现代生物学试验——生化样品的制备与分析教案
蛋白质实验技术模块教案
一、教学内容：
1、蛋白质分离纯化与分析：每2人一组，共18—19组×2,每组5d,5×9=45学时
×2。
2、DNA的制备与分析：每2 人一组,共18~19组×2班,每组2d,2×9×2=36学
时。
二、具体内容：
cytc分离一天。
生物大分子制备的原理2学时。
PAGE,PI—PAGE,SDS—PAGE原理2学时。
Sephadex G100等层析原理2学时。
分离物的Sephadex G100纯化,1.5d。
分离,纯化过程中所获阶段样品的SDS—PAGE跟踪及分度分析,1.5d。
纯化物的进一步分析的设想,2学时。
DNA分离纯化原理及注意事项,2学时。
兔肝DNA的分离纯化,1d。
DNA的理化性质分析，7学时。
三、教学目的:
1、模拟生化大分子制备的全过程开展较为系统性的训练。
2、掌握现代仪器在生化样品制备与分析中的应用及其原理。
3、掌握两类生物大分子分离纯化,理化性质分析的基本原理及注意事项。
四、cytc的分离：
（一）实验方法步骤见教学讲义P21。
（二）各步骤的基本目的与要求：
取材——猪心，要求新鲜，cytc未被破坏，含cytc高，材料易得。
加等量0.145mol/l TCA，使cytc从线粒体膜上解聚下来，使呈酸性可
溶状态。
过滤——去杂质。
调PH至7.3——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白，缓慢添加。
第二次加（NH4）2SO4的作用是进一步去除杂蛋白，缓慢添加。
两次添加（NH4）2SO4后，cytc仍呈可溶性。
静置过中午或至少2h，目的是解水合，使蛋白质凝聚成絮状，以利于
通过离心方法去沉淀。
加入20%TCA（25mol/l上清）——沉淀cytc。
透析——去掉酸，去小分子，为上Sephadex G100作准备。
透析要求：低温，不漏，换透析液，用Ba+方法检查透析的效果。
五、离心机：
1．类型：实验室用与工业用，间歇式与连续式，冷冻式与不冷冻式，地面式与桌式，普通离心机和高速离心机与超速离心机，制备式与分析
式。
2．实验室常用离心机：
普通离心机——台式（3000-16000rpm）和地面式（3000-6000rpm），
一般不带冷冻设备，由电机和转子所组成，转速由电压调节器
调节。
高速冷冻离心机——台式与地面式，18000-25000rpm，0-4℃。
上述+制冷设备及温度检测器。
超速离心机——地面式，达30000rpm，0-4℃。
上述+真空设备及真空检测器。
3．转子：角式与水平式转子，角式常用于沉降离心，水平式还常用于梯度离心。
4．离心原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加速颗粒的沉淀速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度的物质分离开。
F=ω2ω2r。ω是角速度（弧度/秒）。r是颗粒的旋转半径（厘米）
F是任何颗粒所经受的向外离心力。
RCF=ω2r/980, RCF是相对离心力，单位为G；980是地心引力，
单位为厘米/秒2。
RCF=⒈119×10－5n2r, n为每分钟的转数。
处于离心管内不同位置的颗粒所受的离心力不同，常以离心管中点至旋转中心距离为r时所得到相对离心图表示为平均离心力。
离心力的计算使不同转速和不同离心半径的离心，统一到相同的离心中去衡量颗粒在离心中所受外加作用力的大小，以利用因不同离
心机，不同转子在使用中所选择的离心时间和转速。
离心时间：t= [(㏑r2-㏑r1)/ω2]/s
t为样品颗粒完全沉降到离心管底的时间(秒).
S为沉降系数.
r2为旋转轴中心到离心管底部的距离(厘米).
r1为旋转轴中心到样品液液面的距离(厘米).
5.离心方法:
(1)差速离心法: 定义，应用于沉降系数相差一~几个数量级颗粒的分离。
缺点：a.分离效果差,不能一次得到纯颗粒,经再悬浮和再离心(2~3次),才能得到较纯的颗粒。
b.壁效应严重,在离心管一侧会出现沉淀。
c.颗粒被挤压,可能变形,聚集而失活。
（2）梯度离心：定义,应用于相差较少(20%或更少)或分子量相差三倍的蛋
白质。
优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。
b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,
又能分离有一定浮力密度差的颗粒。
c.颗粒不会挤压变形。
缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不易掌握。
常用的密度梯度离心方法有：蔗糖密度梯度离心；氯化铯等密度梯度离心。
6.普通离心机使用注意事项:
(1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。
(2).使用前应检查套环是否平衡(台称)。
(3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡(台称)。
(4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子
的对称位置。
(5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。
(6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要2~3min)。
(7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间(10min)。
(8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。
(9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。
六、生物大分子制备的实验设计
（一）生物大分子制备的意义。
随着分子生物学研究的进展，人们不但要研究生物体内一种物质的结构与功能，而且要研究所有物质的结构与功能。
只有掌握所有物质的结构与功能，才能阐明它们是如何生物合成又是如何加工的，以最终阐明这些物质在什么阶段合成，它们的结构如何，它们在生命的生长发育和衰老中的作用。
人类基因组计划的顺利完成以及后基因组计划的实施就是按照这样的思路而进行的。
人类基因组计划——植物——水稻基因组计划——酵母细菌病毒的基因计划——蛋白质组学——目的是揭示生命活动的规律。可见，阐明生命不同物质结构与功能的研究已成为可能。人类遗传性，非遗传性疾病的防治，肿瘤的成因及其防治已不是理想，而将变为现实。
在人们的科学研究，生产活动中，往往会遇到一些现象，如比较同种物种的不同个体，发现有一差异的mRNA，差异的蛋白质等，环境因素影响也会出现这种现象，那么人们对于掌握这一差异物质的功能就显得尤其迫切。所以生物大分子研究也成为势在必行的重要内容。
而这些研究，总是以纯化这些大分子物质为前提的，所以同学们必须学习这部分内容。
（二）生物大分子制备方法的特点
1．生物材料组成非常复杂，常包括数百种甚至数千种化合物，各种化合物的形状，大小，分子量和理化性质各不同，其中有不少化合物迄今还是未知物质，而且这
些化合物在分离时仍不断在新陈代谢中。
2．有些化合物在材料中含量极微，只有万分之一，或是几十万分之一，甚至几百万分之一。如脑垂体组织提取某些激素的释放因子，蚕的信息素，竹笋的竹笋素等
都是从几吨到十几吨才能得到几毫克的目的物。
3．许多生物大分一旦离开生物体内环境，很快变性，破坏。因此在分离过程中必须保护这些化合物的生理活性，这也是最难做到的一点。在分离中，过酸，过碱，
重金属离子，高温，剧烈的机械作用，强烈的辐射和体内自身酶的作用，均可破
坏这些分子的生理活性。故分离具生物活性物质，常用十分温和的条件，并尽可
能在较低温度和洁净环境下进行。
4．生化分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH值，离子强度等）对溶液中各种组成综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强，实验结果
往往有很大的经验成分。因此一个实验的重复性的建立，从材料至方法直至各种
环境条件，使用的试剂药品等都必须严格的加以规定。
5．为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种
分离方法，才能达到纯化目的。
（钓鱼法——亲和层析法）
6．生化分离方法的最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，其均一性的评定常常是有条件的或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对的“均一
性”结论。
（三）生化分离制备的基本原理
与一般化学分离方法原理有许多相同，相通之处。
用于生物化学分离制备的技术，大都根据混合物中的不同组分分配率的差异把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（有机溶剂抽提，盐析，结晶等）。或者将混合物置于某一物相（大多数为液相）中，外加一定作用力，使各组分分配于不同区域，从而达到分离目的（如电泳，超离心，超过滤）。
几乎所有有机大分子物质都不能融化和蒸发（除氨基酸脂肪酸，某些维生素外）。
只限于分配在固相和液相中，并在这两相之间相互交替进行分离纯化。
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F1A<——————A——————F2A
F1B<——————B——————F2B
运动方向
a色谱：吸附色谱，离子交换，分配，分子筛等。F1为流体动力；F2为表面能，范德瓦尔斯力位阻效应，静电引力，极化度分子筛效应，渗透（扩散），偶极作用，缔合和解离效应等。
b电场力：F1为静电引力；F2为分子摩擦力，极化度动电作用
c.扩散方法：F1为电动力，渗透力，流体动力；F2为分子筛效应电动力。
d.结晶：F1为结晶格子能；F2扩散。
e.沉降：F1为重力，离心力；F2为分子摩擦效应。
上述分离依据：极性，离子性质及分子大小，分子大小及形状，介质密度。
两物质彼此分开：
F1A﹣F2A =ΔF A
F1B﹣F2B =ΔF B
ΔF A/ΔF B=ΔF
∴在分离混合物的各组分中，必须尽量设法扩大各组分之间的ΔF的差别。
（四）生化分离制备实验的设计，大致可分为五个阶段：
1．确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法
目的：a.在原有实验方法的基础上加以改进，求更多更纯产品。
b.为了获得新物质：
无意识的：实验中发现异常情况的追究。
有目的的：去追踪引起某现象发生的物质基础。
鉴定方法：
a.生物测定方法。
b.理化测定方法，如呈色法，色谱法，光谱法，电泳法，
核磁共振法等。
c.理化+生物测定法：如虾的蜕皮激素的分离，用理化法不能用（含量极低），用丽
蝇的生物测定法结合理化法，从1000Kg得2mg蜕皮激素。又如，蚕的蚕醇用
气相色谱法+蚕蛾兴奋反应法。
2.制备物物理化学性质稳定性预备试验
A.溶解性在水或各种稀酸的溶解性。
弱酸性溶剂（乙醇，甲醇，丙酮）的溶解性。
各种非极性溶剂中（氯仿及各种烃类）的溶解性。
B.溶液的稳定性pH稳定范围，温度效应，各种缓冲液的影
响，有机溶剂的影响。
C.固态时稳定性温度，水分的影响，低压冻干效应
D.物理性质通过不同大小孔径膜的能力，在固体上的吸附作
用，在电场中每一pH的迁移率，在超离心力场中
的沉降行为。
E.化学性质膜蛋白酶及其他蛋白酶，DNase，Rnase，糖类水解酶等作用
的稳定性，在温和条件下乙酰化作用
的稳定性，对亚硝酸作用的稳定性，酯化作用的稳
定性。
3．材料处理及抽提方法的选择.
处理：机械法，物理化学（反复冻融发，骤热骤冷法，超声波
处理法等）及生物处理法（自溶法，酶解法，表面活性
处理法）
抽提：水，酸碱盐，表面活性剂，有机溶剂。
4．分离纯化方法的摸索。
分离方法：色谱法
逆流分配
电泳法
沉降法
透析
溶解度（盐析，有机溶剂抽提）
5．获取制备物以后，均一性的测定。
溶解度法
电泳均一性测定法
高速离心沉降法
七、PAGE 原理：
2、PAGE 电泳的试剂，溶液的功能。
CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x—
︳︳︳
C=O CH2 CO C=O
︳∣︳︳
NH CH NH NH2
︳︱︳
CH2 ＋C=O CH2
︳︳︳
NH NH2 NH
︳︳
C=O CO
︳︳
CH2=CH —CH2—CH—[CH2—CH]x—
︳
C=O
︳
NH2 甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺网状聚合物
催化剂：过硫酸铵，AP，在隔氧的状态下。加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。
催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。
PH8.3的电泳缓冲液：6g的Tris+28.8g甘氨酸→10000ml水中。电泳时使Clˉ，—Cooˉ离子带动蛋白质在网状聚合物中移动。
PH6.7的Tris–HCl buffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。
PH8.9的Tris–HCl buffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。
溴酚兰电泳指示剂，一般迁移在蛋白质之前。
R–250 考马斯亮兰，蛋白质染色剂，在一个组分中含量达1ug时呈可见带。
2．电泳管、板的制作：
a．管垂直插入橡胶头内，距上端1cm，2cm处用蜡笔标记出。
b．板用凡士林或硅胶橡胶套密封并夹入电泳槽中，直立，同上标出记号。
（橡胶套密封后要用琼脂糖或琼脂密封，使成为一个长方形小室，不漏）3．灌胶：
先灌分离胶：20ml，7.5%分离胶，需分离胶buff 2.5ml，胶贮液5ml，10%TEMED 0.1ml，混匀，用长头滴管加至第一个标记处，用蒸馏水复盖。可见一条明显折射线，
以后模糊，再清晰，表明聚合完全。去水（用长条滤纸）。
后灌浓缩胶：10ml，30%胶浓度，需浓缩胶buff 1.25ml，胶贮液1.0ml，10%TEMED 0.05ml，H2O 7.65ml，10%AP 0.05ml，用长头滴管加至管的第二记号处或平板的满槽，
平板加满后马上插入梳子令其聚合（约30min）。管状的加入水令其凝固。4．上样，见讲义。
5．上样，见讲义。
6．蛋白质在电泳中的泳动行为：
电泳启动时，蛋白样品处于PH6.7的上层，蛋白之上PH8.3，PH6.7层之下为PH8.9的分离胶层，上槽为负极，下槽为正极。
出现了PH不连续和胶孔径大小不连续：启动时Clˉ解离度大，Proˉ解离度居中，甘aaCOOˉ解离度小，迁移顺序为（PH6.7）Clˉ>Proˉ>—COOˉ。在Clˉ与Proˉ之间和Proˉ与—COOˉ之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Proˉ向Clˉ迁移，—COOˉ向Proˉ迁移。
如：一个Clˉ领路，—COOˉ推动。
在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Proˉ受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。
当蛋白质进入分离胶时，此时Proˉ，Clˉ，甘aa离子在PH8.9的溶液中，Clˉ完全电离而很快到达正极，甘aa电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。
由于Proˉ在电泳过程中，受到溶液离子的变化而PH值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就出现了电荷效应。
由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开，并用R250染色而加以显示出来。
八、透析：
是一种把样品置于一个具有一定大小孔径的袋中，并且于水或缓冲液放置，让小分子物质与目的大分子彼此分开的过程。
透析袋有现成的商品，可从公司购买。一般可去样3000dl以下的分子，可以用于脱盐而改变目的物的状态。如：（NH4）2SO4盐析所得的沉淀物，变成可溶性目的物，排除离子的干扰，保持目的物的生理活性。
注意事项：
1．装袋前要对袋（管）查漏，以防样品流失。
2．透析管两部或袋上端要留下一定的空间，以防止水进入袋后涨破。
3．袋要扎紧以防流失。
4．置水或缓冲液时，包扎处最好要高离液面。
5．置4℃冰箱透析以防变性。
6．最好是多换透析液（4h，24h）。
要用相应的方法检查透析是否完全，如奈氏试剂查NH4，BaCl2查SO42-等。
7．
8．要出后把袋外水液用滤纸吸干。
九、Sephadex G100 的工作原理：
（一）、Sephadex G100的结构示意图，主要参数：
成为颗粒状，装于玻璃柱内，颗粒内及之间为缓冲液所占据。
从柱管底部与胶颗粒交界面至柱上端胶面，所范围的体积称为柱床体积V0 。
胶颗粒与颗粒之间的缓冲液体积称为外水体积V外。
颗粒内的缓冲液所占据的体积称为内水体积V内。
胶面以下的部分空间（包括承接管）称为死空间——越小越好。
V0=V外+V内+胶体积。
蛋白质样品小心地铺展于胶面，待样品进胶后用洗脱缓冲液洗涤柱内壁，待洗涤液进胶后，再补加洗涤液至柱满为止，打开止水夹，开始洗脱。此时，一个混合蛋白质样
品中的大分子不能进入凝胶颗粒内，而在洗脱中随着外水体积下行，最早过柱，其洗脱体积=V外。
可以进胶的颗粒（分子）中，大的在胶颗粒中受阻大，常离开颗粒进入颗粒之外，也就是说，它们在胶颗粒内运行时间短，因此也被先洗脱下来。更小的分子在胶颗粒中运行距离长，停留时间也长，后于可进胶的大分子而依次被洗脱。最小的分子在胶颗粒中运行距离最长，停留时间也最长，最后被洗脱出来。最小分子的洗脱体积=V外+V内，（实际洗脱体积会更大些，因为蛋白质分子在Sephadex中除受分子筛效应外，还有一些空间的相互作用而影响洗脱体积）。
（二）、注意事项：
1．要根据所需纯化物质的分子量选择胶的孔径，见讲义。
2．胶要充分澎涨，并去掉小颗粒。
3．装柱要均一，胶面要平整，柱不能留有气泡（包括死空间）。否则得重装。
4．装完后上样前要用洗脱液平衡2倍体积以上。
5．要稳压，视所选择的胶的不同控制洗脱液排出口与洗脱瓶之间的高度差，并控制洗脱速度。
6．使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再上柱使用。
7．为防长霉，洗脱液要含0.1‰的叠氮钠。
8．澎涨后的胶要长期保存，应放置于4℃冰箱，并含NaN3。
9．需核酸蛋白质检测仪、部分收集仪和记录仪的使用说明书。
（三）、所获的纯化蛋白质可继续研究的内容：
1．通过生物质谱进行蛋白质的序列分析，并通过信息软件，了解该蛋白质的功能，与其他生物同类蛋白质进行比较，进行定量分析，大小，PI分析。
2．若为酶类的蛋白还可以进行酶最适PH，温度，离子类型及浓度，抑制剂种类及最低抑制浓度分析，酶反应动力学研究，竞争抑制类型研究，化学修饰分析。（要
求通过查阅资料进行实验设计）
3．可以结晶进行园二色性，X光衍射，顺磁，核磁共振谱研究——三维结构研究。
生物化学实验课教学大纲
生物化学实验课教学大纲 课程编码： 学时： 学分： 可成熟型：独立设课 开课单位：生命科学学院 先修课程：动物学、植物学、无机及分析化学、有机化学等 一、实验性质 生物化学专业实验是配合生物化学理论教学而设置的一门基础课程，分为基础实验、综合实验与创新实验。实验按照一学期进行设置，主要实验设置为生化基础实验和部分创新、综合实验。基础实验可使学生更好地掌握基本理论和基本实验技术，一般实验在学时内完成；综合实验要求学生运用所学知识解决实际问题，培养学生分析问题解决问题的能力；创新实验由学生自己动手查阅资料，拟定具体实验方案，提倡学生多思多问，有利于学生创新意识的培养，加强了收集信息、分析问题解决问题的能力。实验室全天开放。 二、实验教学目的和要求 生物化学专业实验是配合生物化学理论教学而设置的一门基础课程，通过实验课的教学，力求使学生能够对生物化学的基本理论和概念有更加深刻的认识，激发学生对探索生物化学规律的浓厚兴趣。更为重要的是，在实验过程中培养学生观察问题、分析问题和解决问题的能力，锻炼学生的实际操作能力。 三、实验项目名称和学时分配
四、实验项目具体内容 生物化学实验技术 实验项目一：皂化价的测定 实验目的：使用酸碱滴定法通过脂肪皂化价来推断分子量。 主要仪器：电子天平、水浴锅、冷凝管、酸碱滴定管。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习滴定分析法的基本原理，熟悉实验操作基本流程。 实验项目二：凯氏定氮法测定蛋白质含量 实验目的：掌握使用基本滴定原理和方法测定蛋白质含量和凯氏定氮仪的使用。 主要仪器：凯氏定氮仪、电子天平、通风橱、电炉、酸碱滴定管。
教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习“滴定分析的计算”章节内容，熟悉凯氏定氮法的基本原理。 实验项目三：的含量测定 实验目的：用滴定法测定并掌握水果和蔬菜中维生素的测定方法。 主要仪器：电子天平、研钵、移液管、酸碱滴定管。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习“滴定分析的计算”和“标准溶液”章节内容。 实验项目四：蒽酮比色法定糖 实验目的：学习分光光度计的原理合使用方法。掌握总糖定量测定的操作方法。 主要仪器：可见光分光光度计、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习分光光度法基本原理，了解分光光度计的基本构造。 实验项目五：血清总胆固醇的测定 实验目的：学习用分光光度法测定血清中总胆固醇（脂肪）含量及标准曲线的制作。 主要仪器：可见光分光光度计、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习分光光度法基本原理及其定量和定性的基本方法。 实验项目六：考马斯亮兰染色法测蛋白质 实验目的：学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度。 主要仪器：可见光分光光度计、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习分光光度法基本原理及其定量和定性的基本方法。 实验项目七：紫外吸收法测定蛋白质核酸含量 实验目的：学习利用紫外分光光度法对生物大分子进行定量分析度。 主要仪器：紫外可见分光光度计、电子天平。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习紫外分光光度计相关内容及其定量和定性的基本方法。 实验项目八：血清丙氨酸氨基移换酶测定 实验目的：学习利用比色法测定酶的活性。 主要仪器：分光光度计、冰箱、电子天平、水浴锅。 教学方式：讲授、操作。 预习要求：预习“酶活力及其动力学数据的测定”章节。 实验项目九：大蒜酶的提取及酶活力和含量测定
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
食品生物化学实验
食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时
二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
《生物化学》教案(完整)(最新整理)
教案 授课日期：年月日教案编号： 教学安排课型：新授课 教学方式：讲授性，主体参与教学 教学资源相关视频，图片，多媒体 授课题目（章、节）蛋白质化学 教学目的与要求： 1，掌握蛋白质的元素组成特点，氨基酸的结构通式； 2、掌握蛋白质一级结构、二级结构的概念、维系键； 3、掌握蛋白质的结构与功能的关系； 4、熟悉蛋白质物化性质； 5、了解蛋白质的与医学的关系； 重点与难点： 重点：蛋白质的元素组成特点，氨基酸的结构通式 难点：蛋白质物化性质 教学内容与教学组织设计：详见附页 课堂教学小结： 一、蛋白质的变性 1 、概念：天然蛋白质受到物理、化学因素的影响，导致其空间结构的破坏，从而使蛋白质的理化性质发生改变和生物功能的丧失称为蛋白质的变性作用。 2 、引起蛋白质变性的因素：物理因素、化学因素二、蛋白质的两性性质蛋白质中所带的正电荷与负电荷相等而呈电中性（此时为两性离），此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，常用pI 表示。三、蛋白质具有两性电离、胶体、变性和沉淀的性质。四、蛋白质的定性、定量测定方法有多种。五、蛋白质具机体的有三大功能:。不同状态下的机体对蛋白质的需求及代谢情况有差异。构成人体的氨基酸有20种，其中8种是体内不能合成的，需从饮食种摄取。 复习思考题、作业题： 医院杀菌灭毒的方式有哪些？这些方式和蛋白质变性有何关系？ 课后反思： 做好新课导入是成功教学的关键，尽量做到知识点讲解的深入简出，要注意结合日常生活知识和护理相关知识。
教学主要内容备注 绪论 生物化学就是生命的化学。它是研究活细胞和有机体中存在的各种化学分子及其所参与的化学反应的科学。分子生物学：是研究生物大分子结构、功能及其基因结构、表达与调控机制的科学。 一、生物化学发展简史 二、生物化学研究内容 1．生物分子的结构与功能 2．物质代谢及其调节 3．遗传信息的传递及其调控 三、生物化学与医学 1．生物化学与分子生物学在生命科学中占有重要的地 位 2．生物化学的理论与技术已渗透到医学科学的各个领 域 3．生物化学的发展促进了疾病病因、诊断和治疗的研 究 第一章蛋白质的结构与功能 一、蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。 蛋白质是细胞的重要组成部分，是功能最多的生物大分子物质，几乎在所有的生命过程中起着重要作用：1）作为生物催化剂，2）代谢调节作用，3）免疫保护作用，4）物质的转运和存储，5）运动与支持作用，6）参与细胞间信息传递。 二、蛋白质的分子组成 1. 蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S，各种蛋白 质的含N量很接近，平均16%。20mins 5 mins 5 mins 25 mins
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
生化实验基本原理及技术
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
生化实验三---阳离子层析教案
生物化学实验（下）实验三离子交换柱层析法分离氨基酸 华中科技大学生命科学与技术学院 2012级生物化学小老师第三组
离子交换柱层析法分离氨基酸 【实验目的】 1.学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 2.掌握离子交换柱层析的基本操作。 3.掌握氨基酸和茚三酮显色机理。 【实验原理】 1.离子交换层析原理 离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。 有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如： 这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。其中使用的最普遍的是离子交换树脂。由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即被分离。带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。 离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的PI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys 可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 2.茚三酮反应机理 茚三酮反应是指在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与羟脯氨酸或脯氨酸反应生成（亮黄色）化合物的反应。 该紫色化合物在570nm处有最大光吸收，所以可以利用分光光度计测量其含量。 由于该反应灵敏度高，目前已经广泛应用于氨基酸定性和定量的分析，国内的大部分教材认为其反应机理为：
生物化学实验内容
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生物化学实验指导
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
生化实验五大技术
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
生化试验技术
生化试验技术 绪论 1．生物体内某一组份，大致可分为五个基本阶段： (1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。 (2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。(3)材料处理及抽提方法的选择。 (4)分离纯化方法的摸索。(5)获得制备物以后，均一性的测定。 2 1 2 (1)呈色法；(2)色谱法；(3)光谱法；(4)电泳法；(5)核磁共振波谱法。 (6)其他:如电子显微镜观察。 理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。 3 3．好的分析鉴定方法必须满足以下要求: 1）特异性和专一性强；2）重现性好；3）准确度大；4）灵敏度高；5）手续简便。4．制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。5．材料的处理： 1）选材：（1）工业生产：材料来源丰富、含量高、成本低； （2）未知物质：只要达到实验目的即可。 2）预处理：保证材料的纯净； 3）组织破碎方法：（1）机械法：组织捣碎机，匀浆器，研钵和研磨、压榨机 （2）物理法：(1)反复冻融法(2)急热骤冷法： (3)超声波处理（3）化学及生物化学法：(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6．使生物活性物质保持活性，主要措施常有如下几点： 1）采用缓冲液。2）加入保护剂。3）抑制水解酶的破坏 4）一些特殊的措施：引起生物大分子变性的因素，如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免，有的还要求提取时无氧等。 第一章 1．蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？ 1）溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法； 2）分配系数不同：如分配层析法3）吸附性不同：如吸附层析法； 4）在电场中运动速度不同：如电泳法5）沉降系数或密度不同：如离心法； 6）分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法； 7）生物学特性不同：如亲和层析法； 2．蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项？ 蛋白质的分离提取的一般步骤为：一般来说，蛋白质的制备包括以下过程：
《生物化学》实验指导(8个实验)
生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室
内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)
实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？
生物化学实验
碘价的测定(Hanus) 法 三、实验原理 在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯起加成反应。脂肪分子中如含有不饱和脂酰基，即能吸收碘。100g脂肪所吸收碘的克数称为碘价。碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。由于碘与脂肪的加成作用很慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，使产生溴化碘，再与脂肪作用。将一定量(过量)的溴化碘(Hanus试剂)与脂肪作用后，测定溴化碘剩余量，即可求得脂肪之碘价，本法的反应如下：I2+Br2-->2IBr(Hanus试剂) IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr— KI+CH3COOH-->HI+CH3COOK HI+IBr-->HBr+I2 I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6 (滴定) 四、实验试剂及材料仪器 1、Hanus试剂：溶13.20升华碘于1000ml冰醋酸(99.5％)内，溶时可将冰醋酸分次加入，并置水浴中加热助溶，冷后，加适当之溴(约3ml)使卤素值增高一倍。此溶液储于棕色瓶中。 2、15％碘化钾溶液称取150g碘化钾溶于水，稀释至1000ml。 3、标准硫代硫酸钠溶液(约0.1N) 25g纯硫代硫酸钠晶体Na2S2O3．5H20溶（C·P以上规格)于经煮沸后冷却的蒸馏水中，稀释至1000ml，此溶液中可加入少量(约50mg)Na2CO3，数日后标化。 标化方法：精密称取在1200C干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15—0.20g 2份，分别置于两个500ml碘瓶中，各加水约30ml使溶解，加入固体碘化钾2.0g及6NHCl l0 ml：混匀，塞好，置暗处3分钟，然后加入水200ml稀释，用Na2S203滴定，当溶液由棕变黄后，加淀粉液3ml，继续滴定至呈淡绿色为止，计算Na2S2O3溶液的准确浓度。滴定的反应： K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2O I2+2S2O2-—>2I-+S4O2- 4、1％淀粉液 五、实验方法 准确称取0.2g脂肪，置于碘瓶(图5中)，加10ml氯仿作溶剂，待脂肪溶解后，加入Hanus试剂20ml，(注意勿使碘液沾在瓶颈部)，塞好碘瓶，轻轻摇动，摇动时亦应避免溶液溅至瓶颈部及塞上，混匀后，置暗处(或用黑布包裹碘瓶)30分钟，于另一碘瓶中置同量试剂，但不加脂肪，作空白试验。 60分钟后，先注少量15％碘化钾溶液于碘瓶口边上，将玻塞稍稍打开，使碘化钾溶液流入瓶内，并继续由瓶口边缘加入碘化钾溶液，共加20ml，再加水100ml，混匀，两个样品一起加入，终止反应。随即用标准硫代硫酸钠溶液滴定。初加硫代硫酸钠溶液时可较快，俟瓶内液体呈淡黄色时。加淀粉液1ml，继续滴定，滴定将近终点时(蓝色已淡)，可加塞振
生物化学教案
基础生物化学教案 [说明：◆对于生物技术、生物工程专业学生(第一类授课对象)：授课学时70-76，实验44-50学时；对于农学、园艺、资环、林学、食品科学本科生(第二类授课对象)：授课学时54-60，实验30-46学时；?第一类授课对象理论学时取上限，第二类授课对象，理论学时取下限，具体由授课教师按照学员实际情况合理掌握内容讲解的难易程度，合理布置课外作业，准确把握进度，按期完成教学任务。] 第一部分：理论教学内容 第一章绪论（1学时） 1.阐明生物化学的概念、研究内容及发展，使学生了解生物化学学科基本内容； 2.介绍生化知识的应用，激发学生的学习热情； 3.简要介绍学习方法（具体到某个章节）。 第二章蛋白质（10～12学时） 本章重点：蛋白质的分子结构、重要性质及结构与功能的关系。明确蛋白质结构的不同层次之间的联系，为进一步学习酶和信息代谢奠定基础 1．关于氨基酸重点讲授20种基本氨基酸的结构及重要性质，注意： （1）要求学生记住20种基本氨基酸的结构及三字母缩写。近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白质氨基酸。 （2）氨基酸的滴定曲线以丙氨酸为主来讲，简单介绍两种侧链可解离的氨基酸（组氨酸和谷氨酸）滴定曲线。 提问：pH=pK a时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小，为什么？His在生理pH条件下为什么是唯一具有缓冲能力的氨基酸？ （3）氨基酸的等电点计算公式应用 提问：不同pH下的组成分析和电泳行为？ pH>pI时，氨基酸带负电荷，Aa-COOH解离成Aa-COO-，向正极移动。pH=pI时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小pH 生物化学实验思考题 ————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期: 生物化学实验考试试题 细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 ３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？ 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 ４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 ５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则 第二章生化实验基本技术 第一节离心分离技术 离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 一、离心原理 离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 (一)离心力和相对离心力 离心力的单位为g，即重力加速度(980.6cm/S2)，离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算：g=r×V2×1.118×10或按下式计算所需的转速：()r 89445 =。 ? V／ g 离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动，从而产生一个强大的辐射向外的离心力场，它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度，使之受到一个外向的离心力，其定义为： F = mω2r 式中：F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；ω为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的生物化学实验思考题
生化试验基本技术