KOD酶 使用说明书

用高成功率PCR酶「KOD FX」

对发根样品的简便扩增例TOYOBO Co.,LTD 敦贺生物研究所 杉山 明生

『KOD FX 』是在拥有各种优良特性的PCR 酶「KOD DNA polymerase 」的基础上开发的高性能PCR 酶。本酶具有出色的「扩增成功率」、「扩增效率」和「延伸性」，可在各种扩增实验中得到确实有效的PCR 产物。尤其是其出色的扩增成功率，在以粗样品为模板的PCR 中可得到充分的发挥。

比如，我们已通过实验确认，即便将全血、培养细胞等直接添加到PCR 反应液中，仍可得到良好的扩增。扩增Mouse tail 、植物样品（叶块、米粒）时，只需将经简单前处理后配制的Lysate 添加到PCR 反应液中，即可获得确实有效的扩增产物。也就是说，原来需事先从样品中纯化DNA 再进行PCR 实验的传统方法，如果使用『KOD FX 』，则无需进行DNA 纯化，只需简单的前处理即可进行PCR 扩增。

本篇中，作为粗样品和微量样品的实验例代表，我们尝试对发根样品进行简便的PCR 扩增。由于发根样品可通过非侵袭性得到，因此不仅在法医学领域被应用，也在分子生物学实验中被应用。但由于发根样品的量很少，因此DNA 含量也很少，而且毛发中的黑色素是抑制PCR 反应的物质，如进行DNA 纯化，则对技术和人力的要求非常高。在这里，我们通过将『KOD FX 』和碱裂解法组合使用，不从发根样品中纯化DNA ，尝试进行简便的PCR 扩增。以下为该实验的方法及结果。

（1）通过碱裂解法配制发根Lysate

（2）PCR反应

反应液组成

发根 Lysate 人类循环

方 法

将人的头发从发根处开始2mm 的地方切断，包含发根的部分作为样品。用这样的样品5根，按图1所示的碱溶解法配制Lysate 。请注意，用本方法不能使发根完全溶解（也无需完全溶解）。另外，溶解液的核酸浓度无法测定。

取（1）配制的Lysate 2μl 直接添加到PCR 反应液中，

按如下条件进行反应。发根（参照上图）5根

添加50mM NaOH 18 、Vortex充分振荡

添加1M Tris-HCl（PH8.0）2 、Vortex充分振荡

取2 上清进行PCR反应

※接触热碱性溶液时，请十分注意。

图1.发根Lysate的配制方法（碱裂解法）

温育使用人类头发的发根开始约2mm的部分※1 引物的Tm值未满73℃的情况下，推荐使用包含「Tm-5℃、30sec.」退火步骤的三步法。※2 以1min./kb为基准设定

为进行比较，同时用其他公司Taq Base PCR酶，按其使用说明书推荐的条件进行PCR（为同样40个循环）。

前 言

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经纯化的人类基因组DNA 5ng 作为模板使用

?????

Taq Base PCR 酶

A 公司高效率PCR 酶

B 公司Long PCR 酶

发根Lysate

未加入发根配制的Lysate

图2.发根Lysate 直接PCR 的结果

取PCR 产物5μl 添加到1%的琼脂糖凝胶中进行分析（图2）。结果可见，只有在使用『KOD FX 』的情况下，才能确认到明亮的扩增条带。而作为比较的Taq Base PCR 酶，虽然使用经纯化的基因组DNA 的阳性对照可确认到扩增，但以发根Lysate 为样品的情况下，几乎看不到扩增条带。

由于发根样品中所含DNA 量非常少，扩增该DNA 时，一般以细胞中拷贝数较高的线粒体DNA 为目的片段。但在本实验中，使用KOD FX ，以简便的「碱裂解法」配制的Lysate 为模板，可扩增核DNA 上相对较长的1.3kb 的目的片段。由此可见，与原来的Taq Base PCR 酶相比，KOD FX 不但在扩增粗样品方面有很强的能力，而且在扩增效率方面也有着压倒性的优势。

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从发根等微量样品纯化DNA ，不但需要很高的技术，而且会耗费大量的精力。同时，DNA 抽提的步骤越多，发生交叉污染的危险性越高，多个样品的处理也非常困难。而用上述的「碱裂解法」则可在短时间内配制好PCR 用的样品，与KOD FX 组合使用，可实现简便、迅速的微量样品基因扩增。当您需要用微量生物样品进行PCR 实验时，请务必尝试一下本方法。

Mouse tail 、

植物样品实验例请登录本公司中文网站https://www.wendangku.net/doc/2317113111.html, FX Corner 品名及内容包 装

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保存温度TOYOBO Code 价 格次份

次份

支RMB 1,200RMB 5,500RMB 50

*表示反应体系为50μl 时的反应次数。

※由于用KOD FX 扩增的目的片段已被平滑化，不能进行通常的TA 克隆。推荐使用本公司的高效率TA 克隆试剂盒TArget Clone -Plus-。相关产品

次份KOD 用高效率TA 克隆试剂盒RMB 380

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