亚磷酸钙CaHPO3

昆 山 联 雄 工 业 材 料 有 限 公 司

----------------------------------------------------------------------------------------- 检 验 分 析 报 告 单

Certificate of Analysis

项 目 Item 标 准 值 Standard 实 测 值

Road-Test standard

CaO 含量

40.5±0.5% 40.51 P 2O 3含量

39.5±0.5% 39.58 游离水含量

≤1% 0.23 PH 值

6--8 6.8 筛余物（325目）

≤0.2% 0.08 外 观

白色细小结晶性粉末 白色细小结晶性粉末

结论Conclusion

合格Pass

备注 Note:

自固化磷酸钙人工骨修补髓室底穿孔的疗效研究

自固化磷酸钙人工骨修补髓室底穿孔的疗效研究 摘要】在临床上由于医源性或病源性继发的患牙髓室底穿孔导致患牙的保留与 拔除常常让医务人员感到比较棘手。一种理想的修补材料使得患牙得以保存是每 位患者和医务人员的愿望。 【中图分类号】R783 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）21-0377-02 我科自2008年来运用自固化磷酸钙人工骨修补各种原因发生的髓室底穿孔，取得了较好效果，现报告如下： 一、材料与方法 1、病例选择我科门诊收治的髓室底穿孔的患牙共70例，其中牙体牙髓病继 发穿孔占45例，医源性穿孔占25例，穿孔直径大于3mm者17例，小于3mm 者53例。 2、材料自因化磷酸钙（上海瑞邦生物材料有限公司，商品名瑞邦骨泰） 3、方法所有患牙常规开髓后进行根管预备。在局麻下刮除髓室底穿孔区和 根分叉处的病变组织，穿孔区用双氧水、盐水交替冲洗，用含肾上腺素的棉球压 迫止血，必要时用碘伏棉球封一周，等患牙无自觉症状，无明显叩痛后完成根管 充填。取适量自固化磷酸钙粉剂和固化剂进行调和成面团状，然后充填于穿孔区，轻轻加压等其固化，磷酸锌水门订垫底银汞合金充填。拍牙片以备复查对照，治 疗后随访3年。 4、疗效评价 成功：治疗后无症状，牙周组织无红肿、痿道，患牙无松动、叩痛，X线牙 片显示分叉区破坏牙槽骨有骨样组织沉积。 好转：患牙无症状，无松动。叩痛，无痿道；牙周组织健康，X线牙片示穿 孔区阴影缩小。 失败：治疗后出现肿痛，患牙叩痛、松动，痿道形成，X线示穿孔区阴影无 变化或有扩大趋势。 成功、好转病例均为有效病例。 二、结果 1、临床分析 穿孔直径大小对修补效果的影响 穿孔直径病例数成功好转失败 <3mm 53 48 3 2 >3mm 17 8 6 2 x2=3.08 p<0.05 所致穿孔的原因对修补效果的影响 病因病例数成功好转失败 医源性穿孔 25 21 4 0 继发性穿孔 45 31 8 6 x2=2.38 p<0.05 2、结果 在上述图表中用自固化磷酸钙修补髓室底穿孔的病例中，有效者达64例， 失败6例，有效率达90%：其中穿孔直径小于3mm，有效率较高达95%；穿孔直径大于3mm者，有效率达77%，两组疗效差异有显著性（p<0.05）；医源性意外穿孔15例，有效率达100%，而牙体牙髓病继发穿孔者45例，有效38例，占

磷酸钙法细胞转染试剂盒

磷酸钙法细胞转染试剂盒 简介： 外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。HEK293是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达85%以上，一般的转染效率可达40～50%左右。其他常见细胞(例如Hela 、CHO 细胞等)也适合磷酸钙法转染，但效率比293细胞要略低一些。 本转染试剂盒主要适合于大多数贴壁细胞的转染，也可于一些悬浮细胞的转染，一般要求DNA 浓度在10～50μg 为宜，Hela 、BALB 等细胞沉淀放置16h ，CHO 、DUKX 、B Ⅱ等细胞可以通过甘油、DMSO 进行热休克处理以提高转染效率。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶消化液 2、 完全培养基 3、 PBS 4、 无菌水 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞转染： 1、 在转染前用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。 2、 在加入DNA 之，加入不含抗生素的完全培养液，置于CO 2培养箱培养。 3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 编号 名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃ 使用说明书 1份

中药口服配合载抗生素自固化磷酸钙人工骨植入治疗慢性骨髓炎的临床研究

目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 英文缩略词 (3) 前言 (5) 临床资料 (7) 1研究对象 (7) 1.1病例来源 (7) 1.2受试者权益保障及知情同意书 (7) 1.3诊断标准 (7) 1.3.1中医诊断标准 (7) 1.3.2中医症候诊断标准 (7) 1.3.2西医诊断标准 (7) 1.4纳入标准 (8) 1.5排除标准 (8) 1.6剔除标准 (8) 1.7脱落标准 (9) 1.8病例分组 (9) 2患者一般资料比较 (9) 2.1两组患者性别分布情况比较 (9) 2.2两组患者年龄比较 (9) 2.3两组患者病程比较 (9) 2.4两组患者病变部位情况比较 (10) 2.5两组患者窦道分泌物细菌培养情况比较 (10) 研究方法 (11) l药物 (11) 1.1中药经验方 (11) 1.2自固化磷酸钙人工骨 (11) 1.3抗生素 (11)

2治疗方法 (11) 2.1术前准备 (11) 2.2西医综合治疗方法 (11) 2.2.1全身抗生素治疗 (11) 2.2.2病灶清除术 (12) 2.2.3外固定的应用 (12) 2.2.4载万古霉素自固化磷酸钙人工骨植入 (12) 2.3研究方法 (12) 2.4术后治疗 (13) 2.5随访 (13) 3疗效评价标准 (13) 4观察指标 (13) 4.1安全性指标 (13) 4.2总有效率 (13) 4.3创面感染控制情况 (14) 4.4疗效性指标 (14) 4.5复发率 (14) 5统计学分析处理 (14) 结果 (15) 1总体疗效观察结果比较 (15) 1.1两组患者总有效率的比较 (15) 1.2两组患者复发率的比较 (15) 1.3两组患者创面感染控制情况比较 (15) 2疗效性观察指标结果比较 (15) 2.1两组患者术前及术后4周WBC、N的比较 (15) 2.2两组患者术前及术后4周HGB、RBC的比较 (16) 2.3两组患者治疗前后血沉（ESR）的比较 (16) 2.4两组患者治疗前后C-反应蛋白（CRP）的比较 (17) 3安全性观察指标结果比较 (17)

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

磷酸钙转染法

磷酸钙转染法 材料： 质粒DNA 指数生长的真核细胞 2 M CaCl2 2×HBS （pH 7.05） 配方: 2×HBS (pH7.05)：900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g和HEPES 10 g，调pH至7.05，定容至1 升，过滤（0.2μm 滤膜）后储存于4℃备用。 方法： 1. 细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40~70％）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8~24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2 h换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。 注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。 2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500μl 反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。将等体积2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置 2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。 注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。 3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％CO2的37℃温箱孵育。8 h后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，16-40 h观察其转染效率。

真核细胞转染操作方法

一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。 利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途： (1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。 (2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。 (3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的 情况。 (5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。 (6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列 得到表达。 (7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。 进行真核转染的一般程序： 克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建：

转化和转染

转染和转化的区别 转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。 基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。 载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。 转化:指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 基因转染 基因转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，

各种转染方法比较

各种转染方法比较 转染方法原理主要应 用 特点主要的厂家及产品 DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成 的复合物被细胞内吞 瞬时转 染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细 胞有一定的毒副作用,转染时需除血 清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) DNA复合物吸附细胞膜稳定转 染,染瞬 转染 不适用于原代细胞（所需的DNA浓 度较高）,操作简便但重复性差,有些 细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心，转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL，Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的 磷酸基团形成复合物，然后脂质 体上剩余的电核与细胞膜上的唾 液酸残基的负电核结合；另一种 解释是通过细胞是内吞作用而被 进入细胞。(若DNA浓度过高， 中和脂质体表面电核，而降低了 与细胞的结合能力) 稳定转 染,瞬时 转染,所 有细胞 使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或 RNA，能转染各种类型的细胞，没 有免疫原性。虽在体外基因转染中 有很高的效率，但在体内，能被血 清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒 性，这在很大程度上限制了其应用 Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine， Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin） Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE 6） CPG Biotech Co（GeneLimo Plus，GeneLimo Super） Promega（Transfast，Tfx， Transfectam）

RNA干扰载体的构建的实验经过流程

RNA干扰载体的构建的实验流程 RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA 干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。 产品技术背景 pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。插入寡核苷酸设计

pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。 1. 选择干扰序列 在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列： 推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。 RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。 RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。

慢病毒包装、纯化、滴度测定和感染

慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 包装 1. 包装细胞 Lenti-X? Lentiviral Expression SystemsUser Manual.pdf (P11) ; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdP16) 2. 病毒载体及包装质粒 病毒载体：DNA组构建及中量提取； 包装质粒：商品化产品(Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf ( P12 ) ; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17))或DNA中量提取(目前唯一使用来源)； 3. 细胞转染 方法一： Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf( P12); Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdfP17)； 方法二： 按照Lipofectami ne? LTX & Plus Reage nt (Cat.No.15338,i nvitroge n)进行，简要中文说明如下： a. 转染前24小时，把4七x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80-90%; b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基； c. 用之前充分混匀PLUS Reagen，在EP管中加入15ug的DNA 混合物(pLVX- shRNA Plasmid DNA : pMDLg : pRes-Rev: pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul 的PLUS Reagen，用Opti-MEM 定容到500ul,标记为Tube 1,温和混匀，室温孵育5分钟； d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul 的Mix Lipofectamine LTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2,温和混匀; e.将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟; Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX)

脂质体转染原理步骤

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。 293T细胞 MyoD表达质粒和EGFP表达质粒 DMEM培养基 链霉素/青霉素（双抗）

PBS（磷酸盐缓冲溶液） 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 35mm培养皿 转染管 细胞传代 (2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 (5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 细胞转染 1）转染试剂的准备 2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂， 再次震荡。 7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 第二次细胞传代 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度

细胞转染实验

细胞转染实验 1．实验目的 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。 2．实验原理 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体 Transfect

介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。 上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。 3. 实验材料与器材 1）材料 293T细胞

MyoD表达质粒和EGFP表达质粒DMEM培养基 链霉素/青霉素（双抗） FCS（小牛血清） PBS（磷酸盐缓冲溶液） 胰酶/EDTA消化液 转染试剂（TransFast） 2）器材 20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 恒温水浴箱 台式离心机 35mm培养皿 转染管 15ml离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和CCD 4. 实验步骤

磷酸钙转染法制备慢病毒的protocol

磷酸钙转染法制备慢病毒的protocol Production of lentivirus by Calcium phosphate in 293T cells This protocol was adapted for 10 cm dish. Day 1: HEK293T plating Plate 2.5~3×106cells/10 cm dish in DMEM+10%FBS(+1% L- Glutamine) Day 2: Transfection There will be around 70% confluence. Two hours before transfection, replace the medium with 10 ml fresh medium preheated at 37℃. For each 10 cm dish, prepare the following transfection mix: 10.0 ug GFP(or other plasmd of interest) 10.5 ug pLP1 10.5 ug pLP2 9.0 ug pVSVG. Then add in this order: 293.3 ul of TE buffer (0.1×, pH 8.8) 155.6 ul d.d.water 50.2 ul CaCl2(2.5M)Briefly mix, then add 500 ul 2×HBS, dropwise under agitation by vortexing at least 1~2min. Wait at least 5min(no more than 30min) at RT. Add dropwise 1ml/10cm dish of the precipitate, and mix gently by rotating the plate. Day 3: Observe the cells and change the media Observe the cells. They should be reaching confluency. If a visible marker (such as GFP) is present in the lentivector plasmid, transfection efficiency may be assessed visually. Ideally, transfection efficiency should be >90%.Remove medium around14~16h post-transfection and put ≈ 8ml/dish of fresh pre-heated medium. Day 4: Collect first harvest of supernatant Collect and pool supernatant (8 ml/dish) from dishes at 48 h post-transfection and store at -80℃. Add 8ml of fresh DMEM +10% FBS +1% L-Glutamine to each dish. Incubate dishes at 5% CO2, 37 °C overnight. Day 5: Collect second harvest of supernatant Collect supernatant from dishes (8ml/dish) at 72 h post- transfection. Pool supernatant from first and second harvests. Centrifuge at 3000 × g for 15 minutes at 4℃to remove cells and cell debris.

基因工程名词解释

基因工程：对不同生物的遗传物质－基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并便所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。 细胞工程：包括细胞融合、细胞大规模培养以及植物组织培养快速繁殖技术。 酶工程：包括酶的生产应用、酶和细胞的固定化以及酶的分子修饰技术。就是在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用将相应的原料转化成有用物质的技术。 发酵(微生物)工程：包括菌种选育、菌体生产利用、代谢产物的生产利用以及微生物机能的利用技术。发酵工程是利用微生物的特定性状，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业生产的一种技术体系。 蛋白质工程：它是通过对蛋白质分子结构的合理设计，再通过基因工程的手段，改变基因的 核苷酸序列以达到改变基因产物―蛋白质的目的，生产出具有更高生物活性或全新的、具有 独特活性的蛋白质。 生化工程：包括生物反应器设计制造、传感器的研制以及产物的分离提取和精制技术。 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 广义的基因工程定义为 DNA重组技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。几乎存在于任何一种原核细菌中。 同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶 同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶 同尾酶（Isocandamers）：识别位点不同，但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。 1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。 Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性:限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，降低酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星活性 克隆载体(cloning vector)：是指用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。 穿梭载体：人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种生物内进行来回的穿梭。 多克隆位点区MCS：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。 质粒（Plasmid）：是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体 DNA 而自主复制的共价、闭合、环状DNA 分子（Covalently Closed Circular DNA）也称为cccDNA， 一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。 据拷贝数将质粒分为两种复制型： 严紧型质粒（拷贝数为1-3）和松弛型质粒（拷贝数为10-200）。 具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称为质粒的不相容性。 α-互补(α-complementation)是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互补，从而产生具有β-半乳糖苷酶学活性的蛋白，这种现象就称为α-互补。 插入失活(insertional inactivation) 在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。 性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）。 融合基因(fusion gene):是指应用DNA体外重组技术,构建的一类含两个或两个以上的不同基因序列的杂合基因。 融合蛋白(fusion protein):是指通过将两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起并通过表达而形成的杂合蛋白。 开放阅读框 (open reading frame，ORF)：起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 核酸分子杂交：是指核酸分子(DNA或RNA)变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。 核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、southern印迹杂交和Nothern印迹杂交四类。寡核苷酸探针：是人工合成且被适当标记的由短链核苷