固定化动物细胞大规模培养技术研究进展

固定化动物细胞大规模培养技术研究进展

石　凯1

　熊晓辉1

　许建生

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(1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008)

摘　要　介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。关键词　固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化

中图分类号　Q 813.1+1 文献标识码　A 文章编号　1000-6613(2002)08-0556-04

固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。

1　动物细胞的特点及生长特性

动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用

抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。

动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。

2　固定化培养方法

在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活

力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞

产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。2.1　吸附2.1.1　多孔陶瓷

KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自

动化的细胞培养系统[2]。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。这种结

构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。

该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。2.1.2　微载体

微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。这种培养技术是在生物反应器内加入培养

液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的

收稿日期　2001-12-07;修改稿日期　2002-03-05。

第一作者简介　石凯(1977—),男,硕士研究生。电话025-*******-3716。

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655? 2002年第21卷第8期　化 工 进 展

CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS

微载体为细胞提供了极大的附着表面,1g微载体其比表面积可达6000cm2,从而可实现细胞的高密度培养[4]。

微载体的直径在60～250μm,由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成,如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等[5～7]。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性,在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质,因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。

Van Wezel当时选用的是阴离子交换树脂Sephadex A50培养动物细胞,其后Van Hemert、Spier及Whiteside也相继作了培养仓鼠肾细胞(BH K21)等细胞及生产口蹄疫苗的报道[8]。采用微载体培养具有以下优点:①比表面积大,单位体积培养液的细胞产率高;②采用均匀悬浮培养,无营养物或产物梯度;③可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况;④细胞收获过程相对简单,劳动强度小;⑤培养基利用率高,占地面积小;⑥放大容易,国外已有公司以1000L规模培养人的二倍体细胞来生产β-干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞;接种密度高;微载体吸附力弱,不适合培养悬浮型细胞。

2.1.3　大孔微载体

人们为了解决微载体培养系统中细胞易受机械损伤的缺陷以及能最大限度地扩大比表面积,开发了具有完全连通沟回的大孔微载体。这一方法首先是在1985年由Verax公司开创的(Verax系列大孔加重胶原珠),其后出现了多种大孔微载体。张孝兵等[9]将广泛使用的Verax流化床系统与常规传统大规模培养系统结果做了比较,发现Verax系统的细胞密度和体积产率比相应的常规培养高。

由于大孔微载体将细胞固定在孔内生长,因而与其他方法相比具有一系列优点:①比表面积大,是实心微载体的几倍甚至几十倍;②细胞在孔内生长,受到保护,剪切损伤小;③与包埋法相比,传质尤其是传氧效果好[10];④两种类型细胞都适用;

⑤细胞三维生长,细胞密度是实心微载体的10倍以上,有的可达108个/mL[11];⑥适用于长期维持培养,例如Verax流化床培养系统能维持培养100多天,细胞生长情况依然良好;⑦微载体浓度高,实心载体在培养液中浓度增大到一定时,细胞密度反而下降;而大孔微载体在浓度较高时,表面碰撞增加,能促使细胞在孔内生长;⑧最适合于蛋白质生产和产物分泌。因此有人预言,大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。

2.2　包埋

将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。此法步骤简便,条件温和,负荷量大,细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护,细胞能抗机械剪切。但该法也有一定缺点,如扩散限制,并非所有细胞都处于最佳营养物浓度。包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。

多孔凝胶是最常用的载体,用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。

2.2.1　海藻酸钙凝胶

海藻酸钙凝胶包埋法是将动物细胞与一定量的海藻酸钠溶液混合均匀,然后滴到一定浓度的氯化钙溶液中形成直径约1mm内含动物细胞的海藻酸钙胶珠,分离洗涤后即可用于培养。此法操作时条件温和,对活细胞损伤小。但固定后机械强度不高。为了大量制备海藻酸钙凝胶包埋的固定化细胞,国外已有专门的振动喷嘴设备可供使用[12]。2.2.2　琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油),形成直径0.2mm凝胶珠珠,移去石蜡油后,细胞即可进行培养。同海藻钙一样,琼脂糖更适于培养悬浮细胞。

尽管凝胶珠形成过程很复杂,目前放大体积不超过20L。但琼脂糖凝胶无毒性,具有较大的空隙,可以允许大分子物质自由扩散,因此该法特别适用于蛋白产物的连续生产。Mosbach等曾用琼脂糖包埋杂交瘤细胞L S21和淋巴细胞MLA144生产单克隆抗体和白细胞介素[13]。

2.2.3　血纤维蛋白

将动物细胞与血纤维蛋白原混合,然后加入凝血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白,将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁,因此两种类型的细胞都适于培养。而且基质高度多孔,允许大分子物质的自由扩散。但机械强度差,对剪切力很敏感。

2.3　中空纤维

中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态,利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。自从1972年Knazek等[14]首次报道该技术后,陆续已有许多关于用中空纤维系统培养

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　第8期 石凯等:固定化动物细胞大规模培养技术研究进展

动物细胞的研究工作。

典型的封闭式中空纤维反应器循环系统[15]如图1所示。系统的核心装置是中空纤维反应器,里面封装了一束中空纤维将整个反应器内腔分为毛细管外空间(extracapillary space ,ECS )和内腔空间(lumen space ,LS )。培养细胞接种到ECS 中,培养液和氧气灌注到纤维管中,依靠蠕动泵的推动在系统中循环,并通过扩散作用从LS 提供给细胞[16]

。

图1　封闭式中空纤维反应器循环系统示意图

这种柱状反应器的不足之处是营养供应和细胞代谢产物存在浓度梯度,因而细胞分布不均,培养贴壁细胞时不能扩展成单层。为此,Feder 等[17]开发出将纤维管束横放的平板式浅床中空纤维反应器

(flat -bed hollow fiber bioreactor )。将若干层浅床组合在一个反应器中,床层深度相当于3～6层纤维管,为使培养液分布均匀,在床层两端安装了2μm 微孔的分布器。

中空纤维培养技术的优点是无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入,使培养细胞和产物密度都可达到比较高的水平。缺点是膜的污染和堵塞,观察困难,细胞生长或过量气体产生会破坏纤维[18]。

中空纤维培养技术的发展趋势是让细胞在管束外空间生长,以达到更高的细胞培养密度。目前中空纤维反应器已进入工业化生产,主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体,如Bioresponse 和Invitron 公司利用这种反应器生产单克隆抗体[19]。2.4　微囊化

微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin 和Sun 创建的一种大规模培养技术[20]。其要点是:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1.4%海藻酸钠溶液,半透膜由多聚赖氨酸形成。培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统。微囊工艺已生产出以克计的单克隆抗体[21]。实验证明,采用批式和连续

灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,在7～27d 微囊内抗体浓度可达1250～5300mg/L [22]。

利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞,形成免疫隔离的人工细胞,以此植入疾病动物或病人体内。由于微囊里外来的组织细胞分泌分子量小于11×104ku (u =(116605402±010000010)×10-27kg )的激素和介质等物质,可补充疾病体内缺乏的生理活性物质,从而达到治疗疾病的目的,并且不引起免疫排斥现象。1980年G oosen 等报道了微囊化胰岛移植治疗大量实验性糖尿病。他们将同种大鼠胰岛用海藻酸-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺包埋后植入链脲霉素诱导的糖尿病大鼠体内,在未用免疫抑制剂的情况下,控制大鼠血糖正常达一年左右[23]。

胶囊化培养的优点是:①可防止细胞在培养过程中受到物理损伤;②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜,从而提高细胞密度和产物含量,并方便分离纯化处理。缺点是:①微囊制作复杂,成功率不高;②微囊内死亡的细胞会污染正常产物;③收集产物必须破壁,不能实现生产连续化。

3　固定化方法的选择

(1)培养规模。由于各种固定化系统可以获得

相同的细胞密度,且细胞的产率主要取决于细胞的扩散,因此反应器的体积是培养规模放大的主要决定因素。虽然微载体系统可以提供最大的单元操作,但其他系统也可以通过增加单元套数而获得放大。

(2)培养方式。除了海藻酸钙包埋法外,其他固定化基质都是多孔型的,能允许大分子物质自由出入,因此可实现蛋白质产物的连续生产。但一些小分子蛋白如单克隆抗体和IL -2等也可从海藻酸钙凝胶珠中分泌出来。在凝胶珠和微囊中可使蛋白产物积聚到很高的浓度,给后续的分离纯化处理带来方便,并大大降低了生产成本。

(3)所培养的细胞类型。大多数固定化系统都适用于贴壁型细胞的培养。而在吸附非贴壁型细胞时,由于吸附力弱容易出现细胞泄露。

(4)制备方法的难易和成本。由于固定化基质是由制造商在不同的竞争时期提供的,因此各种固定化方法的成本很难比较。海藻酸盐和琼脂糖是以化学试剂形式出售;胶原珠是以无菌形式提供给使用者,以便于接种。中空纤维组件和吸附介质可以在接种前消毒灭菌。所有的反应器系统都要求配置相同的外周设备,如泵、氧合器(人工肺)等。

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855? 化 工 进 展 2002年第21卷　

4　存在问题

(1)固定化细胞培养的细胞密度较一般悬浮培

养高10～100倍,但同时也带来了如何保证足够的营养物质和氧的传递问题。

(2)细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题

[24]

。包埋在凝胶或微囊中

死亡的细胞会对其他细胞产生污染和毒害作用。

(3)培养基及固定化基质价格昂贵,生产成本高居不下。尤其是高效的微载体细胞培养介质,销售价格一直呈上涨趋势。

(4)目前对细胞代谢和生长动力学的研究以及在线监测水平还远不足以设计出确定的优化培养系统,从而导致昂贵培养基的浪费。

5　展　望

固定化动物细胞培养工程发展的总方向是大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。从国际上的发展趋势看,动物细胞培养技术主要有[25]:(1)开发细胞培养反应器和培养系统;(2)开发培养贴壁细胞的载体;(3)开发微囊技术;(4)开发杂交、重组技术;(5)开发无血清和化学合成的培养基;(6)蛋白质浓缩和提纯技术。

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25

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1993.39

Progress on Large -Scale Cultivation of Immobilizing Animal Cells

S hi Kai 1

,Xiong Xiaohui 1

,X u Jiansheng

2

(1School of Pharmaceutical and Life Science ,Nanjing University of Technology ,Nanjing ,210009;

2The Provincial Suzhou Agrotechnical School ,Suzhou ,215008)

Abstract The prodution of proteins with bioactivity using culturing animal cell has become one of the most important methods in the fields of high -tech biopharmacy.This article introduces some main technology and recent development in large -scale cultivation of immobilizing animal cells ,and specially focuses on several common ways of the animal cellculture ,such as adsorption ,entrapment ,hollow fibres and encapsulation.On the basis of above -mentioned survey ,the existing problems and prospects for immobilizing animal cell cultivation are discussed.

K eyw ords immobilizing animal cell cultivation ,adsorption ,microcarrier ,entrapment ,hollow fibres ,encapsulation

(编辑　张永圻)

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955?　第8期 石凯等:固定化动物细胞大规模培养技术研究进展

动物细胞培养基本操作

实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品

高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3

动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:

教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。

细胞破碎方法综述

细胞破碎方法综述 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法 1前言 目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。 自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。 2细胞破碎技术 2．1高压匀浆破碎法（homogenization） 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 2．2振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振汤机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便. 2．3高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。 2．4超声波破碎法（ultrasonication）

固定化动物细胞大规模培养技术研究进展

固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 石　凯1 　熊晓辉1 　许建生 2 (1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008) 摘　要　介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。关键词　固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化 中图分类号　Q 813.1+1 文献标识码　A 文章编号　1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。 1　动物细胞的特点及生长特性 动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用 抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。 动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。 2　固定化培养方法 在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活 力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞 产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。2.1　吸附2.1.1　多孔陶瓷 KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自 动化的细胞培养系统[2]。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。这种结 构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。 该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。2.1.2　微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。这种培养技术是在生物反应器内加入培养 液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的 收稿日期　2001-12-07;修改稿日期　2002-03-05。 第一作者简介　石凯(1977—),男,硕士研究生。电话025-*******-3716。 ? 655? 2002年第21卷第8期　化 工 进 展 CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS

细胞培养在分子水平和细胞水平研究

新疆农业大学 专业文献综述 题目: 细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展 姓名: 郑峰 学院: 食品科学与药学学院 专业: 食品科学 班级: 13级研究生 学号: 1340020279 成绩： 指导教师: 武运教授 2014年2 月20 日

细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展 摘要：利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品，为提高细胞活力和细胞生长密度，采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞，选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器，在线监控细胞生存环境和生理活动，减少培养过程中培养基的抑制因素，从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因，可减缓细胞凋亡的发生，提高细胞活性和蛋白产量，本文从分子水平和细胞水平两方面进行综述。 关键词：动物细胞;培养环境;DNA;微载体 Research advance in large-scale culture of animal cells at the level of Molecule and Single Cell Abstract:Many biological products were manufactured by means of large -scale culture of animal cells. To increase cell-specific productivity and cell density, serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture, and micro carriers were chosen in favor of cell growth and high cell density. Bioreactors with simple manipulation, good qualification and aeration were adopted. More suitable conditions for cell growth could be given through on-line supervising the environment for cell growth and restraint factors in cell culturing. Furthermore, the anti -apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity. Porous micro carriers was emphasized in large -scale culture of animal cells. Key words:animal cell; culture environment; DNA; micro carrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来。近一个世纪以来，从能维持组织存活到生长出新细胞，从少数组织到各种组织细胞的培养，从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺，组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一。目前，动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。在动物细胞大规模培养的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的

(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工

动物细胞培养及无血清培养研究进展

动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容

动植物细胞的大规模培养

动植物细胞的大规模培养 动物细胞培养简介 所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增值过程。在此过程中，细胞不再形成组织。动物细胞培养是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种必不可少的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，既推动了生物学和医学的发展，又带来了巨大的社会效益和经济效益。目前, 动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。 动物细胞培养的环境 影响动物细胞培养的主要因素有温度、pH值、CO2 、DO、葡萄糖、乳酸、氨、甲基乙二醛、培养基成分等。一般情况下，人和哺乳动物细胞的最适温度为37℃，pH值在7.2-7.4之间，CO2 水平为4-10%, DO维持在20-50%，葡萄糖是细胞培养过程中的能量的主要来源，需要维持在一定水平。乳酸、氨、甲基乙二醛等是动物细胞培养中的主要限制因素。在实际应用中，降低甲基乙二醛的浓度是通过降低葡萄糖用量来实现的。 培养基 用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。 天然培养基的优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。天然培养基的种类很多，包括血清、血浆、组织浸出液、水解乳蛋白等。其中血清是最常用的天然培养基。 合成培养基的优点是既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。然而合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。 培养方法 动物细胞的体外培养有两种类型：贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。 悬浮培养： 悬浮培养主要用于非贴壁依赖性细胞，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。对于小规模培养可采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养则可采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养对设备的要求也比较简单。 贴壁培养： 贴壁培养是动物培养的一种重要方法，是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和许多异倍体等贴壁依赖性细胞的培养。 优点： 1.细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液，容易更换培养液； 2.因细胞固定载体表面，不需过滤系统，容易采用灌注方式培养，从而达到提高细胞密度的目的； 3.当细胞壁贴于生长基质时，细胞将更有效的表达一种产品； 4.同一设备可培养多种细胞，并根据需要采用不同的培养液和细胞的比例； 缺点： 1.细胞繁殖贴壁后不易消化下来，培养的扩大比较困难； 2.培养设施占地面积大，设备投资大；

基因工程与生物药物

基因工程与生物药物 姓名：李华龙 班级：生物制药1301 学号：1302150003

摘要 自1972 年DNA重组技术诞生以来,生命科学进入了一个崭新的发展时期。以基因工程为核心的现代生物技术已应用到农业、医药、轻工、化工、环境等各个领域。它与微电子技术、新材料和新能源技术一起,并列为影响未来国计民生的四大科学技术支柱, 而利用基因工程技术开发新型生物药物更是当前最活跃和发展迅猛的领域[ 1]。从1982年美国Lilly 公司首先将重组人胰岛素投放市场,标志着世界第一个基因工程药物的诞生。基因工程制药作为一个新兴行业得到各国政府的大力支持, 各国都积极研究和开发各种基因工程药物,并取得了丰硕成果。本文通过对基因工程药物的开发、应用和研究方法等研究进展进行综述。Abstract Since 1972, DNA recombinant technology was born, life science has entered a new period of development.Gene engineering as the core of modern biotechnology has been applied to agriculture, medicine, light industry, chemical industry, environment and other fields . It and microelectronic technology, new materials and new energy technologies together, tied for the four future beneficial to the people's livelihood the big pillar of science and technology, and using genetic engineering technology to develop new biological drugs is the most active and rapidly developing field. From the United States in 1982 Lilly's first recombinant human insulin on the market, marking the birth of the world's first gene engineering medicine. Genetic engineering pharmaceutical as an emerging industry has received great support from governments the countries are actively research and development of various genetic engineering drugs, and achieved fruitful results. In this paper, through the development of gene engineering medicine, research and Application Research progress is reviewed in this paper. 关键词 基因工程、生物药物、研究进展、应用 Genetic engineering、biological medicine、research progress,、application

动物细胞培养技术 思考题

《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。

细胞工程

细胞工程在生物制药中的应用 摘要：细胞工程是生物制药工业中的关键技术，它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具。本文综述了细胞工程发展的历史、现状和未来，以及它在生物制药领域中的应用和局限。 关键词细胞工程；生物制药 Abstract: Cell Engineering biopharmaceutical industry is a key technology, which is the use of animal cells in vitro and amplified to produce biological products, or as a tool for discovering and testing new drugs. This article reviews the history, present and future, as well as its applications and limitations of cell engineering development in the biopharmaceutical field. Keywords: cell engineering; biopharmaceutical 1.动物细胞技术的历史 在疫苗产业早期，往往利用动物来生产疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗，用奶牛来生产天花疫苗，用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗。在1920年至1950年，已经开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗和黄热病疫苗等。 早在1950年代，已经能够利用动物细胞培养技术来生产病毒。先在反应器中大规模培养动物细胞，待细胞长到一定密度后，接种病毒，病毒利用培养的细胞进行复制，从而生产大量的病毒，这一突破

常用的五种动物细胞培养方式

?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

(完整版)动物细胞培养及应用发展史

细胞培养技术

细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

动物细胞培养技术实验

实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,

基因工程药物的综述

基因工程药物的研究及进展 摘要：20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。本文以基因工程药物的发展为导向，简要的介绍了国内外基因工程药物的发展概况、研究现状、研究方向、发展方向。 关键词：基因工程，药物，现状，发展 1 基因工程药物的发展概况 20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。 基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白，但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺乳动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物。但由于哺乳动物细胞培养条件相对苛刻，生产的药物成本居高不下。第一、二代基因药物的研制和生产已经成熟。从第一个反义核酸药物Vitrovene于1998年和1999相继在美国和欧洲上市以来，发展迅速。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入NN-~L动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。携带外源基因并能稳定遗传的这种动物，我们称之为转基因动物。由于从哺乳动物乳汁中获取的基因药物产量高、易提纯，因此利用乳腺分泌出的乳汁生产药物的转基因动物称为“动物乳腺生物反应器”。90年代中后期，国际上用转基因牛、羊和猪等家畜生产贵重药用蛋白的成功实例已有几十种，一些由转基因动物乳汁中分离的药物正用于临床试验，但还没有一例药品成功上市。 2 基因工程药物的研究现状 2.1国外基因工程药物研究现状 随着1971年第一家生物制药公司Cetus公司在美国的成立，1973年重组DNA技术的出现，生物医药即已显示出巨大的应用价值和商业前景。1976年，世界第一家应用重组DNA 技术开发新药的公司Genentech建立，l982年第一个基因重组药物——基因重组人胰岛素在美国投放市场以来，生物医药产业以一种前所未有的速度迅猛发展。如在基因重组制药产业中做出过卓越贡献的Genentech和Amgen公司，早期的几个“重型炸弹”的基因重组

动物细胞培养产酶概述

动物细胞培养产酶概述 （07生物科学李田07124053） 摘要：动物细胞培养开始于本世纪初，1962 年其规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要分。本文将对动物细胞培养产酶的一般工艺作一综述。 关键词：动物细胞培养小牛血清生物反应器分离纯化酶修饰固定化酶 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前，动物细胞有悬浮培养和贴壁培养，技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。药用蛋白质的合成复杂,要有精确折叠的空间结构,要有糖基化,才能使药物发挥真正 的功能.细菌和酵母等产品要么是包涵体,要么难以糖基化功能修饰.动物细胞的 培养技术来生产有功能的蛋白质,大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要. 一、.动物细胞培养的特点 动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差； ②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少（氧传质系数kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长）； ④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。 二、动物细胞培养基特点 （一）动物细胞的培养条件 ⒈器材的清洗和消毒 ⑴器材的清洗浸泡,刷洗,泡酸,冲洗 ⑵器材的消毒灭菌物理消毒化学消毒 ⒉水质 :电阻值大于18MΩ,去热原. ⒊ pH:7.2～7.4 ⒋渗透压:290～300mOsm/kg ⒌温度:37±0.5 C ⒍空气:氧的饱和质60%,氧分压4～0.7kPa （二）动物细胞的培养基的种类和组成分3类: ⒈天然培养基血清,羊水,腹水等,成分复杂,成分不稳定 ⒉合成培养基⑴氨基酸⑵维生素⑶糖类⑷无机盐⑸其它成分 如:添加小牛血清 ⑴提供生长因子和激素 ⑵提供贴附因子和伸展因子

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞

增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成