外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离
(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)
免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细
胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)
的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque) 分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】
血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll) 和泛影葡胺(Hypaque)按一定比例混合制成，20C密度为 1.077 士0.001，单个核细胞包括淋巴细胞
和单核细胞，其密度为 1.050?1.077，而粒细胞和红细胞的密度为 1.080?1.110。将待分离的
细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与
粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】
1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077 士0.001。
2.5g/L 台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank's液配制。
4.Hank s 液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】
1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank's 液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血
液与分层液的容积比例以2：1?3 ：1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min 离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、
血浆层(含血小板和破碎细胞)。
5.用滴管直接吸岀单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。
6.加入4倍量以上的Hank's液，充分混匀，1000r /min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。
7.用含10%?20%灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。
【结果判断】
【注意事项】
1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。
2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18?25C)下进
行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细
胞活性。
3.分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速度在2000?2500r/min，离心时间为
15?20min，离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间，若淋巴细
胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。
4.分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
5.将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。
6.充分冼涤分离后的单核细胞，可除去大部分混杂的血小板。
【应用与评价】
本方法操作简便、稳定。细胞回收率达80%?90%单个核细胞纯度可达95%淋巴细胞约占90%?95%细胞活力可达95%以上。但其中仍可混杂少量（约10%）其它细胞。
该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞（主要是淋巴细胞）悬液已能满
足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。故在细胞免疫试验
中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。
【思考题】
1.为何常用密度为1.077 土0.001的分层液分离人单个核细胞？
2.利用密度梯度离心法分离人单个细胞，为何要将血液样品进行适当稀释，并要叠加于分层液上?
外周血单个核细胞的分离一密度梯度离心法
、原理
根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过
离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在 1.075?1.090 之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于 1.090。因此，若用比重为1.077 士0.001的分离液则可
通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。
、器材与试剂
器材:
（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量
移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸
试剂：
（1）抗凝全血（临时抽取）、 40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，
比重：1.077 士 0.001 ）（ 3） Hanks 液（4）白细胞稀释液（5） 0.5%锥兰生理盐水溶液
三、操作步骤
在已含1ml 抗凝全血的试管内加入 1ml Hanks 液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有
1ml 淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。
将该试管置水平式离心机中离心（ 2000rpm ） 20分钟。
用计数板在显微镜下计数 40倍稀释的全血， 计算岀其中的白细胞总数 （/ml ）及单个核细胞
总数（/ml ）。
离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图:
—稀释的血液
fftff 的血浆
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*一单个核細胞
1,076 UNO
—分离液LO77
* -- 粒细胞1肿1
J --- 红细胞「冋
用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸岀界面层细胞，移入刻度离
心管内。
在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（lOOOrpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2次。
用0.5ml Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。
取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，
计算岀白细胞总数（/ml ）及单个核细胞数（/ml ）。
检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100?200个单个核细胞中着色的死细胞数。
四、操作注意事项
注意分离液与稀释血的比例，一般以1:2?1:3为宜。
分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定
加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果
做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低
五、实验结果记录与分析
通过前后两次细胞计数:
计算细胞回收率（%）
分离后单个核细胞总数X 100%
分离前单个核细胞总数
计算单个核细胞纯度（%）
分离后单个核细胞总数x 100%
分离后白细胞总数
计算细胞活力（%
分离后活细胞数X 100%
分离后细胞总数
外周血单个核细胞分离技术:
? 1、采取外周静脉血 3ml，抗凝方法采用玻璃珠摇动法（这样的话血小板不会和PBMC混
的太多）
2、采用3ml N-S或Hanks液做对倍稀释处理，即总体积为6ml
3、取一中试管，加入 2ml的淋巴细胞分离液，尔后，将6ml稀释过的全血小心加到分离液的上表面，尤其在刚开始加的时候，动作一定要慢、轻柔，后面就可以加快速度，最总使得
分离液和血液的比例为 1 : 3,分离液界面保持清楚！
4、离心，2000rpm ，20min，后吸取 PBMC
5、洗涤，将放有 PBMC的离心管用N-S充盈至10ml，混匀，2000rpm，10min，再重复两次，但均为1000rpm ， 10min，即可得到PBMC，加培基后即可保存供实验用！
?用 ficoll 分：
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬
细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑（1）细胞纯度；
（2）细胞获得量；（3）细胞活力；（4）使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
（一）原理：
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077 ±0.001的
聚
蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F / H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为 400,000 ,当密度为1.2g /ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层
液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液
面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
（二）方法：
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量 Hank's 液或 RPMI1640 充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpmX 20分钟。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和 Hank's 液，下层主要为红细胞和粒细胞。中
层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积
的Hank's液或RPMI1640 , 1500rpmX 10分钟，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有 10％小牛血清的 RPMI1640 ，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴 0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度（细胞数/ 1毫升细胞悬液）=
4 个大方格内细胞总数 X 10 4 X2（稀释倍数）
4
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数 200 个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率= ------------ X100 %
总细胞数
用本法分离PBMC,纯度在90 %以上，收获率可达80?90 %，活细胞百分率在 95 %以上。
（三）试剂和材料 :
比重 1.077±0.001 的聚蔗糖 -泛影葡胺（商品名为淋巴细胞分离液）。
Hank's 液（无 Ca 2+、Mg 2 + ）
10%小牛血清 RPMI1640
0.2 %台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
肝素用 Hank's 液或生理盐水稀释成 500 单位/ ml ，牽 9 凝人外周血肝素用量约为 50 单位/ 1 毫升血。
短中管、毛细滴管、 1 毫升和 10 毫升刻度吸管。
无菌干燥注射器针头。
碘酒， 75 %酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
血球计数板、显微镜、水平式离心机。
（四）注意事项 :
1.抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2.操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3.用淋巴细胞分离液分离 PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4.小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛配制相应密度的Percoll 或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
（五）附录
1.Hank's 液（无 Ca2+、 Mg2+ ）配制法
NaCl 8.0 克
KCl 0.4 克
Na 2 HPO 4 12H 2 O 0.12 克 KH 2 HPO 4 0.06 克
原液:
A 液：0.2M NaH 2 PO4 溶液
NaH 2 PO4
27.6 克
或 NaH 2 PO4 2H 2 O 31.2 克 蒸馏水 溶解至
1000 毫升
B 液：0.2M Ha 2 HPO 4 溶液
Ha 2 HPO 4 12H 2 O
71.6 克
蒸馏水溶解至 1000 毫升
各种不同 PH 值 PB 的配法
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
A 液（ml ） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B 液（ml ） 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
举例： 0.1M PH7.2PB
A 液 28 毫升
B 液
72 毫升
加蒸馏水 100ml
4. 血球保存液 葡萄糖 2.05 克 枸椽酸钠 0.8 克 氯化钠 0.42 克 蒸馏水
100 毫升
将上述成分混匀， 略加温使其溶解， 分装小瓶 （100 毫升）。经10 磅、10分钟高压灭菌。
4C 保存备用。
5. RPMI-1640 培养液：
RPMT-1640（FLOW 公司出品 ）
1 袋
葡萄糖 双蒸水 1 ％酚红液
将上列成分混合后溶化，分装于 临用时调 PH 至7.3?7.6。
2. 细胞分层液配制法 9％聚蔗糖
34％泛影葡胺
混合，测比重为 1.077 ?1.078 ， 3. 磷酸缓冲液
1.0 克 1000 毫克
2 毫克
500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4 C 冰箱保存,
24 份 10％
G5玻璃滤器过滤除菌。4C 冰箱保存备用。
聚蔗糖 -泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
【试剂及配制】 （1）
聚蔗糖 - 泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为 1.077±0.0001。
（2） 台盼蓝染液：称取 4g 台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至
100mI ，1500r/min 离心
15min ，吸取上层液，即为 4%水溶液。用前，用 1.8%氯化钠溶液稀释 1 倍，即为 2%台盼蓝染液。 （ 3 ） HBSS 或 RPMI-1640 液 【操作方法】
（1） 采集静脉血若干 ml （随需要而定），注入盛有肝素的无菌小瓶中（每1ml?全血用0.1ml 125?250U/mI 肝素溶液抗凝 ）,加盖后立即轻轻摇匀 ,使血液抗凝；
（2） 用吸管加入等体积的室温 HBSS 或PBS,使血液等倍稀释，可降低红细胞的凝聚,?提高分离效果（此 步骤亦可省去）；
（ 3） 吸取淋巴细胞分层液 （每 10ml 稀释血加 5ml 分层液 ）置于 15ml 或 50ml 离心管中 ,?然后将离心管倾 斜45。角，将稀释血液在距分层液界面上 1cm 处沿试管壁缓慢加至分层液上面 （亦可将吸管嘴插入离心管底部 将分层液缓慢加在稀释血液的下面 ）,应注意保持两者界面清晰 ,勿使血液混入分层液内；
（4） 将离心管置水平式离心机内，在18 C ?20 C 下，以2, 000r/min 离心20min 。离心后，管内可分为以下 四层 :上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与 血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图
1。
三蒸水
电磁搅拌30分钟：1N HCI 调PH7.2 保存。
不完全 RPMI-1640 培养液 : RPMI-1640 0.1M 丙酮酸钠 0.2M 谷氨酰胺 1M Hepes 1 毫升
7.5 % NaHCO 3 1 毫升 青霉素、链霉素 （各 1 万单位 ） 完全 RPMI-1640 培养液
不完全 1640 培养液 灭活胎牛 （ 或新生牛 ）血清
10 毫升
1000 毫升
-7.4（约加2.5毫升），过滤除菌，作无菌试验，4 C
95 毫升 1 毫升 1 毫升
1 毫升 90 毫升
Ficoll-Hypaque 离心法分离血液成分
(5) 用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸岀灰白色的单个核细胞 ，？盛入另一支离心管中；或先吸 去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞 。既要尽量吸取所有单个核细胞, 又要避免吸取过多的分层液或血浆 ，以免混入其他细胞成分； (6)
将所得到的PBMC 悬液用5倍体积的HBSS 或RPMI-1640洗涤2次,依次以2,000r/min 、1500r/min 在室温下
(18?25C)离心10min,可去掉大部分混杂的血小板； (7)
用完全RPMI-1640定容细胞，计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每
ml?健康成人血可分离出
1 X106
~ 2X106
个单个核细胞；
(8) 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性 ：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5?10min 后取样作湿 片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，一般活性应在95%以上。 【注意事项】 (1) 与血液样品接触时应注意生物安全防护
，避免血源性传染病。
(2) 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。 (3) 细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一
，最适密度在室温下 应为1.077 ±).001g/L;应避光
4 °C
下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用；？使用中应避免细菌污染。 (4)
稀释血液可降低红细胞的凝聚，提高淋巴细胞收获量,?但如果要保留血浆成分作其它实验用时
，则不
能稀释血液，以免影响血浆成分。 (5)
离心时的温度对分离效果亦有影响
，温度过低，离心时间需适当延长，淋巴细胞丢失增多；温度过高，
增加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞活性.离心时最适温度为18?20 C 。 (6) 若从未抗凝血中分离单个核细胞，可先用链激酶溶解血凝块，？然后再按上述方法分离。 (7)
分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。
稀禅的血灌 SOOthyin
in 20mifi
-粒細胞 ■红细胞
轶个桟细胞 稀释的血萦
外周血单个核细胞的分离(优质参考)
实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养 PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 ●工具／原料 全血（以10ml为例） 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基（Invitrogen） 胎牛血清（FBS）（GIBCO） 双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640
人外周血单核细胞分离液使用说明
人外周血单核细胞分离液使用说明 产品内容： 试剂Ａ200mL 试剂D200mL 样本稀释液（赠品）200mL 清洗液（赠品）200mL 保存：18℃-25℃保存，有效期两年。人外周血单核细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 操作步骤： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况： 情况A:稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下： 1.取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A3ml、试剂D2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。 2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为稀释液层。第二层为透明试剂D液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂A液层。第五层为红细胞层。 4.用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离
心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。 5.250g，离心10min。 6.弃上清。 7.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 8.250g，离心10min。 9.重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 10.差异贴壁法纯化细胞 （1）用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 （3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 （4）不贴壁的为淋巴细胞。 注： a)无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。 b)完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。 c)由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。 情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下： 1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。 2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），
各种动物骨髓单核细胞分离液试剂盒
各种动物骨髓单核细胞分离液试剂盒 规格：200ml/kit 保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 试剂盒组成： 试剂A200mL 试剂D200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 操作步骤： 1.制备骨髓的单细胞悬液。 2.取一支无菌离心管，先加入试剂A，再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A：试剂D的体积比为3：2，如细胞悬液的体积小于5ml，则先后加入3ml试剂A和2ml试剂D；如细胞悬液的体积大于5ml，试剂总量与细胞悬液量相等），两种试剂的分层一定要清晰。 3.将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面） 4.室温，水平转子500~800g，离心20~30min（样本的体积越大所需的离 心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需自行摸索，离心转速最大不 超过1000g）。 5.离心后将出现明显的分层：第一层为稀释液层；第二层为白色单核细 胞层；第三层为透明试剂D液层；第四层为半透明试剂A液层；第五层为红细胞层（如图示）。 6.小心吸取第二层乳白色细胞层和第三层试剂D层到另一无菌的15ml离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g，离心10min。 7.弃上清，5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g，离心10min。 稀释液 单核细胞层 试剂D 试剂A 红细胞层分层示意图
8.重复步骤7 9.弃上清，细胞重悬备用。 10.差异贴壁法纯化细胞：用单核细胞培养基以106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，置于细胞培养箱中进行贴壁培养。 1)2~4h内贴壁的为单核细胞。 2)10~24h内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 3)不贴壁的为淋巴细胞。 根据不同细胞的贴壁时间存在差异，以达到简单纯化单核细胞的目的。此法成本低，操作简便。如需获得高纯度的目的细胞则需选用免疫磁珠分选或者是应用流式技术分选细胞。 骨髓单细胞悬液的制备方法 小动物骨髓的采集： 1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。 2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。 3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 大动物骨髓的采集： 大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 常用的骨髓穿刺点： 股骨：穿刺部位在股骨内侧面，靠下端的凹面处； 胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；
人外周血单个核细胞分离液说明书
分离后分离前 水平离心血浆层单个核细胞层分离液层 红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书 货号：P9010/P9011 规格：200mL 产品简介： 本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/mL左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 产品指标： 密度 1.077±0.001g/mL 渗透压 290~350mOsm/kg H2O 无菌 0.1μm 滤膜过滤保存条件： 本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝 均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血 及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2.在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体 积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL， 加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过 离心管的三分之二，否则会影响分离效果）， 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意
保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳 的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白 膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。 5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。 注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物 污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较 低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h以内），为保持单个核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降 低细胞得率及纯度。 E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳 的分离条件。 G.吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增 加；吸取过多的血浆层可能会导致单个核细胞中血浆蛋白及血小板污染。
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L
不同培养基对人外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响
文章编号（Article ID）：1009－2137（2011）04－1010－05·论著· 不同培养基对人外周血单核细胞来源 树突状细胞发育的影响 陈晨，刘元林，梁晓雷，朱恒，李红，吴英，毛宁，张毅 军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室，北京100850 摘要本研究旨在探讨RPMI1640和IMDM两种培养液对诱导人外周血单核细胞向树突状细胞（DC）发育分化的影响。利用GM-CSF+IL-4细胞因子组合，在培养条件一致的前提下，改变培养液种类，通过对成熟、未成熟DC形态观察，用流式细胞术检测细胞表型和吞噬能力、应用混合淋巴细胞反应（MLR）检测其刺激T细胞的增殖能力，用悬浮芯片技术检测DC与同种异体T细胞共培养后上清中所含细胞因子的变化，分析不同培养液对DC功能的影响。研究结果表明，两种培养液培养所得的DC在形态上无显著差异，DC的吞噬能力以及CD14和CD83的表达亦无显著差异，但应用IMDM培养的DC的CD1a表达明显降低，且对T细胞增殖的刺激能力也显著降低；IMDM培养的DC高表达IL-6、IL-8和IL-10，而IL-12的表达则显著降低。结论：不同的培养体系可获得功能不同的DC，IMDM培养的DC可能与免疫耐受有关，本研究结果为DC在临床上的应用提供了新思路。 关键词RPMI1640；IMDM；单核细胞；树突状细胞 中图分类号R329．28文献标识码A Effect of Different Culture Mediums on the Development of Monocyte-derived Dentritic Cells CHEN Chen，LIU Yuan-Lin，LIANG Xiao-Lei，ZHU Heng，LI Hong，WU Ying，MAO Ning，ZHANG Yi Department of Cell Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Beijing100850，China Corresponding Author：ZHANG Yi，Professor，Senior Scientific Researcher．Tel：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn Abstract This study was aimed to investigate the effect of RPMI1640and IMDM on the development of human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells．Under the same cytokines and culture conditions，the different medium types were tested，and the morphology of mature and immature dendritic cells was observed by microscopy，the cell phenotype and endocytosis ability were detected by flow cytometry．Furthermore，the immunoregulatory function of various DC was analyzed by mixed lymphocyte reaction（MLR），the expression of cytokine in culture supernatant of MLR system was also analyzed by Bio-plex technology．The results showed that there were no difference in morphology，CD14，CD83 expression and endocytosis ability between IMDM-cultured DC and RPMI-1640medium-cultured DC，but there was a lower expression of CD1a in IMDM-cultured DC．Moreover，DC cultured with IMDM displayed a significant reduction in stimulating T cell proliferation，and highly expressed IL-6，IL-8and IL-10，but low expressed IL-12．It is concluded that the different cultural mediums can induce DC with different functions and DC cultured with IMDM may correlated with induction of immune tolerance．The results of this study will provide a new idea for DC clinical application． Key words RPMI1640；IMDM；monocyte；dentritic cell J Exp Hematol2011；19（4）：1010－1014 树突状细胞（dendritic cells，DC）作为一种重要的免疫辅佐细胞，是体内最强的抗原呈递细胞。它最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞，激发机体免疫反应，在诱导免疫应答中起关键作用［1］。因此DC在人类重大疾病（如肿瘤、移植免疫等）的发病和治疗中具有重要的研究价值。由于DC在体内含量很低，约占白细胞总数的1%－2%，且缺乏特异性的表面分子加以识别与纯化，因此近年来有关DC种类和功能的研究成为焦点。目前有关DC来2+造血干细胞来源的DC，另一种是外周血单核细胞来源的DC。体外培养DC的培养液为RPMI1640［2，3］，结合粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimu-lating factor，GM-CSF）和白介素4（interleukin-4，IL-4），可诱导获得CD1a+CD83+具有抗原呈递功 基金项目：国家重点基础研究资助项目（编号2010CB833604）；国家自然科学基金面上项目（编号31070996 通讯作者：张毅，教授、研究员．电话：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn 2011－02－14收稿；2011－03－29接受 · 0101 ·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2011；19（4）：1010－1014
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法） （一）外周血中的单个核细胞的分离： 1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作） 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。摘除眼球取血： 左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-1mL。 2. 分离PBMC操作步骤： 1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。 或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。 2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。 3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。 （稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。 （或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。） 4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度） 5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。 （或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。） 6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。 （*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板） 7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。 8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。 活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。计数200个细胞，计算活细胞百分率。 单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)310４32(稀释倍数) 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)3100％
单核细胞、中性粒细胞分离方法及注意事项
单核细胞分离方法 将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 ％CO2 、37℃下孵育2 h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培养液悬浮单核细胞，Wright 染色计数单核细胞>95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5 ％CO2，37℃下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70℃冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。 细胞分离中需要注意的几个问题 1.如果您要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都要是无菌消毒的，并注意实验中的无菌操作。 2. 离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（r pm）的换算。 3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连贯。 4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实验影响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时间控制，以免影响单个核细胞的活性。 5. 在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准确性，否则密度与预期的不一样，影响分离效果。 6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。
7.分离液与样本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，不宜超过2体积，小于2体积均可） 8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hank’s，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有Mg2+,Ca2+。 9. 细胞活性：0.2%台盼蓝染色3－5分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。 中性粒细胞分离的方法 1、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法 1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。 2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Pl asma, PPP）。 3）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。 5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。 6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用H BSA（含钙）重悬。 8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。 2、不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法
对外周血单个核细胞分离方法探讨
对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中华现代临床医学杂志 2003年11月 第1卷第9期 【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞 （Cytokine-induced killer，CIK）培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。 关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞 Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cells HanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al. Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University，Nanjing210029. 【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the re covery rate，t he adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of t he isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixy e thylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare thes
外周血单核细胞的分离以及培养
一、牛外周血单核细胞的分离 1、采血袋采集200ml血液 2、首先在15ml离心管加3ml分离液（室温） 3、轻轻的将3ml全血加到3ml分离液中 4、400g室温离心30min 5、离心后，吸取白膜层（0.5cm）转移到新的离心管 6、加10ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打） 7、250g室温离心10min 8、加5ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打） 9、250g室温离心10min 10、重复8、9，加0.5ml培养液悬浮， 二、磁珠分选 11、将分离得到的PBMCs 进行细胞计数。 12、离心细胞悬液，300×g，10 分钟。吸去上清。 13、将细胞沉淀用buffer（含0.5％BSA 的PBS）悬浮，按每107个细胞加80μL buffer 和20μL 抗CD14 磁珠，充分混匀，2-8℃孵育15 分钟。 14、300×g，10 分钟。吸去上清。用500μL buffer 重悬细胞。 15、将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用500μL buffer 清洗三遍柱子。 16、待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入1mL buffer，用助推器快速推动柱子中的洗脱buffer，收集单核细胞，计数。 17、单核细胞300×g 离心，10 分钟，用含10％的胎牛血清、100U/mL 青链霉素、PH7.2-7.4 的1640（IMDM）全培养液调整细胞浓度为按1×106单核细胞铺入10cm培养皿，37℃5%CO2温箱中培养。 三、磁珠分选注意事项 1、柱容量：1×107磁性标记细胞可上达2×108细胞总量。 注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时，柱容量需减少。 2、建议白细胞样本大小：在106—2×108细胞总量中有104—107标记细胞 3、典型富集率：50fold至1000fold,取决于磁性标记的活力和特性，达到10000fold 富集量就可以分装两柱。 4、柱流动停止，不要干涸 5、Void容积:60ul.贮液器容积3.5ml 6、PBS典型的流量包含0.5%BSA：0.35-0.5ml/min。 7、MS柱不可重复使用。 MS柱的准备： 1、准备用buffer漂洗的MS柱：取500ul degassde buffer 到柱的上部，并使buffer 流过全柱。MS 柱流动停止，不要干涸。 2、弃掉废液更换收集管。此时的MS 柱可用于磁珠分选。 注意：装满之后快速使用，避免温度升高产生气泡。用buffer装满柱的时间取决于贮存环境，温度和湿度。因此，时间可能从几秒到变到几分钟。这个时间并不影响分选质量。 用MS柱进行磁珠分选： 在进行下一步之前要等到柱子的贮液器是空的。
人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外“2+2”快速法培养及其鉴定
收稿日期：2008-04-03；接受日期：2008-06-17 基金项目：国家自然科学基金面上项目（30771951）；中国科学院“百人计划”项目；中国科学院知识创新工程重要方向项目（KSCX1-YW-R-16） * 通讯作者（Corresponding author ），E-mail: zhanght@post.kiz.ac 第一作者简介：硕士研究生，E-mail ：luxiaopengcas@https://www.wendangku.net/doc/2d19253692.html, 动 物 学 研 究 2008，Aug. 29(4)：415-420 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research doi:10.3724/SP.J.1141.2008.04415 人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外 “2＋2”快速法培养及其鉴定 陆小鹏1, 3，李 剑2，孙正华1, 3，赵 娜1, 3，刘 洁1，张华堂1, * (1. 中国科学院昆明动物研究所 免疫生物学实验室，云南 昆明 650223；2. 中国科学院昆明动物研究所 中心实验室， 云南 昆明 650223；3. 中国科学院研究生院，北京 100049） 摘要：以人浓缩白细胞来源的CD14＋单核细胞为前体，建立体外快速培养树突状细胞（dendritic cell, DC ）的方法。采用密度梯度离心和MACS 磁珠分选系统，收集高纯度的CD14＋单核细胞；以rGM-CSF 、rIL-4联合分化2天诱导不成熟DC ，再将分化后的细胞以rTNF-α、IL-1β、IL-6、PGE 2共同活化2天得到成熟DC 。流式细胞仪检测结果表明，分化2天的不成熟DC 具有吞噬能力，且表型HLA-DR 、CD40、CD80表达在80％以上，CD83、CD86基本不表达，成熟后的DC 能够激活T 细胞增殖，HLA-DR 表达增高，CD83、CD86表达占85％。 关键词：单核细胞； 树突状细胞；“2＋2”快速法 中图分类号：Q25 文献标识码：A 文章编号：0254-5853-(2008)04-0415-06 A “2＋2 days” Fast Protocol for the Generation of Dendritic Cells from Human Blood Monocytes LU Xiao-peng 1, 3, LI Jian 2, SUN Zheng-hua 1, 3, ZHAO Na 1, 3, LIU Jie 1, ZHANG Hua-tang 1,* (1. Immunobiology Lab, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Science, Kunming 650223, China; 2. Core Faculty, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Science, Kunming 650223, China; 3. Graduate School of the Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China ) Abstract: A “2＋2 days” fast protocol for the generation of dendritic cells （DC ） from high purity human monocytes in vitro has been established. During the 2-step differentiation and activation process, we demonstrated that 2 days of culture with GM-CSF and IL-4 were sufficient to generate immature DCs capable of antigen uptake. Similarly the mature DCs were activated with a cocktail of rTNF-α, IL-1β, IL-6, and PGE 2 from immature DC in 2 days. This “2＋2” fast DC had the same phenotype and function as the “6＋2” standard DC. Key words: Monocyte; Dendritic cell; “2＋2 days” fast method 树突状细胞（dendritic cell ，DC ）是体内高效的抗原递呈细胞（antigen presenting cel1，APC ）。它们以未成熟状态分布于机体的皮下或黏膜组织内，通过识别捕获微环境内的“异己”成分，将其加工并携带至淋巴组织，完成抗原呈递和DC 成熟的过程，进而激活静息T 淋巴细胞（resting T cell ）应答，启动免疫反应（Sousa ，2006）。 目前，在基础研究和临床应用领域，DC 的获得主要有3种方式：①直接从外周血分离；②从脐带 血和骨髓来源的CD34＋ 细胞诱导；③由外周血来源 的CD14＋ 单核细胞 （monocyte ）诱导（Tuyaerts et al ，2007）。由于外周血DC 含量不到1％，脐带血和骨 髓中CD34＋ 细胞仅有1％左右（Jeras Bergant & Repnik ，2005），而外周血中CD14＋ 单核细胞达15％左右（Campbell-AnsonKentor & Radvanyi 2008）， 所以通常选择CD14＋ 单核细胞为前体，按“6＋2”传统法，经过分化和活化两个阶段诱导DC （standard DC ）。即将贴壁收集的CD14＋ 单核细胞，用分化因子诱导5－7天得到具有抗原摄取能力的不成熟DC （immature DC, iDC ），再用活化因子刺激2－3天得