基因工程知识点

基因工程

一、基因工程的概念

1、所用技术:体外DNA重组技术和转基因技术

2、操作水平:DNA分子水平

3、优点:定向改变生物性状;打破生物生殖隔离的界限

二、基因工程的基本工具:限制性内切酶、DNA连接酶和载体

1、限制酶

(1)来源:主要是原核生物

(2)作用:能够识别双链DNA分子特定的核苷酸序列,并从特定部位切开两个核苷酸之间磷酸二酯键。

作用特点:特异性地识别和切割DNA

(3)产物:黏性末端和平末端

2、DNA连接酶

(1)作用:将双链DNA片断“缝合”起来,恢复磷酸二酯键。

(2)种类E·coliDNA连接酶:连接黏性末端

T4DNA连接酶:连接黏性末端和平末端

注意:(1)DNA水解酶:能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸,彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基

(2)DNA解旋酶:能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链,作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意:在适当的高温(如94℃)、重金属盐的作用下,也可使DNA解旋。

(3)DNA聚合酶:能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。

(4)DNA连接酶:是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。

3、载体

(1)种类:质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。

质粒(最常用):常存在于原核细胞和酵母菌中,小型环状DNA分子,位于拟核DNA 之外,具有自我复制能力

上有固氮基因,抗药性基因等。

(2)运载体使用的目的:①是用它做运载工具,将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

(3)必备条件:能在宿主细胞内复制并稳定保存

有一到多个限制酶切点

具有标记基因(用于重组DNA的鉴定和选择)

三、基因工程操作程序:目的基因的获取;基因表达载体的构建;目的基因导入受体细胞;目的基因的检测与鉴定。

1、目的基因的获取

直接从细胞分离基因组文库

(从基因文库获取)部分基因文库:如:CDNA 文库mRNA DNA

人工合成:适合分子较小,碱基序列已知的DNA分子

目的基因扩增:PCR技术

注:①CDNA文库是以mRNA为模板反转录形成DNA分子,特点是不含启动子和内含子②PCR与DNA的自我复制的区别

PCR DNA的自我复制

加热解旋DNA解旋酶

两种DNA引物两种RNA引物热稳定DNA聚合酶(Taq)酶DNA聚合酶

2、基因表达载体的构建(核心)

目的:有利于目的基因在受体细胞中稳定存在,并遗传给下一代,且表达和发挥作用(1)、步骤

①用相同的限制酶切割质粒和目的基因

②用DNA连接酶连接,使质粒和目的基因结合成重组质粒(DNA分子两两连接,会出现三种连接产物:载体-载体;载体-目的基因;目的基因-目的基因)

(2)、组成:目的基因、标记基因、启动子、终止子

(启动子:RNA聚合酶识别和结合位点;终止子:转录的终止)

3、目的基因导入受体细胞(称为转化)

①导入植物(受体细胞可为体细胞或受精卵):、

农杆菌转化法:双子、裸子植物

方法:基因枪法:单子叶植物

花粉管通道法(我国自创)

注:①植物的体细胞具有全能性②Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞,并且整合到受体细胞的染色体DNA上

②导入动物(受体细胞可为受精卵或胚胎干细胞):显微注射法

注:受精卵具有最高的全能性,且体积大,易操作,含有丰富的营养物质

③导入微生物:感受态细胞法(C a2+处理:目的增大细胞的通透性,吸收周围的DNA分子)注:微生物能做为受体细胞的原因是繁殖快,多为单细胞,遗传物质相对少)

4、目的基因检测与鉴定

分子水平检测DNA分子杂交(是否导入)

(原理:分子杂交)DNA分子杂交(是否转录)

抗原与抗体分子杂交(是否翻译)

个体生物水平的鉴定

注:DNA分子探针是用放射性元素标记的目的基因

抗虫基因能在植物体内成功表达是因为抗虫基因和植物的DNA双螺旋结构相同。说明生物共用一套遗传密码。

四、应用

1、植物基因工程

用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因,从苏云金芽孢杆菌中分离,Bt毒蛋白基因控制合成的蛋白质可降解成相对分子质量比较小的,有毒的多肽。

2、动物基因工程

乳腺生物反应器:将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。

3、基因治疗体外基因治疗:效果更稳定

体内基因治疗

(用腺病毒做为载体)

五、蛋白质工程

过程:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→合成基因

特点:生产自然界没有的蛋白质

实质:是对基因的改造

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