大规模动物细胞培养的问题及对策
大规模动物细胞培养的问题及对策
大规模动物细胞培养的问题及对策
动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。
1.细胞培养环境
细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转换，从而导致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也导致低浓度丙酮酸，从而导致Gln消耗减少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量产生减少，更多的能量用于维持离子浓度梯度，因此高乳酸浓度必将抑制细胞生长。氨和乳酸对细胞的毒性作用已在多种不同的细胞系有大量报道，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良生长环境下，细胞转换代谢途径，特别是氨基酸代谢的改变。由于Gln和葡萄糖代谢的相互影响，因此降低培养基中葡萄糖浓度以减少乳酸产生的同时，必须平衡葡萄糖和Gln的比例。这些代谢改变机理的研究将有利于设计适当的控制方案。随着细胞培养规模和培养密度的增大，由于二氧化碳的产生速率比通过换气从培养基中去除二氧化碳快因而导致CO2积聚，从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。CHO细胞大规模培养的生物反应器中，最适CO2水平为4%～10％。当达到14％时便会阻碍细胞生长。在一定的pH条件下，CO2分压升高会使培养基渗透压升高。常规/高渗透压条件下，高CO2分压使重组CHO细胞系的生长和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)产率均受到抑制。当CO2分压升高时，tPA糖链中包含N-羟乙酰神经氨酸的唾液酸比例稍下降，但tPA的总唾液酸含量、其他单糖含量、tPA的I型II型相对含量、表面电荷分布和高－甘露糖单糖比例等影响产品质量及一致性的因素在高CO2条件下也没有改变。这表明CHO细胞生产tPA具有很强糖基化能力。尽管如此，控制通气参数，平衡氧的输送及CO2的去除，防止生物反应器运转中CO2积聚仍是明智选择。
甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代谢产物，也是脂类、氨基酸代谢的产物，对于细胞有潜在的损伤作用。MG能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基。细胞内MG的水平由乙二醛缩酶和还原酶两种酶的活性来平衡，代谢途径是糖酵解途径。葡萄糖浓度很高(100mM)时，细胞内MG几乎是正常培养条件下的两倍。增加培养基中谷氨酰胺浓度也会引起MG中度增加。用***假单胞菌乙二醛缩酶基因转染的CHO细胞中乙二醛缩酶活性增长至三倍多，MG浓度比野生型CHO低。然而，MG浓度降低的细胞与在典型生物反应器培养条件下的细胞的生长活力有何不同尚未确定。通过批次培养中限制葡萄糖用量来降低葡萄糖消耗，由此来确定降低糖酵解代谢是否导致细胞内MG浓度降低，从而最终确定MG浓度降低是否提高培养活力或影响产品特性的研究具有重要意义。另外，培养基中加入胎牛血清可降低MG浓度。不管用NaCl、KCl还是蔗糖升高渗透压，均可增加批次培养中抗体浓度。细胞系间产率增加幅度不一，对骨髓瘤细胞影响较小。高渗透压不仅影响细胞批次培养中抗体或tPA产量，而且影响细胞生长速度、对数
生长期的长短、细胞死亡的速度。由于细胞生长环境不断变化，有关渗透压影响的量化进展不大。然而，在大约400mOsm的范围内，细胞虽然生长减慢，但特定抗体产生增多，细胞浓度增大导致最终高产品浓度。另外，在培养基中加入诸如甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸或脯氨酸等渗透压保护剂在一定程度上减轻了高渗透压对细胞的生长抑制作用，但不影响细胞表达目的蛋白质的水平，同时可使细胞较长时间的维持高水平表达。多孔微载体的研制替代了容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。为创造更大优势，多孔微载体内部保护空间必须保证细胞能够进入生长。对于有些细胞株尽管能贴在微载体内，但“移动性”很差，因此需要发明一种更好的培养方式，提高微孔的开放性或者改善其表面特性，从而提高细胞贴壁率同时增加细胞移动性。细胞死亡与凋亡
大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是细胞凋亡。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节，预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。
用基因工程方法将bcl-2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞，成为众多研究者的选择。bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量,这对于细胞大规模培养具有重大意义。对细胞的这种保护作用依赖于bcl-2等抑制基因的高水平表达。因此，需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因。
在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。方法是向CHO细胞中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长(细胞静止)，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。
3培养基与细胞系动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。在细胞早期培养阶段，细胞对于无血清培养基的适应性往往是克隆特异性的，每个新的克隆常需要重新配制培养基和适应过程。最近研究表明，先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养，然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力，其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。
有些细胞株依赖于血清源性生长因子的特性可通过分子遗传途径予以改变，即导入特异生长因子的基因，使细胞能合成自身的生长因子来满足细胞生长需要，而对细胞生长无副作用。另外，导入一些基因改变细胞生长周期的调控也可使细胞在无血清/蛋白的培养基中生长。
通过细胞工程方法使细胞高水平表达外源基因并正确加工表达产物，从而提高整个表达系统的产率，也成为应用大规模动物细胞培养生产外源目的蛋白的研究的重要手段。这种潜在的目标便是改变细胞的蛋白加工能力。tPA表达水平及分泌效率均和它与内质网膜上的结合蛋白(BiP)这种分子伴侣的结合程度负相关。通过表达反义BiP转录物，tPA突变体与BiP的结合减少而分泌增加。在CHO细胞中通过稳定转染并过量表达BiP，阻止了未糖基化tPA突变体的分泌。因此，控制细胞中的分子伴侣能够使细胞正确折叠、组装、定位、分泌新合成的重组蛋白从而提高产量。
另外，控制外源基因表达的启动子的特性是基因表达的基础之一。强的启动子成为众所周知的选择。但是，SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子调控基因表达均发生在S期，CHO细胞中腺病毒主要晚期启动子(AMLP)调控外源基因表达是在G1期。对于利用重组动物细胞生产外源蛋白而言，S期表达需要提高
细胞的生长速率，在批次或灌流培养中会严重降低产量；G1期表达将使细胞在高密度培养条件下保持较低生长速率而大量生产蛋白。构建细胞系时，细胞周期特异表达调控具有重要研究和应用意义。
4过程监控
大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。离线取样测定特别是产物浓度测定往往需要一天的时间，因此这种测定结果，不能用来及时指导生物反应器有关参数的控制和细胞培养环境的优化，而且频繁取样容易造成污染，增加费用。因此在线测定生物反应器中培养条件、代谢产物和目的产物浓度等大量数据，并对测定结果进行分析处理，及时对培养系统进行反馈性控制是成功进行大规模动物细胞培养的需要。
在生物反应器中，温度、pH值、溶解氧浓度是细胞培养规模放大的早期研究内容。现在，这三个参数对细胞的影响已经明确，并在培养过程中实行了有效控制。
最近几年中有关细胞培养过程监控的研究迅速增多。测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷和控制；测定氧吸收速率估测ATP的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等等众多特定参数均得以测定并加以应用。细胞呼吸商似乎是衡量细胞生理状态的潜在的有用参数，可测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。
用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定的方法已经完成。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性也成为一项有应用价值的技术。
5结论与展望
可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定克隆的方法。细胞培养营养需要的重点将继续朝着维持或增加产品质量及一致性上努力。基因改建在筛选、扩增目的基因及控制其表达或增强细胞寿命等方面显示出强大生命力。改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养/控制模式将会在现有基础上不断产生。不断成熟的大规模动物细胞培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。
动物细胞的灌注养方法
动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比, 动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题, 大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术, 提高动物细胞大规模培养的产率, 一直是国内外研究的热点之一。
1灌注培养
常用的动物细胞培养方法有分批培养、补料分批培养、连续培养, 但产率一直不高。直到六十年代, 灌注培养技术的出现, 为动物细胞高密度大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的三十年中, 灌注培养技术得到了迅速地发展, 已成为动物细胞大规模培养的主要方法。
在灌注培养中, 细胞保留在反应器系统中, 收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分, 并可带走代谢产物, 同时, 细胞保留在反应器系统中,可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可以提高一个数量级, 并可大大降低劳动力消耗。
灌注培养主要可分为两大类: 悬浮灌注培养和床层培养(图1)。悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上, 加上一个细胞分离器而成, 以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见。床层培养则把细胞直接保留于床层, 不需要细胞分离器, 其中堆积床和大孔载体培养的应用较广。
2灌注培养方法
在灌注培养前, 对动物细胞的生长和生理特性进行充分的考察, 是十分必要的, 能为灌注培养提供有益的参考。以比生长速率为例, 大量实验表明, 细胞的比生长速率降低时, 产物的比生长速率提高，有人控制细胞的比生长速率为最大比生长速率的60%抗体生长速率增加了97%。灌注培养可以从两个方面入手, 一是改变动物细胞的培养环境, 实行阶段培养; 二是进行代谢调控。
2. 1阶段培养
一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。
2. 1阶段培养
一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。
2. 1. 2pH 值阶段培养
对大多数动物细胞, 培养液中合适的pH为7. 2—7. 4。低于6. 8 或高于7. 6 对细胞的生长都不利。近年来, 对胞内pH 的研究比较活跃。实验发现胞内pH 对细胞的代谢影响很大, 胞内pH 降低0. 2 个单位, 就足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途径, 使细胞的生长受阻; 而胞内pH 升高0. 2 个单位,可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培养液中铵离子浓度的提高, 都能引起胞浆酸化, 胞内pH 降低。有人把CO 2 的浓度由5% 降为2. 5% ,胞内pH 提高了0. 2 个单位。胞内pH 比胞外pH 的检测麻烦, 所以还没有广泛应用。
2. 1. 3溶氧阶段培养
不同细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均不相同.有人发现细胞生长的最适溶氧值为60% , 但有人发现杂交瘤的最适溶氧为100%。一般说来, 溶氧主要影响细胞的繁殖, 而对产物的生成无直接影响, 通过影响细胞生长间接起作用。通常在细胞生长初期控制溶氧的较低的水平, 在对数生长期, 当细胞达到较高的浓度时, 提高溶氧水平; 在产物生成期, 应控制溶氧的适当水平。溶氧过高, 细胞就会加速消耗营养物质, 产生许多代谢产物。这些代谢产物对细胞有抑制作用, 会大大降低细胞的存活率, 降低产物的比生成速率。溶氧过低, 细胞过氧的需求得不到满足, 依然会降低产物蛋白的产率。
2. 1. 4化学试剂诱导阶段培养
如果构建的细胞上有可诱导基因, 进入产物生成期后, 就可以添加化学试剂对基因进行诱导, 以实现目的基因的高表达, 比如,将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置于同一载体, 分别受金属硫(M T ) 和SV 40 早期启动子控制, 具有用氨甲喋呤(M TX) 使基因扩增和利用金属Zn2+ 诱导的双重功能, 有利于尿激酶的高表达。
细胞在细胞周期的不同时期, 不仅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的类型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制细胞的生理状态很重要。然而, 在细胞培养中, 细胞生理状态的检测很麻烦。有人发现,细胞大小随各时期变化很明显, 因此可以作电子细胞计数器就行了。分段培养应结合具体的培养条件进行。
有些细胞的最适生长温度和产物生成温度相同, 就不能进行温度阶段培养, 而应寻找别的差异条件。在细胞生长期有的细胞可能会因比生长速率过大而产生非生产性细胞, 这时就应控制比生长速率在一个适当的范围。
3代谢调控培养
乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢产物, 对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培养和补料分批培养中的这一问题尤为突出。尽管灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物。但是, 一方面由于灌注培养细胞浓度很高, 提高灌注速率, 营养成分的供给十分充分, 氨和乳酸的产生速率也增加了。另一方面, 过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率, 降低产物的比产率, 加上细胞对营养的利用并不彻底, 培养液中会残留大量的蛋白, 造成提取纯化的不便和培养基的浪费。所以, 在培养中调控动物细胞的代谢途径一直较受重视。通过代谢调控, 可以减少副产物的产生, 降低细胞的死亡速率, 还可以控制灌注速率和培养液成分, 控制细胞的状态和比生长速率, 以提高目标蛋白的产率。具体有以下方法。
3. 1控制葡萄糖浓度法
乳酸浓度升高,会导致比生长速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半乳糖, 还可限制葡萄糖减少乳酸的生成, 使初始葡萄糖浓度较低, 在培养过程中再添加。在控制葡萄糖浓度法培养中, 生长期可以使葡萄糖浓度稍高, 以促进细胞生长; 在产物合成期降低葡萄糖的浓度, 降低乳酸的产生速率, 避免乳酸的积累, 减少毒害, 降低死亡速率, 维护持活细胞数在较高水平。同时还可以降低比生长速率, 增加目标蛋白的产生速率。
灌注葡萄糖的同时, 要间歇或连续地加入其他组分, 以避免营养缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在较低水平, 因为细胞的生长不依赖糖酵解, 即使没有葡萄糖, 细胞仍可以通过降解谷氨酰胺获得能量。假如谷氨酰胺的浓度过高, 细胞就会偏向谷氨酰胺酵解, 从而削弱这种方法的效果。由于葡萄糖的价格相对低廉, 这种方法很有前途。
3. 2控制谷氨酰胺法
上面提到, 没有葡萄糖, 细胞可以利用谷氨酰胺作能量物质。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 应用这一方法的报道也较多。控制谷氨酰胺浓度的目的, 主要是减少氨的产生。氨对细胞的毒性比乳酸大得多, 表现为降低比生长速率, 增加死亡速率。有人详细地研究了动物细胞的代谢过程, 采用底物限制补料分批工艺对动物细胞进行代谢控制。他采用这一方法, 使氨的浓度降低了一半。控制谷氨酰胺法与控制葡萄糖法一样, 要维持葡萄糖在较低水平。
3. 3控制葡萄糖和谷氨酰胺法
在细胞中, 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。葡萄糖消耗上升, 则谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相当大的一个范围内, 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与其浓度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生, 还能有效控制比生长速率。在细胞生长期, 提供充分的营养, 供细胞的需要; 在产物合成期, 降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度或流量, 降低比生长速率, 增加目标蛋白的产率。
3. 4代谢产物的去除
通常使用透析膜, 超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵离子。有人建议加化学试剂比如钾盐来消除氨的影响, 也有人建议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞。
灌注培养发展到现在, 还有许多急待解决的问题。其最大的缺点是培养基的利用不充分, 造成一定的浪费。随着细胞培养技术和产品分离技术的进一步发展, 建立细胞培养与产物分离的耦合系统(图2) , 能充分利用培养液, 降低生产成本, 一直是人们追求的目标, 这里就不赘述。
生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
1.测定------分子量、PI
当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液
的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。
2.选择------层析方法
若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
一] 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份。
二] 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。
三] 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。
3.纯化------大量粗品
处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow 等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。
4.纯化------硫酸氨样品
硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。
5.纯水-----糖类分子
固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。
6.纯化------膜蛋白
膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。
7.纯化------单抗、抗原
*单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP 或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。
*疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。
*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。
8.纯化------重组蛋白
重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
一] GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
2．蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF
纯化。
二] 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。9.纯化------包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。
10.包涵体蛋白固相复性
*近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。
*固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。
11.纯化------中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
*生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
*一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。
12.纯化------肽类
肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。
13.纯化------核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose 或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、SOURCE Q分离核酸。
14.纯化------寡核苷酸
寡酸苷酸多应用在反义(anti-sense)DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。15.脱盐、小分子去除
使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting（5ml）可用针筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。
16.疫苗纯化
使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗，去除培养基中的杂蛋白，处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。
18.纯化-基因治疗用病毒载体
SORRCE 15Q
19.纯化-基因治疗用质粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect
在下游纯化中,可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时,去除各种污染物。
1.去除——内毒素
内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。
内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒（17-1349-01）可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL，PMB，自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。
胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads,SP或CM Sepharose FF,SP SepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高盐下会和蛋白解离,疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白,在纯化蛋白的同时去除核酸。
利用核酸酶将核酸切成小片断,用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成为病原,应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D（solvent/detergent)处理，使病毒失活，如Triton和Tween。再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白，去除S/D。
其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活，凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质,可去除多种微量污染物。