乳酸菌代谢途径的基因工程调控

MTT法测定乳酸菌活菌数的研究

62 MTT法测定乳酸菌活菌数的研究 黄立坤，杜鹏2，霍贵成* 乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学） (哈尔滨 150030) 摘要建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。以乳酸菌中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为研究对象，探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围、反应时间、MTT 的用量、是否加入溶解剂等实验条件。结果：保加利亚乳杆菌在(1.0×105～2.18×107) cfu/mL内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间1.5 h，MTT添加量20 μL，测量前用DMSO溶解；嗜热链球菌在(2.0×105～5.12×107) cfu/mL范围内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间2.0 h，MTT添加量20 μL，可不添加溶解剂直接测量。MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。关键词MTT；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；活菌计数 Inquiring into the Method of Counting Live Germ with MTT Abstract To establish a rapid, steady and sensitive bacteria-counting method that could reflect the bacteria’s activity. Lactabacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and St reptococcus thermophilus were employed to discuss the feasibility of application of MTT method to bacteria-counting and determine the conditions of the assay, including linear range, reaction time, MTT dosage and whether solvent is added etc.. Results: The optical density at 570 nm is positively related to the concentration of L.delbrueckii ssp. bulgaricus when the number of the bacteria is in the range of (1.0×105~2.18×107) cfu/mL, and reacting time is 1.5 h, MTT dosage is 20 μL, and DMSO is used as solvent before assay; For St.thermophilus , the optical density at 570 nm is positively related to the concentration of the bacteria when the number of the bacteria is in the range of (2.0×105~5.12×107) cfu/mL, and reacting time is 2.0 h, MTT dosage is 20 μL and solvent is not added.. Conclusion: MTT colorimetry could be used to measure the viability of lactic acid bacteria. Keywords MTT colorimetry ；lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；live germ counting 基金项目：国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-08）资助。* 通讯作者 活菌计数在科研生产中有着广泛的应用，用于细菌计数的常规方法有平板稀释计数法(SPC)，自动菌数测定仪法，浊度法，菌体干重法等。SPC法为经典方法，但方法繁琐，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合于做大批量的实验；后几种方法不能区分细胞的死活，且测定结果受培养基、代谢产物的影响较大[1]。试验用MTT快速活菌计数法，以克服上述缺点，且工作量小，操作简单，快速，重复性好，能区分死活菌等。 MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，结构式如图1。MTT法基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT的四唑环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Fonmazan），而死细胞无此作用[2]。形成的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，在一定细胞浓度范围内，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性[3]。1 材料与方法 1.1 材料 图1 MTT的分子结构式 1.1.1 菌种 保加利亚乳杆菌（L . delbrukki subsp. bulgaricus ，L.b ）1.8501菌株和嗜热链球菌（S .thermophilus ，S.t ）3.8501菌株，均为乳品科学教育部重点实验室（KLDS ）提供。1.1.2 试剂及溶液 （1）试剂：MTT，二甲亚砜(DMSO)。 （2）MTT溶液配制：称取100 mg MTT (Amresco 分装)于小烧杯中。加20 m L P B S (0.0l m o l /L ，pH=7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存。两周内使用，时间过长，溶液中易进微生物起反应，改变MTT溶液的浓度。

关于乳酸菌的分离与发酵的实验

乳酸菌的分离与发酵实验 生命科学学院2009级四班2组 傅盛晟 摘要：本文对乳酸菌的分离与发酵实验进行阐述，从市售酸乳中分离保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并进行分离与鉴定，最后进行酸乳的发酵实验！实验主要是分离与纯化，鉴定与发酵，最后用分离的菌进行酸乳发酵在与市售酸乳混合菌种进行比较。 关键词：酸奶，乳酸菌，分离鉴定，发酵 微生物在厌氧条件下，分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要能利用可发酵糖生产乳酸的细菌，即乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobaterium)和明串珠菌属(Leuconostoc)等。乳酸细菌多是耐氧菌，只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸茵或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。 酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发醇而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发醇制品，是具有一定保健作用的食品。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽．由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，因此，达到了稳定状态的彻合发酵。酸乳发酵的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪

蛋白(在全乳中的质量分数为2．9％，在乳蛋白中的质量分数为85％)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其PH降至酪蛋白等电点(4.6)附近(4.0~4.6)从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酷蛋内降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二酮等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。按凝固状态可将酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似，本实验主要是凝固型酸奶的制作方法。 一，材料与方法 1.材料和用具 1）菌种，嗜热乳酸链球菌，保加利亚乳酸杆菌，这两类菌种可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。 2）培养基参照相关文献和老师的建议以及乳酸菌生长需要复杂营养物质和多种生长因子，我们选用如下培养基： 分离纯化培养基：脱脂乳平板培养基 鉴定培养基：脱脂乳试管 其他：脱脂乳粉或脱脂牛奶，蔗糖等 3）仪器及用具恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，试管，三角瓶若干 2.培养条件 培养温度：40℃ 厌氧条件：由于乳酸菌的发酵与分离纯化都需要厌氧条件，而实验室没有专门的厌氧培养箱，所以我们采用在培养皿和发酵杯上套上保鲜膜制造无氧环境。 培养时间：在培养基上分离培养的时间为2天左右，酸乳发酵为12个小时左右 方法和步骤 1）乳酸菌的分离纯化 101-~105-，取其中的 (1)分离。取市售新鲜酸乳或泡菜的酸液稀释 104-、105-2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别接入脱脂乳琼脂培养基上，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或者直接用接种环沾取原液，平板划线分离，置40℃下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (2)鉴别。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞呈杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色阳性，则可将其接种到试管斜面上连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 2）乳酸菌饮料—酸乳的发酵

乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用要点

食品微生物课程论文 题目乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用姓名费鹏学号2013309010006 专业食品科学评分 指导教师谢笔钧职称教授 中国·武汉 二○一三年十二月

乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用 摘要：乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一，其通过发酵糖类，主要产生乳酸，被广泛应用于发酵肉制品、酱油、白酒、饮料等行业。本文对其代谢过程、发酵条件及其在食品中的应用进行了综述。 关键词：乳酸菌；代谢；发酵；食品工业 Abstract: Lactic acid bacteria is one of microorganisms which human being earliest used in food storage and processing. It can produce lactic acid by fermenting saccharides, which were applied in the field of fermented meat product, soy, wine, beverage and so on. This paper introduced the metabolism, fermentation conditions of LAB and its application in food industry. Keywords: Lactic acid bacteria; metabolism; fermentation; food industry 乳酸菌是一类能利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称[1]。乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae )。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus )、链球菌属(Strptococcus )、明串珠菌属(Leuconostoc )，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长[2]。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸和肤等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸(分同型乳酸发酵和异型乳酸发酵)，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，其结果可使培养基pH值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1. 乳酸菌的代谢 微生物的代谢是指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。其中分解代谢过程将复杂的有机物分子通过分解代谢

基因工程1

基因工程的诞生 ?1. 进化论Darwin 2. 细胞学说的建立M. Schleiden and T. Schwann（1839） ?3. 遗传学说的建立1）遗传学说创始G. Merdel 提出独立分配定律（1865） ?2）染色体（chromosome）遗传学说.W. S. Sutton（1903） ?3）基因定位T. H. Morgan 提出连锁定律（1915） ?4）基因载体（gene vector）O. T. Avery，C. M. Macleod and M. McCarty（1944） ?4. 分子生物学 ?1）DNA双螺旋结构的发现Watson and Crick（1953） ?2）DNA复制模式的破解M.Meselson and F. W. Stahl（1958） ?3）中心法则的确立F. Crick(1958) ?4）密码子（codon）破译F.Crick，S. Brenner等多人（1961~1966） ?5. 基因工程创始 ?1）SV和入phage DNA重组P. Berg and H. Boyer（1972） ?2）R6-5 质粒和PSC101的DNA重组S. Cohen（1973） ?3）PSC101和非洲爪蟾核糖体DNA重组S. Cohen and H. Boyer（1973） 1 基因工程的基本概念A 重组DNA技术的基本定义B基因工程的基本定义 C重组DNA技术与基因工程的基本用途D基因工程的基本形式 A 重组DNA技术的基本定义 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 B 基因工程的基本定义（基因工程说的是在脱氧核糖核酸上进行手术）基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 1、分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 2、大规模生产生物活性物质 3、设计、构建生物的新性状甚至新物种 D 基因工程的基本形式 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

乳酸菌

同型乳酸发酵 经EMP途径。同型乳酸发酵(homolactic fermentation)是指嗜酸乳杆菌(L．acidophilus)、德氏乳杆菌(Lnc．delbriikii)等乳酸杆菌利用葡萄糖经糖酵解途径生成乳酸的过程。因为乳酸杆菌大都没有脱羧酶，所以糖酵解途径产生的丙酮酸就不能通过脱羧作用而生成乙醛，只有在乳酸脱氢酶催化作用下(需要辅酶I)，以丙酮酸作为受氢体，发生还原反应而生成乳酸。 由此可以得出，葡萄糖经同型乳酸发酵的总反应式为： C6 H 12O6+2ADP+2Pi——+2CH3CH(OH)COOH+2ATP 1分子葡萄糖生成2分子乳酸，理论转化率为100%[1]。 异型乳酸发酵 经HMP途径。 异型乳酸发酵(heterolactic fermentation)除生成乳酸外还生成CO2和乙醇或乙酸。其 生物合成途径也有两种：6-磷酸葡萄糖酸途径和双歧(bifidus)途径，前者的代表菌株有肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及葡聚糖明串珠菌(L．dextranicum)，后者代表菌株为双歧杆菌(Bi fidobacterium bifidum)。 异型乳酸发酵 葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphoglu-conate)后，在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (6-phosphogluconate dehydrogenase)作用转化为5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate)， 经5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶(ribulose-5-phosphate-3-epimerase)的差向异构作用生成5-磷酸木酮糖(xylulose-5-phosphate)，5-磷酸木酮糖在磷酸酮解酶(phosphor01ysis ketonase)的催化作用下可分解为乙酰磷酸(acetyl phosphate) 和3-磷酸甘油醛。前者经磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase)作用转化为乙酰CoA，再经乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase)和乙醇脱氢酶(aclhoi dehydrogenase)作用最终生成乙醇；后者经EMP途 径生成丙酮酸，在乳酸脱氢酶的催化作用下转化为乳酸。通过6-磷酸葡萄糖酸异型乳酸发 酵途径，1分子葡萄糖最终可转化为1分子乳酸和1分子乙醇，从而得出乳酸对糖的理论转化率为50%[1]。 双歧杆菌发酵 经HK途径—磷酸己糖解酮酶途径。 反应在厌氧条件下进行，反应过程中不发生脱氢反应，1分子葡萄糖经双歧反应途径 最终转化为1分子乳酸和1.5分子乙酸，乳酸对糖的理论转化率为50%；途径中有两个磷 酸酮解酶参与，即6-磷酸果糖酮解酶(6-phosphofructokinase ketonase)和5-磷酸木酮糖磷酸酮解酶(xylulose-5-phosphorolysis ketonase)[1]。 乳酸菌、玉米的胚、马铃薯块茎、甜菜块根和骨骼肌等。 凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。 大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，

专题一、基因工程知识点归纳

专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程 序四个步骤；基因工程在农业和医疗等方面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因； 利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个方面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二

酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA 聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。 ②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性内切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分内容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习内容，不能仅仅着眼于记住这几 个条件，而应该深入思考每一个条件的内涵， 通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些 条件才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链

乳酸菌维持肠道菌群的微生态平衡

乳酸菌维持肠道菌群的微生态平衡 乳酸菌表面有能与肠粘膜细胞牢固结合的特异性物质，推测可能是脂磷壁酸或肽聚糖，或细胞蛋白，或者其中二者，或三者全部。这些特异性物质被称为粘附素，乳酸菌通过粘附素与肠粘膜紧密结合，在肠粘膜表面定植占位，是形成生理屏障的主要组成部分。该屏障可以抵御外来细菌的入侵，维持肠道内微生态平衡。定植后的乳酸菌在体内发酵乳糖，产生大量的乳酸、乙酸等有机酸，使肠道pH值降低。肠内处于酸性环境，对志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等致病菌有拮抗作用。低pH值有利于肠道蠕动，维持正常生理功能，阻止致病菌的定植。嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌产生的H2O2能抑制葡萄球菌等致病菌的生长。双歧杆菌和某些乳杆菌产生的孢外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖，由于这些糖是致病菌素的潜在受体，所以通过酶的作用，将其分解，阻止致病菌毒素对上皮细胞的粘附。不少乳酸菌产生细菌素如乳酸毒素、双歧杆毒素，对葡萄球菌、棱状芽孢杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌有拮抗作用。此外双歧杆菌还可将结合的胆酸分解为游离胆酸，游离胆酸对致病菌也有一定的抑制作用。 易位是肠道微生态失衡的主要原因之一，易位有纵向转移和横向转移，纵向转移是指正常菌群由原位向周围转移，横向转移是指正常菌群由原位向组织的不同层次转移[3]。正常情况下，只有少量的细菌发生纵向或横向转移，但在原籍菌的生物拮抗和宿主的免疫机制的作用下，不会引起微生态失衡。如果机体免疫功能下降，或者是滥用抗生素，使常驻菌的定植抗力下降，菌群的平衡失调，使致病菌大量繁殖、增生，并不断向周围扩散，使转移的数量过大，易位成为可能，一旦易位发生，微生物屏障就遭受破坏、导致体内微生态平衡的失调、紊乱从而引起疾病发生。易位的另一种情况是，有些细菌在正常情况下对人体是有益的，易位后反而成了致病菌——机会致病菌，对人体有害。如肠球菌在肠道和口腔部位是正常菌群，但由于菌群失衡或宿主免疫功能下降，该菌可通过粘膜渗透，易位（纵向转移）于心脏、脑、尿道、胆道等部位则可分别引起心内膜炎、脑膜炎、尿道炎及胆道炎等疾病。 乳酸菌可防止肠道菌群发生易位，其作用机理有以下几个途径。第一，乳酸菌直接参与构成肠道定植抗力，阻止病原菌的定植和入侵；第二，对肠道有营养作

乳酸菌菌种的分离筛选办法

精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶

钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

乳酸菌抗菌机理

乳酸菌抗菌机理 乳酸菌的抗菌机理涉及其产生的各种代谢产物，包括酸性物质、乳酸菌素、二氧化碳和过氧化氢等。其中酸性物质可以消耗大量细胞能量并影响细胞膜的稳定性；乳酸菌素可作用于细胞膜，造成膜内物质和能量的泄漏。 乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，在自然界和食物中广泛存在。乳酸菌是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一，早在公元前6000年，人们就懂得利用乳酸菌发酵食物。他们发现食物经过一定的处理和储存就可改善风味、延长储存期和增加食物的安全性。迄今人们已明确了许多乳酸菌在生产安全优质食品中所起重要作用的生物学机理[1～2]:乳酸菌可以发酵食物中碳水化合物，分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，来抑制一些腐败菌或致病菌的生长及改善食品的品质和风味，同时经过发酵，乳酸菌可以增加食品的可消化性并产生一些维生素、抗氧化剂。近几年，乳酸菌抑制食品中一些腐败菌和致病菌的作用引起人们的极大关注。虽然现代生物技术和安全体系(如HACCP)已被普遍的引入食品加工行业，但食品的安全问题仍然威胁着人类，每年都有许多关于食物中毒和食源性疾病散发或爆发的报道，同时，人们正力图追求不含化学防腐剂及各种添加剂的天然的安全食品。解决这问题需要发展新的食品保鲜技术来控制食品中腐败菌和致病菌的生长。国内外学者对之开展了大量的研究并建立了许多方法，其中最引人注目的就是利用乳酸菌来加强食品安全性和延长储存期。

1乳酸菌产生的酸性物质及其抑菌作用 1.1乳酸菌产生的酸性物质乳酸菌可产生对食品中微生物具有抑制作用的酸性物质，主要是乳酸菌的代谢终产物及中间产物，包括乳酸、乙酸、乙醇等。 1.2酸性物质对食品微生物的抑制作用一般细菌生长的最适pH 值为6～7，若低于该值，细菌的生长速率将大大降低或不生长甚至死亡，这在腐败性微生物上尤为可见。乳酸菌产生的酸性物质对食品中微生物的抑制作用已在许多实验中得到证实，这种抑菌作用取决于3个相互影响的因素:1.介质的pH值； 2.酸的离解程度； 3.酸的种类。 从20世纪70～80年代，国内外学者就开始建立pH值对食品中各种腐败菌和致病菌抑制作用的预测模型。但在这些模型中都是用无机酸如盐酸、磷酸来降低pH值，而乳酸菌产生的多是一些含羧基的弱有机酸。只有未离解的弱有机酸进入细菌细胞才能有效的发挥抑菌作用。这些有机酸的离解度取决于其pKa和pH值，可以用Henderson-Hasselbach公式计算:pH=pKa+log([A-] / [HA])。从中不难看出介质的pH值影响酸的离解，若在pH值固定条件下酸的pKa决定了其离解度。因此乳酸菌产生的弱酸的抗菌能力取决于介质的pH值及酸的种类(pKa)。由于胞质的pH值相对较高，当非离解的酸通过细胞膜进入胞质，就发生离解使细胞质酸化并释放酸性阴离子。这就给微生物带来两种后果:首先，若微生物要维持其胞内的pH值，就得动用ATP酶来清除质子，这将消耗大量细胞能量，加重细胞的代谢负担；其次，细胞内阴性酸离子的积聚可影响细胞膜的稳定性并抑制其传递

基因工程

酵母菌的表达系统 生物工程一班 覃懿 学号：200810902058 内容摘要： 基因表达式是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术至北大的各种的目的基因的重组蛋白质，在分析基因表达的调控、基因结构与功能、基因治疗已经生物制药的领域均取得了令人阵风的成果。其中酵母表达系统拥有转录有加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外援蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。 关键词：酵母菌、表达、基因、系统 酵母的生长代谢特征与大肠杆菌有许多像是之处，但在基因表达调控模式尤其是转录水平上与原核细菌有着本质的区别，因此酵母菌是研究真核生物表达调控的理想模型。外源基因在酵母中高效表达的关键是选择高强度的启动子，改变受体细胞基因基底水平转录的控制系统。下面主要以酿酒酵母为例做阐述。 0．酵母菌表达体统的特点 首先酵母是真核生物，毒性比细菌小；其次酵母繁殖速度快，能进行高密度培养，并且能够耐受较高的流体净压，因此，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力；第三，酵母菌表达的外源蛋白可分泌到细胞外并可以使某些蛋白质糖基化而更加稳定，便于产品的分离纯化；第四，酵母菌（主要是酿酒酵母）的分子生物学研究已取得重大进展，已完成了基因组DNA的序列分析，它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，因此，酵母作为基因工程的表达系统特别是在大分子真核生物基因表达方面得到日益广泛的应用]。自从Hitzeman等在1981年用酵母细胞表达人干扰素基因获得成功后，随后又成功地表达了其它多种原核和真核生物的基因[124]。 但是酵母表达系统也有其局限性。由于表达的外源蛋白的聚合体存在而影响产率；由于信号肽加工不完全、内部降解等因素造成表达产物结构上有差异的现象，即表达产物不均一现象，为酵母表达基因工程产物的纯化和工业化生产带来了困难。 1．酵母菌启动子的基本特征与选择 用于启动转录蛋白质的结构基因的酵母菌II型子有基本区域和调控区域两部分组成，基

乳酸菌检测国标方法

乳酸菌检测方法 1 适用范围 本方法适用于清谷田园食品有限公司系列产品及原料中的乳酸菌的检测。 2 设备和仪器 2.1 恒温培养箱：36±1℃ 2.2 天平：感量为0.01g 2.3 无菌吸管：1 ml、2ml、10ml 2.4 无菌锥形瓶：500ml 2.5 无菌培养皿：直径为90mm 2.6 无菌试管：18×180mm 2.9 酒精灯 2.10 立式蒸汽压力灭菌器 2.11 超净工作台 2.12 厌氧缸 3试剂 3.1 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。 3.2 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基 3.2.1 成分蛋白胨 10.0g 牛肉粉 5.0g 酵母粉 4.0g 葡萄糖 20.0g 吐温80 1.0mL K2HPO4.7H2O 2.0g 醋酸钠.3H2O 5.0g 柠檬酸三铵 2.0g

MnSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.05g 琼脂粉 15g 3.2.2制法：将上述成分加于1000mL蒸馏水中，调节PH至6.2±0.2，加热煮沸溶解，分装于锥形瓶中，在121℃高压灭菌15-20min。 3.3莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS 培养基： 3.3.1 莫匹罗星锂盐储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。 3.3.2 半胱氨酸盐酸盐储备液制备：称取250mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL 蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。 3.3.3 制法 将A.1.1 成分加入到950 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48 ℃，用带有0.22 mm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50 mg/mL，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500 mg/mL。 3.4 MC培养基 3.4.1 成分

乳酸菌研究进展

乳酸菌研究进展 摘要:本文对乳酸菌、乳酸菌的应用、乳酸菌菌剂真空冷冻干燥技术、冻干保护剂等多方面进行了阐述。 关键词: 乳酸菌；应用；发酵剂；真空冷冻干燥 1. 前言 早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。到目前为止，人们利用乳酸菌的乳酸发酵，制作泡菜[1]、酸菜、乳酪、酸奶等食品。另外青贮饲料经乳酸发酵后可增加贮藏时间和提高饲料的利用率。在工业上制取乳酸是用淀粉类物质先糖化后，再用乳酸菌进行乳酸发酵生产纯乳酸[2-3]。发酵乳中的乳酸菌有预防肠癌、降低血液胆固醇含量、提高系统免疫功能、减轻过敏反应和防止糖尿病等功能[1-3]。由于乳酸菌所具有的营养、健康的特殊功效，使其风靡欧、美、日、韩等市场，并被广泛应用于乳制品、饮料、肉制品、保健食品等食品及预防医学领域[4-6]。 泡菜产业是我国传统发酵食品中对国民经济具有重要贡献的产业之一。但我国泡菜企业长期沿用自然菌发酵，企业规模小，泡菜生产周期长，产品质量不稳定，食用安全性差。这些问题严重影响和制约了我国泡菜产业的发展。采用现代生物技术，开发泡菜发酵专用复合菌粉生物技术产品，对改造我国传统泡菜产业具有非常重要的现实意义。直投式泡菜发酵专用复合菌粉产品，是泡菜工业化生产的专用发酵剂，但目前市场上还没有见到该产品销售。直投式泡菜发酵专用复合冻干菌粉产品的使用，可以保证泡菜的产品质量，极大地缩短泡菜的发酵时间，提高泡菜的产量和质量。 2. 乳酸菌 2.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是指在代谢过程中能产生乳酸的细菌的总称。其中能进行乳酸发酵的大部分是细菌，有些为球菌、有些为杆菌，一般都不会运动。 常见的球形乳酸菌主要有：链球菌属将糖类经双磷酸已糖途径分解产生右旋乳酸，属正型乳酸发酵。多见于动物及动物性制品上；明串珠菌属将糖经单磷酸己糖途径分解产生左旋乳酸及乙醇等物质，属异型乳酸发酵。多见于植物体及植物制品之上；片球菌属将糖类经双磷酸己糖途径分解产生混旋的乳配。多数生活在植物及其制品上。 常见的杆形乳酸菌是乳杆菌属，约有20多种，有些种类产生右旋乳酸、也有产生左旋和混旋的乳酸，动、植物及其制品上均可找到它们。 2.2 乳酸菌特殊生活特点 乳酸菌具有强抗酸能力，大部分乳酸菌还具有很强的抗盐性，都能耐5％以

基因工程知识点超全

基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。

（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。

2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的

酵母基因工程

酵母基因工程 一酵母基因工程的发展现状 1.酿酒酵母自身的改造 （1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 （2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母 （3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母 （4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达 （5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母 2酵母表达异源蛋白 （1）表达水平 （2）表达质量 2酵母基因工程的发展趋势 （1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷 （2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向 （3）利用酵母基因工程筛选更多新药 （4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 （5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注 3发展历程 1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补 了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母 全基因组的测序。 二．酵母基因工程的优点 1.安全无毒，不致病； 2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3.容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率； 4.培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能 三．酵母表达系统 （1）酵母表达载体 ①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。 原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。 酵母部分： 1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)； 整合型载体的整合介导区。 2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列 3基因启动子和终止子序列 4信号肽序列