的实验研究 作者：魏天雪于鸿何春莹刘玉侠 来源：《中国现代医生》2015年第29期 [摘要] 目的建立标准化的实验和分析方法，采用流式细胞术比较分析癌症患者新鲜和冻 存复苏后的外周血淋巴细胞亚群的差异。方法于2014年6～12月收集肺恶性肿瘤患者静脉血样本（2 mL/样本），每个样本取300 μL全血用于淋巴细胞亚群分析；剩余全血经裂解红细胞后冻存（40%或90%胎牛血清）。30 d后复苏细胞，流式细胞术分析淋巴细胞亚群变化。结果复苏并培养24 h后，癌症患者PBMC的存活率分别为（67.70±2.80）%（90% FCS）和（80.47±3.32）% （40% FCS，P=0.0069）。新鲜和冻存的的外周血CD3+、CD3+CD4+、 CD3+CD8+、CD3-CD16+56+、CD3+CD16+56+和CD4+CD25+ T细胞的百分率之间无显著差异（P>0.05，n=8，40%FCS）。结论短期冻存癌症患者的PBMC可用于后续检测T淋巴细胞亚群，尤其对于晚期癌症患者而言，可避免多次采血造成的负担同时提高实验的一致性。此外，本实验建立的方法也可用于临床抗肿瘤免疫治疗和其他免疫监测。 [关键词] PBMC；细胞冻存和复苏；淋巴细胞亚群；流式细胞术 [中图分类号] R329.2；R697.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）29-0029-03 Comparative analysis of lymphocyte subsets between fresh and frozen cancer patients PBMC by flow cytometry WEI Tianxue YU Hong HE Chunying LIU Yuxia Jilin Tumor Institute， Changchun 130012，China [Abstract] Objective To develop a protocol to comparative analysis of lymphocyte subsets between fresh and cryopreserved cancer patients PBMC for immunological studies by flow cytometry. Methods Blood samples （2 mL/sample） from lung malignant tumor patients were collected by venipuncture from June to December 2014. For each sample，300 μL of fresh whole blood was immediately used for lymphocyte subsets analysis. While the remaining were lysed and the isolated PBMC were cryopreserved with 40% or 90% FCS. Following storage for 30 days， the samples were removed and quickly thawed in 37℃ water bath. After cultured for 24 h， the cells were stained with antibodys. The analysis was performed using an Epics XL/MCL flow cytometry（Beckman Coulter）. Results After separating， the cell recovery of PBMC was（67.70±2.80）% of 90% FCS vs （80.47±3.32）% of 40% FCS（P=0.0069）. There were no significant differences in the frequencies of CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD16+56+，CD3+CD16+56+，and CD4+CD25+ T cells between the fresh and frozen PBMC（P>0.05，n=8，40% FCS）. Conclusion