盐酸法舒地尔后适应对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护探究

盐酸法舒地尔后适应对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护研究

研究生蒋智慧指导老师张俊峰

中文摘要

研究背景

急性心肌梗死（AMI）是最危险的急症之一，再灌注是其最佳治疗。但心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）已经成为影响心肌再灌注治疗效果的主要因素，因此如何减轻MI/RI对治疗急性心肌梗死具有重要意义。先后有学者提出缺血预适应（IPC）和缺血后适应（IPost），成为减轻MI/RI有价值的干预方式，然而其临床应用明显受限。近来研究提示很多药物如腺苷、缓激肽、促红细胞生成素（EPO）等能激活IPC和IPost的相关信号通路，起到减轻MI/RI的作用，这种药物干预过程即称之为药物后适应（PPost）。由于PPost减轻MI/RI的方式方便、快捷，目前已经成为临床研究的热点，是最具有临床应用前景的干预方式。既往研究提示：细胞凋亡是MI/RI发生机制的重要环节，是心肌受损、心力衰竭发生、发展的重要因素。关于MI/RI过程中细胞凋亡的发生机制尚未十分明确，目前的研究认为心肌缺血再灌注导致中性粒细胞增多，线粒体能量合成障碍，Ca2+稳态紊乱和大量自由基产生，是导致细胞凋亡的主要原因。目前研究提示Rho/ROCK通路与MI/RI 关系密切，Rho激酶在心肌细胞凋亡过程中具有相当重要的作用，最近的研究表明，Rho/ROCK通路通过激活肿瘤抑制因子p53基因，使Bax（Bcl-2家族的促凋亡蛋白）表达增高，介导线粒体途径引起心肌细胞凋亡，所以抑制Rho激酶活性能够减轻MI/RI。盐酸法舒地尔作为Rho激酶抑制剂，可以通过与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点而抑制Rho激酶活性，因此我们推断其具有减轻MI/RI的保护作用。本实验将以此推断展开研究，既往动物实验研究均是通过静脉途径方式给药，本实验将以另外一种方式——模拟冠脉内给药途径进行研究。

目的

1．建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型，通过主动脉根部模拟冠脉内给药，评估盐酸法舒地尔对MI/RI的影响；

2．探讨盐酸法舒地尔影响MI/RI可能的机制。

方法

本研究通过球囊垫扎法制作大鼠在体缺血再灌注模型；SD大鼠被随机分为假手术组、缺血再灌注组、缺血后适应组、盐酸法舒地尔组、盐酸法舒地尔+PI3K 抑制剂组；各组于再灌注180 min后处死大鼠，分别测定心功能参数、血浆心肌酶谱、细胞凋亡指数和心肌梗死范围；用Western Blot 方法测定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Akt及P-Akt在心肌组织中的表达。

结果

本研究发现盐酸法舒地尔组与缺血再灌注组比较，心功能参数明显改善（P＜0.05），血浆心肌酶含量明显下降（P＜0.05），心肌细胞凋亡指数和梗死范围明显降低（P＜0.05）；而盐酸法舒地尔组与缺血后适应组比较，上述结果无统计学差异（P＞0.05），提示盐酸法舒地尔减轻MI/RI的作用类似缺血后适应效应，具有PPost 效应。但给予PI3K抑制剂LY-294002后，盐酸法舒地尔药物后适应作用消失，即盐酸法舒地尔+PI3K抑制剂组心功能参数、血浆心肌酶、心肌细胞凋亡、心肌梗死范围与缺血再灌注组相似（P＞0.05），与盐酸法舒地尔组比较具有统计学差异（P ＜0.05）。此外，盐酸法舒地尔组心肌组织中Bcl-2、P-Akt表达升高、Bax、Caspase-3表达降低（与缺血再灌注组比较P＜0.05）；而盐酸法舒地尔+PI3K抑制剂组心肌组织中Bcl-2、P-Akt表达降低；Bax、Caspase-3表达升高（与盐酸法舒地尔组比较P＜0.05），初步推断盐酸法舒地尔能够通过激活PI3K-Akt途径减轻MI/RI，需通过进一步深入研究证实。

结论

1．模拟冠脉内注射Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔能减轻大鼠在体心肌缺血再灌注模型MI/RI：缩小心肌梗死面积，减少缺血心肌细胞凋亡，具有PPost效应。2．盐酸法舒地尔后适应的机制初步推断与激活PI3K-Akt传导通路有关。

[关键词]缺血再灌注损伤；药物后适应；Rho激酶；盐酸法舒地尔

Protective effects of Fasudil Hydrochloride on postconditioning of acute myocardial ischemia/reperfusion

injury in rats

Graduate：Zhihui Jiang Supervisor：Junfeng Zhang

ABSTRACT

Background

Acute myocardial infarction(AMI) is one of the most acute critical disease in cardiology, and reperfusion has been thought to be the best therapy. However, myocardial ischemia/reperfusion injury(MI/RI) is the major factor influencing the curative effect. Therefore, it is of great significance to to alleviate MI/RI when myocardium gets reperfusion. Ischemic precondition(IPC) and ischemic postconditioning(IPost) phenomenon, which has been put forward before and after, seem to become therapies with the best prospect. However, recent studies show that variety of medicine such as adenosine(ADP), bradykinin(BK), erythropoietin(EPO) are able to activate the signaling pathway of IPC and IPost, mitigating MI/RI. This is pharmacological postconditioning(PPost). Application of PPost to alleviate MI/RI is convenient and speedy, so it has become a hot spot in clinical research and seems to be with the best application prospect. Previous studies demonstrated that apoptosis was an important factor in the mechanism of MI/RI that promote myocardium injury and heart failure. But it is not very clear about apoptosis process. Present studies show that myocardial ischemia and reperfusion lead to the increase of neutrophils, the dysfunction of mitochondrial energy synthesis, the disorder of Ca2+ steady state, and the production of lots of free radical. These are thought to be the primary causes of cell apoptosis. It has also been detected that Rho/ROCK signaling pathway is tightly associated with MI/RI, and Rho kinase plays an important role in cardiocytes’apotosis. Rho/ROCK pathway can promote the expression of Bax through activating the gene of tumor suppressor p53, which mediates apoptosis via mitochondria way. Therefore, inhibition

of Rho kinase is able to alleviate MI/RI. As the inhibitor of Rho kinase, Fasudil Hydrochloride can restrain the activity of Rho kinase by competing ATP binding site in Rho kinase catalytic domain with ATP, so we deduce that it may alleviate MI/RI. This deduction is just the basis of our study. In previous studies intravenous injection was adopted most, while in this study we applied another way- intracoronary injection. Objective

1．Our experiments aim to establish models of myocardial ischemia/reperfusion in rats and drug through coronary ways at aortic roots, evaluating the effect of Fasudil Hydrochloride to MI/RI.

2．We aim to explore the possible mechanism of the effect of Fasudil Hydrochloride to MI/RI.

Methods

We established experimental models of myocardial ischemia/reperfusion in rats by ligating coronary artery with capsule. SD rats were randomly divided into 5 groups：Sham operation group(Sham group)，ischemia/reperfusion group（I/R group），ischemic postconditioning group（Ipost group），Fasudil Hydrochloride group（FH group），Fasudil Hydrochloride and an inhibitor of PI3K（LY294002）group（FH+I group）. Animals were sacrificed after 180 minutes reperfusion to determine heart function parameters, plasma myocardial enzymes, cell apoptosis index and myocardial infarct size; western blot was used to detect the expression of Bcl-2、Bax、Caspase-3、Akt and P-Akt in myocardial tissues.

Results

We found that the level of heart function parameters, plasma myocardial enzymes, apoptosis index and myocardial infarct size in FH group were significantly lower than those in I/R group（all P＜0.05）while there were no statistical differences of those between FH group and Ipost group（all P>0.05）. It demonstrated that the role of alleviating MI/RI of Fasudil Hydrochloride was similar with that of Ipost, and Fasudil Hydrochloride had PPost effects. However, PPost which induced by Fasudil Hydrochloride disappeared after the effect of LY-294002, one inhibitor of PI3K. These indexes in FH+I group were similar to those in I/R group（all P>0.05）, and were significantly different with those in FH group（all P＜0.05）. In addition, the expression

of Bcl-2 and P-Akt increased while Bax and Caspase-3 decreased in FH group, compared with I/R group （all P＜0.05）. The expression of Bcl-2 and P-Akt decreased while Bax and Caspase-3 increased in FH+I group, compared with FH group（all P＜0.05）. So we deduce that Fasudil Hydrochloride can alleviate MI/RI through the activation of PI3K-Akt pathway, which needs further researches.

Conclusion

1．As a Rho kinase inhibitor, Fasudil Hydrochloride that injected through intracoronary way is able to alleviate MI/RI, reduce myocardial cells apoptosis and infarct size, mediating PPost effect.

2．The mechanism of PPost effect of Fasudil Hydrochloride is associated with the activation of PI3K-Akt signaling pathway.

【Key Words】Ischemia/reperfusion injury; Postconditioning; Rho kinase; Fasudil Hydrochloride

前言

近年来，冠心病成为人类死亡的头号“杀手”，其中急性心肌梗死是较常见、严重威胁生命的表现形式。目前研究认为，及时、有效地开通“罪犯”血管，使缺血心肌得到有效再灌注，是其治疗成功的关键[1]。但是，再灌注本身也会造成心肌细胞代谢功能障碍和形态结构破坏，进而加剧心肌损害[2-3]，即为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）。因此，如何在恢复心肌再灌注的同时减轻MI/RI成为临床治疗的挑战。1986年Murry等[4]首先提出缺血预适应（ischemic precondition，IPC），即对狗缺血心肌模型进行几次反复短暂的再灌注后，可以提高心肌组织对随后持续再灌注引发损伤的耐受性。然而对于临床上急性心肌梗死的不可预测性，IPC的应用价值非常有限。2003年，Zhao等[5]在对狗的缺血再灌注研究中首次发现，于再灌注开始前对心脏进行3次30秒再灌注和30秒再缺血可以显著减少心梗面积，减轻缺血再灌注损伤，并将此现象称为缺血后适应（ischcmic postconditioning，IPost）。其后，IPost效应在急性心肌梗死患者介入治疗中保护心肌，改善预后的临床价值得到证实。然而，通过球囊反复扩张实施IPost 的方法，操作费时且易造成冠脉内膜损伤、血栓脱落引发“慢血流”及“无复流”等严重并发症，也阻碍了其临床应用。在此基础上，有学者考虑到一种新的心肌保护策略：寻求在再灌注前或更早期给予某种药物干预，使其能在体内发挥类似IPost的保护作用，并将这种药物干预作用称之为药物后适应（pharmacological postconditioning，PPost）[6]。近年来研究发现，很多药物如腺苷、缓激肽、促红细胞生成素（EPO）等都能激活IPC和IPost相关的信号通路，起到减轻MI/RI的作用[7]。由于PPost减轻MI/RI的方式方便、快捷、可行性高，目前已成为临床研究的热点，是目前最有临床应用前景的干预方式。

MI/RI机制涉及氧自由基损伤、钙超载、细胞凋亡、内皮功能障碍等，近年研究表明，细胞凋亡是该机制中的重要环节，是心肌受损、心力衰竭发生、发展的重要因素。关于心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生机制尚未十分明确，目前的研究认为心肌缺血再灌注导致中性粒细胞增多，线粒体能量合成障碍，Ca2+稳态紊乱和大量自由基产生，是导致细胞凋亡的主要原因。目前研究提示Rho/ROCK 通路与MI/RI关系密切[8]，最近的实验表明，Rho/ROCK通路通过激活肿瘤抑制因

子p53基因，使Bax表达增高，介导线粒体途径引起心肌细胞凋亡，所以抑制Rho 激酶活性能够减轻MI/RI[9]。盐酸法舒地尔（FH）[六氢-1-（5-磺酰基异喹啉）-1（H）-1,4二氮杂卓]可以通过与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点而抑制Rho激酶活性[10]，是第一个应用于临床的Rho激酶特异性抑制剂，对Rho激酶的抑制有效性较对其他蛋白激酶如蛋白激酶C（PKC）、cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）和肌球蛋白轻链（MLC）激酶等高100多倍。因此，盐酸法舒地尔作为Rho激酶抑制剂，我们推断其具有减轻MI/RI的保护作用，具有PPost效应，并以此为背景展开研究。既往研究基本是通过静脉途径方式给药，而冠脉内给药途径研究很少。张永明等[11]通过主动脉根部——冠脉途径给药，发现依达拉奉药物后处理对急性心肌缺血再灌注损伤保护效果优于静脉途径，提出主动脉根部——冠脉途径可能会提高药物后适应的效率和作用。本实验研究即是通过主动脉根部模拟冠脉内给药方式，评估盐酸法舒地尔对大鼠缺血心肌的药物后适应效应，并探讨其可能的作用机制。

材料与方法

1．实验动物及来源

清洁级健康雄性SD大鼠90只（购自第二军医大学实验动物中心），体重

（250±10）g，鼠龄150-180天，大鼠分笼饲养，每笼6只，保持室温（23±2）℃、相对湿度60 %-65 %、安静、12小时明暗交替人工光照环境，无特殊病原体条件下，饮用水和标准饲料均经灭菌后供动物自由取用，笼具垫料每周更换2次。

2．主要试剂及材料

盐酸法舒地尔（Fasudil Hydrochloride，HAl077，商品名川威，批号1011051）

总蛋白抽提液（Total protein extraction reagent）

天津红日药业上海普飞生物公司

标准BSA溶液（standard BSA solution）上海普飞生物公司甲醇（methanol）Sigma公司冰乙酸（glacial acetic acid）Sigma公司TWEEN-20 Sigma公司酪蛋白（casein）Sigma公司滤纸（filter paper）Whatman公司Tris碱（Tris base）Sigma公司盐酸（HCl）Sigma公司十二烷基磺酸钠（SDS）Sigma公司N,N,N,N－四甲基已二胺（TEMED）Sigma公司过硫酸氨（ammonium persulfate）Sigma公司甘油（glycerine）Sigma公司二硫苏糖醇（DTT）Sigma公司溴酚蓝（bromophenol blue）Sigma公司

甘氨酸（glycin）Sigma公司立春红（red stain）Sigma公司硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter, NC filter）Sigma公司4%中性甲醛溶液（4%neutro-formaldehyde）上海化学试剂公司1%多聚赖氨酸（poly-L-Lycine, PLL）武汉博士德生物工程有限公司二甲苯（dimethylbenzene）上海化学试剂公司无水乙醇（anhydrous alcohol）上海试剂一厂蛋白酶K（Proteinase K 1:1000）晶美生物工程公司2水磷酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O）上海新华化工厂12水磷酸二氢钠（NaH2PO4.12H2O）上海新华化工厂柠檬酸三钠（citrate trisodium）上海化学试剂公司柠檬酸（citric acid）上海化学试剂公司显影液（develop solution）柯达公司定影液（fixation solution）柯达公司发光液（luminescence solution ）上海普飞生物公司丙稀酰胺（propene acidamide）Sigma公司甲叉双丙稀酰胺Sigma公司内参蛋白二抗SANT CRUZ 酶标二抗Sigma公司Phospho-Akt（Ser473）（193H12）Cellsignal公司Akt抗体Cellsignal公司Bcl-2抗体Abcam公司Bax抗体Abcam公司Caspase3抗体Abcam公司ROCK1抗体Abcam公司原位细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL box）武汉博士德生物工程有限公司

3．实验器械

高压球囊（Lacrosse，3.0×10 mm ）Micro-beta液闪仪日本Goodman公司

Wallac

多道细胞收集器上海医用仪器厂暗盒柯达公司胶片柯达公司紫外分光光度计美国HACH公司DR/4000UV-VIS 电泳装置BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ转移装置BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ恒流恒压电泳仪BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ胶片分析仪上海天能公司病理切片机上海红宇电子设备一厂QP-4型数字

显示上皿电子天平上海天平仪器厂JA2003 Mα×200g 匀浆机宁波新芝仪器有限公司低温离心机贝克曼生物公司Allegra 25R 摇床上海申能博彩生物公司移液器Eppendorf公司烘片机HI1220 型德国Leica 公司

光学显微镜

数码相机（COOLPIX-P6000）动物呼吸机（ALC-V8）

半自动生化分析仪（XD811）微量注射泵（WZ-50F6）

电热恒温水温箱

Power Lab（8/30）

电推剪（CP-6800）

德国Leica 公司

日本Nikon 上海奥尔科特生物技术有限公司上海迅达医疗仪器有限公司浙江史密斯医疗仪器有限公司

上海医疗器械厂

科德士电子设备厂

美国CWE公司

其他器械：微孔滤膜滤器（直径0.22微米）、50mlCOSTA培养瓶、6孔培养板、玻璃平皿、离心管、量筒、玻璃瓶（20 ml、100 M、200 ml、500 m1）、医用注射针管（1 ml、2 ml、5 m1）若干、眼科剪、眼科镊、动物手术台、手术刀、止血钳、一次性医用胶皮手套若干，由第二军医大学实验动物中心提供或由医疗器械公司购买。

4．工具软件

计算机图像分析软件（Image J 3.0），统计软件（SPSS11.5）。

5．技术路线

6．实验方法及步骤

6.1动物模型建立

按赵秀梅等[12]球囊垫扎法制作大鼠在体心肌缺血/再灌注模型。具体步骤如下：6.1.1仪器调零，压力换能器及连接管道充满肝素钠溶液（肝素经生理盐水稀释至500 U/ml），排除气泡，调试仪器为工作状态；

6.1.2动物称重后，3 %戊巴比妥（2 ml/kg）麻醉动物，仰卧固定，连接心电电极，检测Ⅱ导联心电图记录心肌缺血再灌注时的心电图变化；颈部、左侧胸部剃毛，消毒铺巾；

6.1.3颈部正中纵向切口约1 cm，钝性分离肌肉，暴露气管，插入气管插管以动物呼吸机辅助呼吸（潮气量30 ml/kg，频率50～60次/分，吸呼比1:2）；

6.1.4分离右侧颈总动脉，插入内径为0.8 mm聚乙烯塑料导管（充满肝素钠溶液），导管末端接压力换能器，信号输入Power Lab生理实验系统，沿向心方向插入至出现特征性左心室压力波为标志；

6.1.5沿胸骨左缘心脏搏动处纵向切开皮肤约2 cm，逐层分离，剪断第3、4肋骨，快速开胸暴露心脏。撕开心包将心脏轻轻挤出，在左心耳下1 mm，肺动脉圆锥旁开0.5 mm处用微创缝合针进针，进针深度为1～1.5 mm，宽2～3 mm，连同心大静脉、高压球囊（连接压力泵，保持2 atm，垫于血管与结扎线之间）一齐结扎（松结）；

6.1.6将压力泵迅速调节为12 atm，心电图出现ST段抬高和（或）T波高耸或倒置，提示完全阻塞冠状动脉前降支（LAD）；迅速调节压力泵压力为0 atm，抬高的ST 段恢复正常或下降超过50%以上，视为冠状动脉前降支缺血再灌注成功；

6.1.7轻轻提拉切口皮肤，将心脏送回胸腔、并轻挤排除胸腔气体，止血钳夹闭胸腔。

6.2实验分组

SD大鼠编号后随机分为5组，每组12只。（1）假手术（Sham）组：开胸，以5-0无创缝合线穿过LAD，不结扎，旷置180 min；（2）缺血/再灌注（I/R）组：

缺血60 min后，将压力泵迅速调节为0 atm，恢复血流，持续灌注120 min；（3）缺血后适应（IPost）组：缺血60 min后，在再灌注前通过迅速调节压力（0-12 atm）使球囊抽瘪-充盈实现再灌注与缺血，反复6次，其时间为15/15 s×6，然后再持续再灌注177 min；（4）盐酸法舒地尔（FH）组：缺血60 min后将压力泵迅速调节为0 atm，立即使用微量注射泵，通过插入右侧颈总动脉的聚乙烯塑料导管，以左室压力波形消失为标志将测压导管从左室撤到主动脉根部，将溶有盐酸法舒地尔的生理盐水（500 ug/ml）以500 ug·kg-1min-1×5 min注入主动脉根部模拟冠脉内给药，然后持续再灌注175 min；（5）盐酸法舒地尔+PI3K抑制剂（FH+I）组：将PI3K抑制剂LY-294002采用生理盐水配制浓度为75 μg/ml，在缺血前10 min 采用股静脉给药，给药体积为1ml/kg，然后按照FH组进行。

6.3数据采集

6.3.1心功能参数测定

经右颈总动脉插入左心室导管，接压力换能器输入Power Lab监测并记录各组再灌注末时的血流动力学功能参数，即左室最大压力（Max Pressure）、左室最小压力（Min Pressure）、心率（HR），左室内压最大变化速率（±dp/dt max）。

6.3.2心肌酶谱测定

在再灌注末，经颈动脉插管取血2 ml，以3000 r/min×10 min离心后取血浆，分别按试剂盒说明书测定CK、LDH含量，单位为U/ml。

6.3.3脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡

6.3.3.1石蜡切片标本处理

（1）再灌末每组取6只SD大鼠，经颈动脉插管取血后，脱臼处死动物，立即取出

心脏，剪除左右心耳及右心室，于冰盐水中洗去残血；将缺血区心肌组织（左心室前壁中间段）剪下，保存在4 %的中性甲醛中固定24 h；

（2）酒精脱水：50 %、60 %、70 %、80 %、90 %酒精中分别浸泡1.5 h；

（3）二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分别浸泡10 min；

（4）将组织浸于65-70℃石蜡中60 min；

（5）包埋机进行组织石蜡包埋；

（6）切片机进行切片，厚度5 mm；

（7）烤片机中70℃下烤片1 h，备用。

6.3.3.2按照TUNEL试剂盒说明书进行检测

（1）石蜡片65℃烤片2 h，使组织块牢固黏附于玻片上；

（2）二甲苯脱蜡：将石蜡切片置于二甲苯中浸洗2遍，每遍5 min；

（3）100 %乙醇浸洗2遍，依次用95 %、85 %、70 %、50 %的乙醇浸洗1遍，每遍3 min；

（4）PBS浸洗3遍，每遍5 min；

（5）置于3 %H2O2中室温孵育10 min，PBS浸洗3遍，每遍5 min；

（6）滴加100 ul新的蛋白酶K工作溶液覆盖在样本区域上，室温放置15 min；（7）PBS浸洗3遍，每遍5 min；

（8）将50 ul酶溶液（Enzyme solution，vial 1）加入450 ul标记液（Lable solution，vial 2）得到500 ul TUNEL反应混合液，充分混合后置于冰上备用；

（9）将样品周围擦干，加50 ul TUNEL反应混合液，湿盒中避光37℃孵育60 min，PBS冲洗3遍；

（10）将样品周围擦干，加50 ul POD转化液（converter-POD，vial-3），湿盒中避光孵育30 min，PBS冲洗3遍；

（11）加50-100 ul DAB底物或任意POD底物，室温孵育10 min，镜下显色；（12）甲基绿复染，随后依次用70 %、90 %、100 %的乙醇浸洗1遍，每遍3 min；（13）二甲苯浸洗固定，树脂封片；

（14）正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈褐色。每张切片在400倍视野下随机选取梗死周边区的5个视野，观察100个细胞并计数TUNEL阳性细胞数，并以百分

数（%）表示凋亡指数（AI）。

6.3.4心肌梗死范围测定

通过心肌梗死重量与全心室重量比值测定心肌梗死范围：

（1）再灌末每组取6只SD大鼠，经颈动脉插管取血后，脱臼处死动物，迅速取出心脏，剪除左右心耳，于冰盐水中洗去残血，滤纸吸干，称全心室重量；（2）从心尖向心底平行于房室沟方向将全心室切成相等厚度5片，于冰盐水中洗去残血，滤纸吸干；

（3）置于37℃0.1 %NBT溶液中孵育10～20 min，染色过程中不时震荡染色液使之与心肌充分接触；

（4）取出心肌片立即用生理盐水冲去多余染料，梗死心肌不着色，非梗死心肌被染成着黑色；

（5）将心肌片放置于10 %中性甲醛中固定过夜；

（6）取出用数码相机拍照，将图像转换为数字图像，以Image J软件对图像进行测量分析；

（7）剪去着色部分，将未着色的梗死区称重；

（8）计算心肌梗死重量与全心室重量比值。

6.3.5蛋白检测-Western blot方法

6.3.5.1样品的准备

（1）将上一试验处理的心脏缺血区心肌组织剪碎，按照1 g/ml量加入细胞总蛋白抽提液，待组织样品完全破碎后，转入准备好的1.5 ml的eppendorf管中。

（2）在冷冻高速离心机中离心，13000转/分钟，20分钟。

（3）取其上清，然后加入同样数量的样品缓冲液，最终的样品缓冲液条件是2 % SDS、100 mmol/L DTT（从1mol/L的贮存液中取出，临用前加入，该贮存液置于-20℃冷冻保存）、60 mmol/L Tris （ph 6.8）、0.01 %溴酚蓝和10 %甘油。样品量为20 ul，上样量为30 ug。

6.3.5.2样品浓度测定

6.3.5.2.1采用A280方法进行浓度测定

（1）在测定前30分钟，打开分光光度计的紫外灯，并将波长调到280 nm。（2）溶剂空白对照调零。测定标准和样本蛋白的吸光值。

（3）使用标准曲线计算未知样品蛋白浓度。

6.3.5.2.2标准曲线的制备

6.3.5.2.3样品浓度的测定

将样品稀释200倍，进行A280测定：

6.3.5.3 SDS－PAGE凝胶电泳

6.3.5.3.1配制电泳缓冲液（见附录B）

6.3.5.3.2配制所需的浓缩胶和分离胶（见附录B），并倒凝胶平板

6.3.5.3.3电泳步骤

（1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃平板和0.75 mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。

（2）将配制好的分离胶溶液，用加样器将其灌注到玻璃平板夹层中，至顶层约2 cm 高为止。

（3）在用移液器往夹层的液面顶部缓缓加入一层水，让凝胶在室温聚合30-60 min。聚合后，可见在水层和凝胶层的界面间有一清晰的折光线。

（4）倾去顶层的水，并以1×Tris.cl/SDS，PH 8.8缓冲液冲洗凝胶的顶层表面。（5）用移液器将配制好的浓缩胶加入到玻璃平板夹层，将0.75 mm厚的梳子插入夹层的浓缩胶液体中，必要时补加浓缩胶使液体充盈剩余空间，让浓缩胶室温聚合30-45 min。

（6）在微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1（V/V）稀释代测蛋白质样品，于100 ℃煮沸3-5 min。同时，按供应商的使用指南融解蛋白质分子质量标准。（7）小心拔出梳子，避免撕裂凝胶加样孔。取出梳子后，以1×电泳缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满之。

（8）按厂商指南将凝胶板固定到电泳槽中，同时加入配制好的1×电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。

（9）用25 ul的注射器将蛋白样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部形成一薄层。

（10）连接电源，采用恒压电泳法，电压为110 V，时间为60 min。

（11）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。将凝胶夹层取出。

（12）将凝胶定位以识别加样顺序，小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆撬起上面的玻璃平板，使凝胶保露出来。

6.3.5.4用转移槽转印蛋白质

（1）配制转印缓冲液（见附录B）

（2）电泳完成后，拆卸凝胶夹层，取出积层胶。以适量的转印缓冲液室温平衡凝胶30 min。

（3）将转移盒放入一个较大的托盘中，加入足量大的能浸没整个转移盒的转移缓冲液。

（4）在塑料盒的底边，依次将下列物品组装转印夹层（用一玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动，以排去凝胶和滤纸间得气泡）：

?转移垫

?一张剪切得如凝胶大小得滤纸，并预先以转移缓冲液湿润

?凝胶

（5）制备转印膜，按凝胶大小但各边都比凝胶大约1 mm剪膜。呈45度角地慢慢将硝酸纤维素膜放入转印缓冲液中，平衡10-15 min。

（6）转印缓冲液湿润凝胶表面。直接将湿润地膜放在凝胶上，排去气泡。

（7）湿润另一张滤纸，并置于膜地阳极面，排去所有气泡。在滤纸地上面放另一块转移垫。

（8）将转移盒扣紧，完成。

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（9）在转移槽中加入转移缓冲液，按正确地极性方向将转移盒放进电转仪中，连接电源。

（10）在冷却条件下100 V电转120 min。

（11）关闭电源，拆卸转印装置，取出转印膜，并在膜上剪一小角作为标记定位。

6.3.5.5转印后蛋白质地可逆染色

（1）室温中将硝酸纤维素膜放入立春红S染料溶液中染色5 min。

（2）在水中脱色2 min，拍照。结果如下。

（3）在水中再浸泡10 min，使完全脱色。

6.3.5.6用抗体偶联物进行免疫检测

（1）将膜放入可密封地塑料袋，加5 ml封闭液，密封塑料袋。再旋转摇床或摆动平台中室温摇动30-60 min。

（2）用封闭液稀释第一抗体。第一抗体的稀释度依经验而定，通常多克隆抗体的稀释度为1∶100至1∶1000；Akt，P-Akt，bcl-2，Bax，caspase-3，ROCK1抗体的稀释比例均在这一范围。

（3）打开袋子，倾去封闭液，以稀释的第一抗体工作液代替之。再室温下持续摇动120 min。

（4）带着手套从塑料袋中取出膜，放在塑料盒中摇动着用200 ml TTBS洗4次，每次10-15 min。

（5）用封闭液稀释二抗（1∶1000）

（6）将膜放进一新的可密封塑料袋子，加入稀释的二抗，在室温持续摇动60 min。（7）从塑料袋中取出膜，并按步骤4洗膜。

6.3.5.7用发光底物显迹

（1）用50 ml底物缓冲液洗膜两次以平衡膜，每次15 min。

（2）将膜移入显影液中，浸泡1 min。

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（3）取出膜，滴干水分，将膜正面朝下放在一张透明的塑料保险膜上，向后折叠用保险膜将膜紧密包裹起来。

（4）在暗房中，将膜正面朝下放在感光胶片上，放射自显影10 s或5 min。（5）将曝光好的胶片进行显影，定影。

6.3.5.8分析结果

采用Image J图像分析软件分析蛋白条带的积分吸光度值（IA），IA=平均光密度值×面积，以靶蛋白IA值/GAPDH IA值的比值反映靶蛋白相对水平。便于数据统计处理，设定sham组各靶蛋白IA比值为1，其他各组相对应的靶蛋白IA比值×相关系数（系数为1/sham组各靶蛋白IA值/GAPDH IA值）。