实时定量荧光PCR检测白血病融合基因_李晓进

文章编号(A r t i c l e I D ):1009-2137(2009)04-0969-05　·论著·

实时定量荧光P C R 检测白血病融合基因

李晓进,喻镁佳,梁洋1

,何迪,李斌,胡杰,陈琪,李惠民

云南省第二人民医院血液科;1

云南省43医院血液科,云南昆明650021

摘要 本研究旨在建立实时定量荧光P C R 的方法并检测C M L 、A L L 、A P L 患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患

者连续监测融合基因转录表达水平。结果表明:在82.4%(28/34)的C M L 患者中检测到B C R -A B L P 210

阳性(B C R -A B L P 210/A B L 比值为0.01～3.19),其中在1例C M L 急淋变患者检测到B C R -A B L P 210和B C R -A B L P 190双阳性;在66.7%

(4/6)的A L L 患者中检测到B C R -A B L 阳性,其中2例B C R -A B L P 210阳性,2例B C R -A B L P 190

阳性;在77.8%(7/9)的

A P L 患者中检测到P M L -R A R a 融合基因阳性(P M L -R A R a /A

B L 比值为0.0014～3.199),其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论:实时定量荧光P

C R 技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。关键词 白血病;融合基因;实时定量R T -P C R 中图分类号 R 733.7;Q 503

文献标识码 A

D e t e c t i o na n dQ u a n t i f i c a t i o no f A b e r r a n t L e u k e m i aF u s i o nG e n e b y R e a l -t i m eR T -P C R

L I X i a o -J i n ,Y U M e i -J i a ,L I A N GY a n g 1

,H ED i ,L I B i n g ,H U J i e ,C H E NQ i ,L I H u i -M i n

D e p a r t m e n t o f H e m a t o l o g y ,T h e S e c o n dP e o p l e H o s p i t a l o f Y u n n a n P r o v i n c e ,1D e p a r t m e n t o f H e m a t o l o g y ,T h e 43r d H o s p i t a l o f Y u n n a n P r o v i n c e ,K u n m i n g 650021,Y u n n a n P r o v i n c e ,C h i n a C o r r e s p o n d i n gA u t h o r :L I H u i -M i n ,S e n i o r P h y s i c i a n ,T e l :(0871)5156650-2593.

E -m a i l :l i h u i m i n @m e d m a i l .c o m .c n

A b s t r a c t T h i ss t u d yw a sp u r p o s e dt os e t u pr e a l -t i m eq u a n t i t a t i v eR T -P C R t e c h n i q u ea n dt om e a s u r el e u k e m i a f u s i o n g e n e t r a n s c r i p t s i np a t i e n t s w i t hc h r o n i cm y e l o i dl e u k e m i a(C ML ),a c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a(A L L )a n d a c u t e p r o m y e l o c y t i c l e u k e m i a (A P L ).A l l p l a s m i d s c o n t a i n i n g t h e t a r g e t g e n e s e q u e n c e s w e r e c o n s t r u c t e dt o e s t a b l i s ht h e s t a n d a r dc u r v e s .A T a q Ma n b a s e d r e a l -t i m eq u a n t i t a t i v eR T -P C R w a sp e r f o r m e d t o m e a s u r ea b e r r a n tf u s i o n g e n e t r a n s c r i p t s i n 130s a m p l e s o f p e r i p h e r a l b l o o d(P

B )o r b o n e m a r r o w (B M)f r o m 49p a t i e n t s w i t h l e u k e m i a .T h e r e s u l t s

s h o w d t h a t t h eB C R -A B L P 210

t r a n s c r i p t s w e r ed e t e c t e di n 28(82.4%)o u t o f 34C MLp a t i e n t s (t h er a t i o s o f B C R -A B L P 210/A B Lv a r i e df r o m 0.01t o 3.19)a n d a l s oi n 2(33.3%)o u t o f 6A L Lp a t i e n t s .T h e B C R -A B L P 190t r a n s c r i p t s

w e r ed e t e c t e di n 2(33.3%)o u t o f 6A L Lp a t i e n t s .T h e B C R -A B L P 210a n d B C R -A B L P 190

t r a n s c r i p t s w e r e b o t h d e t e c t e d i n 1(2.9%)C MLp a t i e n t s .T h e P ML /R A R αt r a n s c r i p t s w e r e d e t e c t e di n 7(77.8%)o u t o f 9A P Lp a t i e n t s (t h e r a t i o o f P M L -R A R a /A B Lv a r i e d f r o m 0.0014t o 3.199).T h e r e l a t i v e f r e q u e n c y o f b o t hb c r 1a n db c r 3w a s 42.9%,w h i l e t h a t o f b c r 2w a s 14.3%.T h et r a n s c r i p t l e v e l o f a b e r r a n t f u s i o ng e n e v a r i e df r o m t h ec l i n i c a l s i t u a t i o no f p a t i e n t .I t i s c o n c l u d e d t h a t r e a l -t i m e q u a n t i t a t i v e P C R i sa r e l i a b l e ,i n n o v a t i v ea n dp r o m i s i n gt e c h n o l o g yw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n d s p e c i a l i t y .I t h a s p o t e n t i a l c l i n i c a l v a l u e f o r d e f i n i n g d i a g n o s i s ,t y p i n g t u m o r ,s e l e c t i n g t r e a t m e n t ,m e a s u r i n gt h e t u m o r l o a d ,m o n i t o r i n g f u s i o n g e n e e x p r e s s i o n l e v e l a n d e v a l u a t i n gt h e r a p e u t i c s t r a t e g i e s ,w h i c h i s w o r t h y t o b e p o p u l a r i z e d .K e yw o r d s l e u k e m i a ;f u s i o ng e n e ;r e a l -t i m e q u a n t i t a t i v e R T -P C R

J E x p H e m a t o l 2009;17(4):969-973

通讯作者:李惠民,主任医师.电话:(0871)5156650-2593.E -m a i l :l i h u i m i n @m e d m a i l .c o m .c n 2008-12-25收稿;2009-02-13接受

随着血液学的分子生物学研究不断深入,人们

发现很多血液病都与基因异常密切相关[1-3、5、10]

,常

见的有b c r -a b l P 210、b c r -a b l P 190

、p m l -r a r α、a m l 1-e t o 、c b f β-m y h 11、m l l -a f 4、t e l -a m l 1等基因断裂重排,甚至于某些异常基因已经被认为是某种血液肿瘤发生的

起因或者成为了某类血液病的分子标志[2、3、4]

,如

b c r -a b l P 210

是慢性粒细胞白血病的分子标志,b c r -

a b l P 190

是急性淋巴细胞白血病分子标志,p m l -r a r α是

急性早幼粒细胞白血病分子标志等等。定量检测这些异常基因对于临床明确诊断、具体分型、动态观测

·

969·中国实验血液学杂志　J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l H e m a t o l o g y 2009;17(4):969-973

肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有

重大意义[6-7、13-14、18-19]

。新近发展起来的实时定量逆转录P C R (r e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P C R ,R Q R T -P C R )是在普通定性P C R 基础上发展起来的核酸分子定量技术,基因扩增、光谱技术、计算机技术相结合使此种技术敏感性与特异性大为提高,比普通的P C R 特异性更强,且能有效解决P C R 污染问题,尤其是通过动态定量监测,比单次阳性结果更

有意义[8-9、18]

。

我们建立了b c r -a b l P 210、b c r -a b l P 190

、p m l -r a r α融合基因的R QR T -P C R 检测技术,并利用该技术检测了我院和云南省43医院血液科自2007年7月到2008年6月收集的慢性髓系白血病(C M L )、急性淋巴细胞白血病(A L L )和急性早幼粒白血病(A P L )共49名患者骨髓及外周血标本130份,其中部分标本为同一患者连续采集。现将结果报告如下:

材料和方法

肿瘤细胞株K 562(含b c r -a b l b 3a 2融合基因转录表达P 210融合蛋白),N B 4(含p m l -r a r αL 型融合基因)。白血病患者骨髓、外周血标本获自慢性髓系白血病(C M L )34例,急性淋巴细胞白血病(A L L )6例,急性早幼粒白血病(A P L)9例。全部病例为我院血液科和云南省43医院血液科患者,其诊断依据F A B 分型标准(临床表现、血液和骨髓检查指标)。骨髓穿刺法取白血病患者骨髓细胞,外周静脉血抽取外周血细胞,E D T A 抗凝,经1.077g /m l 密度F i c o l l 分离获取取单个核细胞,经P B S 洗涤后静置备用。健康人外周血单个核细胞

取4例体检正常的健康成人外周血,E D T A 抗凝,经1.077g /m l 密度F i c o l l 分离获取单个核细胞,经P B S 洗涤后静置备用。总R N A 提取和逆转录分别从肿瘤细胞株、白血病患者单个核细胞、正常人P B M N C 中提取总R N A 并合成c D N A 。用T R I Z O L 试剂(美国I n v i t r o g e n 公司产品)严格按说明书操作抽提总R N A ,测定浓度和纯度,稀释至0.2μg /μl 备用(浓度过高的稀释至1μg /μl )。逆转录采用M M L V 逆转录酶(美国I n v i t r o g e n 公司产品),200U /反应。

引物设计

用美国A B I 公司P r i m e r E x p r e s s 3.0自行设计质粒标准品构建所需的引物,定量所需引物和探针序列均采用欧洲抗癌协会推荐的定量标准化方案中的序列。所有引物和探针均由上海生工公司合成。质粒标准品构建

B C R -A B L P 210

阳性标准品采用K 562细胞株c D N A ,

B C R -A B L P 190

采用B C R -A B L e 1a 2型强阳性患者骨髓标本,P M L -R A R αL 型采用N B 4细胞株c D N A ,P M L -R A R αS 型采用P M L -R A R αS 型强阳性患者骨髓标本。用美国A B I 公司P r i m e r E x p r e s s 3.0在断裂融合位点上下游各约300b p 位置设计引物,引物序列及P C R 扩增产物长度见表1。将各型P C R 产物分别做2%琼脂糖凝胶电泳,并用A x y g e n 公司P C R 产物凝胶回收试剂盒割胶回收P C R 产物,测序证实含预期的融合基因后,将回收纯化的P C R 产物插入质粒载体p G M -T (北京天根生物技术公司产品),连接完成后将其转化感受态细胞E .c o l i T O P 10,然后接种至含氨苄青霉素的L B 细菌培养板,37℃培养过夜,挑取单菌落半个进行P C R 验证。如果为阳性,将剩下的半个菌落液体振荡培养,取部分菌液进行P C R 验证;如阳性,取部分菌液在L B 培养皿上划线培养,挑取单菌落,重复3次,均为阳性,则扩大培养,部分冻存留种,部分用美国A x y g e n 公司的质粒抽提试剂盒抽提质粒配制标准品。

取纯化浓缩的质粒测定吸光度,根据测得的A 260值和计算出的重组质粒的分子质量(M W),换算成质粒的拷贝浓度(c o p y /μl ),换算公式:C =

(A 260×1.70×1013

×2686)/M W 。将母液浓度调整至1×1010

c o p i e s /μl 作为原液,并取部分原液作10

倍系列稀释成106-100

c o p i e s /μl 的梯度浓度标准

品,进行实时定量荧光P C R 制作标准曲线,其余分装冻存备用。

P C R 扩增定性P C R 仪采用B I O -R A D 公司i c y c l e r ,质粒标准品构建时P C R 反应体系为:10×P C Rr e a c t i o nb u f f e r

2.5μl ,50m m o l /LM g 2+

0.75μl ,10m m o l /Le a c h d N T PM i x 0.5μl ,10μm o l /L 上下游引物各0.35μl ,I n v i t r o g e n 公司h o t -s t a r t T a q 酶1U ,c D N A 模板5μl ,用去离子水补足至25μl 。P C R 循环参数为:95℃预变性5分钟,94℃变性30秒,63℃(B C R -A B L )/61℃(P M L -R A R a )退火30秒,72℃延伸60秒,40个循环后72℃延伸3分钟结束反应。

·

970·中国实验血液学杂志　J E x p H e m a t o l 2009;17(4)

T a b l e1.S e q u e n c e s o f p r i m e r s a n dp r o b e s f o rp l a s m i dc o n s t r u c t i o na n dR Q-P C R

C o n s t r u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d s a n dR Q-P C R S e q u e n c e s o f p r i m e r s

a n d p r o

b e s5'-3'

S i z e s o f P C R

p r o d u c t s(b p)

B c r-a b l P210

　p l a s m i dc o n s t r u c t i o n u p s t r e a mT G G T G G A T G A A C T G G A G G

d o w n s t r

e a mG A C T G T T G A C T G G C G T G A T

771

B c r-a b l P190

　p l a s m i dc o n s t r u c t i o n u p s t r e a mT T T G A G G A T T G C G G A G G C

d o w n s t r

e a mC T G T T G A C T G G C G T G A T G T A G

602

P m l-r a r ab c r1p l a s m i dc o n s t r u c t i o n u p s t r e a mC C A G T G T A C G C C T T C T C C A T

d o w n s t r

e a mT C T T G T T T C G G T C G T T T C T C A

615

P m l-r a r ab c r3p l a s m i dc o n s t r u c t i o n u p s t r e a mG A G C A G G A T A G T G C C T T T G G

d o w n s t r

e a mT T C T T C T T G T T T C G G T C G T T T

727

b c r-a b l P210q u a n t i f i c a t i o n u p s t r e a mT C C G C T G A C C A T C A A T A A G G A

d o w n s t r

e a mC A C T C A G A C C C T G A G G C T C A A

p r o b e C C C T T C A G C G G C C A G T A G C A T C T G A

149

b c r-a b l P190q u a n t i f i c a t i o n u p s t r e a mC T G G C C C A A C G A T G G C G A

d o w n s t r

e a mC A C T C A G A C C C T G A G G C T C A A

p r o b e C C C T T C A G C G G C C A G T A G C A T C T G A

92

P m l-r a r aq u a n t i f i c a t i o n b c r1u p s t r e a mT C T T C C T G C C C A A C A G C A A

b c r2u p s t r e a mA C C T G G A T G G A C C G C C T A G

b c r3u p s t r e a mC C G A T G G C T T C G A C G A G T T

d o w n s t r

e a mG C T T G T A G A T G C G G G G T A G A G

p r o b e A G T G C C C A G C C C T C C C T C G C b c r1 129 b c r2 v a r i a b l e b c r3 147

H o u s e-k e e p i n g g e n e a b l q u a n t i f i c a t i o n u p s t r e a mT G G A G A T A A C A C T C T A A G C A T A A C T A A A G G T

d o w n s t r

e a mG A T G T A G T T G C T T G G G A C C C A

p r o b e C C A T T T T T G G T T T G G G C T T C A C A C C A T T

124

N o t e:A l l t h e p r o b e s w e r et h e T a q m a np r o b e s,f l u o r e s c e n c e l a b e l i n g w a s5'F A M a n d3'T A M R A.

定量荧光P C R仪采用A B I公司的A B I7300,定量P C R反应体系为:10×P C R r e a c t i o nb u f f e r2.5μl,50m m o l/LM g20.75μl,10m m o l/Le a c hd N T P M i x0.5μl,10μm o l/L上下游引物各0.75μl,10μm o l/LT a q M a nP r o b e0.5μl,I n v i t r o g e n公司h o t-s t a r t T a q酶1U,c D N A模板2μl,用去离子水补足至25μl。P C R循环参数为:95℃预变性10分钟, 95℃变性15秒,60℃退火60秒,并采集荧光信号, 45个循环。

荧光定量P C R标准曲线绘制及各样本融合基因拷贝数测定

在P C R反应结束后,设定基线水平和阈值,A B I 7300软件会自动绘制标准曲线,并根据标准曲线计算各样本的融合基因及管家基因的绝对拷贝数,目的融合基因与管家基因的比值需自行计算。

统计学分析

利用S P S S软件10.0版本进行数据统计处理。

结 果

构建质粒P C R产物的电泳结果

构建质粒P C R产物电泳并溴化乙啶染色后经B I O

-R A D凝胶成像系统拍照,结果见图1。结果表明,各P C R产物的大小与预期相符,只有P M L-R A RαS 型的P C R产物中非特异条带较多,仅回收727b p大小的目的条带用于后面的连接反应。

F i g u r e1.A g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s t i cp a t t e r no fd i f f e r e n t P C R p r o d u c t s c o n t a i n i n gs p e c i a l f u s i o ng e n e.L a n e1:B C R-A B L P210.L a n e2:B C R-A B L P190.L a n e3-4:P M L-R A Rαb c r1.L a n e5-8:P M L-R A Rαb c r3(o n l y727b pb a n d o f i n-t e r e s t w o u l db e r e c o v e r e d).M:m a r k e r D L2000.

质粒的标准曲线

将各质粒标准品倍比稀释为105、104、103、102、101、100,分别制作标准曲线。B C R-A B L P210质粒的标准曲线见图2。该标准曲线相关系数介于0.997-1.0之间,是非常理想的标准曲线。

患者标本的扩增效果

定量荧光P C R检测标本扩增效果见图3,基线水平

·

971

·

实时定量荧光P C R检测白血病融合基因

F i g u r e 2.S t a n d a r dc u r v e o b t a i n e dw i t ht h e s i x p l a s m i dd i l u -t i o n s .

选择第3-15个循环,阈值手动设定于指数扩增期

中部水平,质粒标准品和样本c D N A 扩增效率一致。

F i g u r e 3.A m p l i f i c a t i o np l o t so f s i xp l a s m i dd i l u t i o n sa n d c D N Ae x t r a c t e df r o m s a m p l e s .

融合基因阳性检出率

在各病种中融合基因检出的阳性率见表2,在

82.4%(28/34)的C M L 患者中检测到B C R -A B L

P 210

阳性(比值B C R -A B L P 210

/A B L 为0.01-3.19),在1

例C M L 急淋变患者检测到B C R -A B L P 210

和B C R -A B L P 190双阳性,其中B C R -A B L P 210/A B L 为2.798(绝对拷贝数为5897290c o p i e s /μgR N A ),B C R -A B L P 190/A B L 为0.018(绝对拷贝数为37791c o p -i e s /μg R N A );66.7%(4/6)的A L L 患者中检测到

B C R -A B L 阳性,其中2例B C R -A B L P 210

阳性,2例

B C R -A B L P 190

阳性;77.8%(7/9)的A P L 患者中检测到P M L -R A R α融合基因阳性(比值P M L -R A R a /A B L

为0.0014-3.199),其中3例为长型,3例为短型,1

例为变异型,检测结果为阴性患者处于缓解期。在4例正常人外周血单个核细胞中未检测到任何融合基因。

融合基因的动态变化参考文献资料[20]B C R -A B L /A B L 下降3个对数级以上被认为是显著分子生物学缓解(m a j o r m o l e c u l a r r e s p o n s e M M R ),B C R -A B L /A B L 下降为0被认为是完全分子生物学缓解(c o m p l e t e m o l e c u l a r r e s p o n s e C M R )。我们观察到1例在治疗(A T R A+A T O )后融合基因表达逐渐下降直至获得完全分子生物学缓解,另1例在完全分子生物学缓解8个月后复发(图4)。患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合,定量荧光P C R 检测融合基因阳性略早于临床观察到的血象学复发(资料未列出)

。

F i g u r e 4.D y n a m i cc h a n g e so fp ml -r a r α/a b li n o n eA P L

p a t i e n t w i t hc o m p l e t e m o l e c u l a r r e m i s s i o na f t e r c h e m o t h e r -a p y(A )a n d o t h e rA P L p a t i e n t r e l a p s e d a f t e r 8m o n t h c o m p l e t e mo l e c u l a r r e m i s s i o n(B ).

T a b l e 2.D e t e c t i o nr e s u l t s o f t h ef u s i o ng e n e t r a n s c r i p t s i np a t i e n t s a t d i a g n o s i s

L e u k e m i a

T o t a l p o s i t i v e

r a t e

B C R -A B L

P 210

B C R -A B L

P 190

P M L -R A R αb c r 1

P M L -R A R αb c r 3

P M L -R A R αb c r 2

C M L 82.4%(28/34)82.4%(28/34)2.9%(1/34)

＊

A L L 66.7%(4/6)33.3%(2/6)

33.3%(2/6)

A P L

77.8%(7/9)

42.9%(3/7)

42.9%(3/7)

14.3%(1/7)

N o t e :＊o n ec a s eo f a c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i at r a n s f o r m e df r o m C M Lw i t hB C R -A B L P 210a n dB C R -A B L P 190

d o u b l ep o s i t i v

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972·中国实验血液学杂志　J E x p H e m a t o l 2009;17(4)

讨 论

定量荧光R T-P C R持续性检测白血病融合基因是了解白血病患者体内肿瘤负荷及监控微小残留病灶(M R D)的良好技术手段,可以动态观察患者体内融合基因转录表达水平的变化,尤其是用管家基因a b l 标化以后,降低了加样误差和工作人员熟练程度、取样误差及样本中细胞数量差异对结果的干扰,使之更能反映患者体内融合基因的实际转录水平。由于国产试剂和进口试剂的差异,基线(b a s e l i n e)和阈值(t h r e s h o l d)的选择似乎应该灵活掌握,而不是固定不变。文献报道[10、11]及A B I公司软件默认的阈值大多为0.2,有时候为0.1,我们在使用A B I公司的试剂时,确实无需改动,结果很好,但使用国产试剂则达不到同样效果,可能是因为进口试剂常规掺入R O X阳性参比荧光,而国产试剂中未掺入,因此在使用国产试剂时手动调节阈值到指数扩增期会有比较理想的结果。管家基因a b l反映了R N A标本质量的好坏,如果a b l拷贝数很低表明标本中R N A降解严重,结果不再可信,需要重新取样检测。

我们在C M L、A L L、A P L中检测的阳性率与文献报道的阳性率[10-12]不太符合,偏低或者偏高一点,这可能与样本量太小和病人并非全为初发有关。在一例C M L急淋变患者中检测到b c r-a b l P210和b c r-a b l P190双阳性,其中b c r-a b l P210/a b l为2.798,b c r-a b l P190/a b l为0.018。以往认为和C M L急变有关,但后来的研究[15、16]发现b c r-a b l P190融合基因转录本不仅见于C M L急变期,在C M L慢性期中发生率也很高,林江[17]等报道检测74例C M L患者骨髓标本发现b c r-a b l P190转录本阳性54例(77.1%)。文献报道[10、11]骨髓标本和外周血标本在融合基因实时定量检测结果上无统计学差异,我们在实验过程中也发现定量结果与单个核细胞的数量以及R N A抽提质量的好坏密切相关,与标本来源关系不大。连续检测两例A P L患者发现定量结果与临床情况是吻合的,在有效化疗后p m l-r a rα/a b l显著下降3l o g以上,在C R后转为阴性,在复发时转阳,表明长期规律定量监测融合基因可以为准确把握治疗时机提供帮助。实时定量荧光P C R技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。

参考文献

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实时定量荧光P C R检测白血病融合基因

【CN109593861A】不同位点白血病MEF2DBCL9融合基因寡核苷酸的检测方法及检测试剂盒【

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910118948.X (22)申请日 2019.02.18 (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南 路1023号-1063号 (72)发明人 李玉华　胡宇行　常宁　贺艳杰　 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 范盈 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 不同位点白血病MEF2D-BCL9融合基因寡核 苷酸的检测方法及检测试剂盒 (57)摘要 本发明是一种用于检测不同位点白血病 MEF2D -BCL9融合基因检测方法及试剂盒，包括检 测体系PCR反应液、引物对、探针、阳性对照品和 阴性对照品。利用实时荧光PCR中的Taqman探针 技术检测患者体内MEF2D -BCL9融合基因的表达 情况以及对高危人群进行较为准确的筛查和鉴 定，具有特异性好，灵敏度高，方法简便高效的特 点。 权利要求书2页 说明书7页序列表3页 附图2页CN 109593861 A 2019.04.09 C N 109593861 A

权　利　要　求　书1/2页CN 109593861 A 1.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的检验试剂盒，所述检验试剂盒中包括检测用引物、探针，其特征在于： 检测目的基因用上下游引物分别为：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中， 序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 221-1055-F:GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.10 221-1055-R：ACCTGAAATTCGAGGATTCTGTGT SEQ ID No.11 221-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCCCTGTTGGAA-BHQ1 SEQ ID No.12 ABL1-F:GTGAGTGACATAGCCTCATGTTC SEQ ID No.13 ABL1-R:GCAGGCGTGCTCGTGAAAT SEQ ID No.14 ABL1-Probe:Quasar670-TCAGGGAGGGTTAGGAAAACCAC-BHQ-plus SEQ ID No.15。 2.根据权利要求1所述的检验试剂盒，所述检验试剂盒中还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照品为含有MEF2D-BCL9 Variant 1，MEF2D-BCL9 Variant 2，MEF2D-BCL9 Variant 3，MEF2D-BCL9 Variant 4；所述阴性对照品为去离子水。 3.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的引物和探针组合物，所述的引物和探针组合物包括：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中，序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 2

白血病融合基因

白血病融合基因Last revision on 21 December 2020

bcr/abl融合基因 慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。 基因结构 人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2-11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。abl主要结构有N 端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。abl蛋白参与细胞周期调节。在G0期，abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S期。 bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1-63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。CML的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。bcr基因在ALL中大约2/3为m-BCR位点。Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML 和非典型CML的诊断指标。

血液病中的融合基因

一、Ph染色体相关白血病的检测 Ph染色体最初在慢性粒细胞性白血病（CML）中发现，其发生率达到90%以上，成为慢粒的细胞遗传学标志。该染色体是由于第9号染色体长臂3区4带（9q34）和22号染色体长臂1区1带（22q11）相互易位所致，其后果使位于9q34的原癌基因C-ABL和位于22q11的BCR基因发生融合，形成BCR-ABL融合基因，并表达为BCR-ABL融合mRNA，翻译成融合蛋白质。20世纪70年代以来，在部分急性淋巴细胞白血病（ALL）中也发现有Ph染色体，占ALL的5%（儿童）～25%（成人）。近年来由于PCR技术的不断发展，对Ph染色体阳性白血病的诊断和残留白血病细胞的检测有了很大的进展。 应用筑巢式逆转录酶/多聚酶链反应技术（RT/PCR）检测BCR—ABL融合基因转录本，发现了3种BCR-ABL异构体，这种异构体的形成是由于BCR基因断裂点的位置不同所致。慢粒患者在BCR基因的断裂点主要集中于经典的bcr区域，即M-BCR区域，而伴有Ph染色体急性白血病中，约50%的患者BCR基因断裂点与慢粒患者相同，而另50%患者的断裂点位于BCR 基因的第1个内含子，ABL基因的断裂点主要位于第1或第2个内含子，第22号染色体的断裂点位于M-BCR2内含子，即M-BCR第二外显子与ABL基因第二个外显子相融合（简称b2a2转录本）。如果断裂点于M-BCR第三外显子即形成b3a2转录本，如果BCR基因的断裂点位于基因的第一内含子，则形成e1a2转录本，后者主要见于Ph染色体阳性的急性白血病患者。 二、急性早幼粒细胞性白血病的检测 急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中95%以上具有特异的染色体易位t（15；17）（q22；q21），易位的结果使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维A酸受体α（RARα）基因形成PML-RARα融合基因转录本。由于该融合基因对APL具有高度特异性，因此可以作为APL诊断的分子标志。近年来各国科学家有在少数APL患者中陆续发现了变异型染色体易位t（5；7）、t（11；17）、dup（17）形成的NPM-RARα、PLZF-RARα、NμMA-RARα、STATSB-RARα融合基因，这对进一步研究APL的发生机制具有重要意义。同时在APL患者的鉴别诊断和治疗上具有积极的意义。 三、急性粒细胞性白血病（M2b）的检测 急性粒细胞性白血病（M2b）型患者中90%存在特异的t（8；21）（q22；q22）染色体易位，伴该染色体易位的白血病细胞具有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性和嗜酸性细胞，且对化疗反应较敏感。目前已经发现该染色体易位使8号染色体的ETO/MTG基因和21号染色体的AML1基因融合形成AML1-ETO融合基因，从而导致产生AML1-ETO嵌合转录子，这种异常转录因子有可能参与造血系统恶性肿瘤的发生，因此检测该融合基因转录本对急性粒细胞性白血病（M2b）型患者的诊断、微小残留病变监测等具有重要意义。 四、AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv（16）导致CBF-MHY11融合基因的检测 近年来的研究发现在AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv(16)（p13；q22）的结果使16号染色体长臂的CBF（核心结合因子）β链基因和短臂的MYH11基因发生融合，形成两种形式的融合基因，即CBFβ-MHY11和MHY11-CBFβ融合基因，其中前者对M4Eo的致病可能更为重要。研究结果提示CBFβ基因的断裂点恒定于靠近3′端编码区的17个氨基酸处，而MYH11基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，同进这些重排仍然保持融合基因转录本的开放阅读框架。与其他类型的白血病发生的分子机制相似，CBFβ-MYH11融合蛋白的产生将促使白血病的发生。特别有意义的是，本型白血病中的inv（16）与急性粒细胞性白血病（M2b）型中的t（8；21）（q22；q22）染色体易位分别累及CBFα和β链，进一步说明了转录因子异常在白血病发病机制中的特殊地位。 与用PCR检测CBFβ-MYH11融合基因时，必须检测所有可能的CBFβ-MYH11融合基因转录

白血病融合基因检测综述

白血病融合基因检测综 述 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]

白血病相关融合基因的检测及意义 白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。 白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。 BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。 Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年O`Riordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley 发现缺失下来的那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22） （q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。 BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码 P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体阳性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融

正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测

2009年4月第47卷第11期·论著· 急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AM L）是一种以造血干/祖细胞获得性突变为特征的恶性克隆性疾病，大约55%的成人病例在诊断时出现非随机的克隆性染色体异常，儿童病例的检出率更高，但正常核型检出率在AM L中达到40%～47%[1]。染色体畸变能在转录水平干扰造血调控、影响髓系细胞分化，因此快速、简便地获得患者染色体遗传缺陷的信息是临床亟待解决的问题。本研究采用多重RT-PCR方法一次可同时检测29种基因重排，提高了隐匿性染色体易位的检出率，用于初诊时的筛选，对临床分型、预后判断及指导个体化治疗具有重要价值。 1材料与方法 １．１对象 选取2006年1月～2008年11月山西医科大学第二医院及山西省儿童医院血液科门诊或住院AM L初治患者60例，男30例，女30例，年龄1～70岁，中位年龄35岁。所有病例均经临床、形态学、免疫学和组化染色确诊，分别为M1、M2、M3、M4各12例，M5、M6各6例。所有病例均进行了染色体核型分析。 １．２方法 1.2.1试剂和仪器TRIzol试剂盒购自美国Gibco/BRL公司；AM V逆转录酶、RNAsin、TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司。PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司产品。 1.2.2细胞总RNA的提取和逆转录反应全部病例于初诊化疗开始前采取骨髓标本2～3mL，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，按Trizol一步法提取细胞总RNA，分光光度计测定A260值、A280值，以AM V逆转录酶系合成cDNA。引物序列参照文献[1]方法设计。逆转录广泛表达的转录因子（E2A）mRNA为内对照。1.2.3多重巢式RT-PCR两轮均平行设置8组含有混合引物的多重PCR，同时检测29种染色体易位和畸变所形成的86种剪接形式。每组检测的融合基因包括：第Ⅰ组inv（16）的CBF/M YH11；t（X；11）的M LL/AFX；t（6；11）的M LL/AF6；t（11；19） 正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测 赵瑾1*周永安1△苏丽萍1武坚锐2王恺1解菊芬1马莉1石磊3 （1.山西医科大学第二医院血液科；2.山西省儿童医院检验科；3.山西医科大学第二医院风湿科，太原030001） [摘要]目的探讨急性髓系白血病（AM L）患者染色体畸变所形成的易位相关融合基因的临床和实验的关系。方法采用多重巢式RT-PCR方法和染色体核型分析技术对60例AM L患者的融合基因进行分析。结果18例（30%）正常核型的AM L 患者分别检测出有PM L/RARα、AM L1/ETO、TLS/ERG、CBFβ/M YH11和M LL/AF9等5种融合基因的存在。结论多重巢式RT-PCR技术可用于白血病患者初诊时染色体畸变的筛选，可在核型正常的AM L患者中检出隐匿的染色体易位，对AM L 的诊断分型具有重要帮助，进一步指导临床个体化治疗。 [关键词]急性髓系白血病；融合基因；多重RT-PCR；正常核型 [中图分类号]R733.7[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2009）11-11-03 Det ect ion of Fusion Genes in Acut e Myeloid Leukemia Pat ient s wit h Nor mal Kar yot ypes ZHAO Jin1ZHOU Yongan1SU Liping1WU Jianrui2WANG Kai1XIE Jufen1MA Li1SHI Lei3 1.Department of Haematology，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University； 2.Children's Hospital of Shanxi； 3.Department of Rheumatism，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University，Taiyuan030001 [Abst r act]Object ive To investigate the fusion genes derived from chromosome structural aberrations in patients with acute myelocytic leukemia determined by multiplex RT-PCR and explore its potential clinical significance in diagnosis，treatment and prognosis evaluation. Met hods Bone marrow samples from60patients were analyzed with a novel multiplex nested RT-PCR and examination for chromosome karyotype.Result s5types of fusion genes such as PM L/RARα，AM L1/ETO，CBFβ/M YH11，TLS/ERG，M LL/AF9were detected in18（30%）patients with normal karyotypes by multiplex RT-PCR.Conclusion M ultiplex RT-PCR technique can quickly screen chromosome structural aberrations in patients with newly diagnosed leukemia.It is useful in detection of fusion genes in acute myeloid leukemia（AM L）with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis，help us to improve classification of the leukemia types of M ICM and to direct individulized chemotherapy. [Key Words]Acute myeloid leukemia；Fusion gene；M ultiplex RT-PCR；Normal karyotype *山西医科大学硕士研究生在读 △通讯作者 CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生11

白血病经典融合基因检测

白血病经典融合基因检测 （一）bcr/abl融合基因 abl为一原癌基因，位于9号染色体q34，基因产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶；bcr基因位于22号染色体q11，正常的bcr基因产物为160kD的胞质磷酸蛋白，由于t（9；22）（q34；q11）的易位，形成bcr/abl融合基因，该易位产生bcr/abl嵌合基因，基因产物为210kD的融合蛋白，它的表达激活了酪氨酸蛋白激酶，改变了细胞的蛋白酪氨酸水平和肌动蛋白结合能力，扰乱了正常的信号传导途径，抑制了凋亡的发生。 bcr基因断裂点集中在三个区域:主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr-abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。根据bcr基因断裂点的不同，主要有下述几种类型的bcr/abl融合形式:①在典型的CML中，大部分融合基因是在主要断裂点簇集区(M-bcr)内断裂融合而成，由此形成的bcr/abl融合mRNA是由b3a2或b2a2转录而成，其最终产物是相对分子质量210×103的胞浆蛋白P210，这种癌蛋白是绝大多数慢性期CML表型异常的根源所在。②当bcr基因断裂点发生在上游的一段长约54.4 kb的内含子，也称m-bcr区，产生一个e1a2接头的杂合mRNA，编码P190融合蛋白。③bcr断裂点也可在M-bcr区的下游，即μ-bcr，产生e19a2融合，编码P230融合蛋白。【我个人认为P230CML其特征主要是成熟中性粒细胞增生为主，表现为隐匿，良性的临床过程，患者生存期长的特点。】 bcr/abl融合基因存在于95%以上的慢性粒细胞白血病患者，是CML最重要的分标志，是疾病状态的决定性因素。在一部分成人急性淋巴细胞性白血病（20%－30%）、儿童急性淋巴细胞白血病（2%－10%）和急性粒细胞性白血病的患者中也可表达bcr/abl融合基因。在bcr/abl 阳性B-ALL细胞具有较特殊的表型，更多地表达CD34及CD10等细胞表面抗原，CD38阳性率较低，且IgH 检出率也相对较低，而CD10 /CD34 /CD38-是其独特的免疫表型特点。（二）AML1/ETO融合基因 t(8；21)(q22；q22)主要见于急性粒细胞白血病部分分化型(AML-M2)，亦可发生于急性粒细胞白血病未分化型(AML-M1)、急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)及骨髓增生异常综合征(MDS)-RAEB-T中。这种染色体易位导致21号体上AML1基因(acute myeloblastic leukemia one gene)与8号染色体的ETO基因(eight twenty one gene，也称为MTG8基因)的融合形成AML1/ETO融合基因。AML1/ETO融合蛋白是一种转录抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介导的功能，改变造血祖细胞自我更新及成熟过程，同时也产生启动异常造血细胞增殖的信号，引起白血病细胞生长。 t(8；21)(q22；q22)阳性是预后好的标志，其完全缓解(CR)率可达90%，5年长期无病生存率(event-free survival，EFS)可达50%-70%，AML1/ETO融合基因的存在是白血病预后良好的标志。经化疗或BMT后大部分病人可在短期内转为阴性，但仍有转阳性的可能，及时治疗可再次转阴性。RT-PCR结果由阴性转阳性或持续阳性可能预示复发。 （三）CBFβ/MYH11融合基因 M4Eo是M4型白血病中的一种特殊类型，约占急性粒细胞白血病的10%。患者骨髓中粒系和单核系原始细胞同时恶性增生，嗜酸粒细胞占5%～30%。含有CBFβ-MYH11融合基因的M4Eo患者预后较好。 Inv(16) /t(16；16)(p13；q22)为急性髓系白血病(AML)-M4Eo的非随机染色体异常，16q22断裂区受累基因CBFβ编码CBF的β亚单位，inv（16）/t(16；16)导致形成CBFβ/MYH11融合基因。inv(16)/t(16；16)(p13；q22)的结果是16号染色体长臂的CBFβ基因与短臂的平滑肌肌球蛋白重链1(MYH11)基因发生重排，形成CBFβ-MYH11和MYH11-CBFβ两种融合基因，其中CBFβ-MYH11融合基因易促使白血病发病。CBFβ链不直接结合DNA，而是通过与CBF

白血病融合基因检测的意义

白血病融合基因检测的意义 白血病（leukemia）属于造血系统的恶性肿瘤，是一组高度异质性的恶性血液病，其特点为白血病细胞呈现异常增生伴分化成熟障碍。临床出现不同程度的贫血、出血、发热及肝脾、淋巴结肿大，可危及生命。 白血病融合基因（fusion gene），是白血病的分子生物学特异性标志。近年来，由于分子生物学技术的发展，对白血病细胞分子遗传学改变的了解也不断深入。迄今报道白血病涉及至少数十种融合基因。已经认识到大部分的白血病中存在着染色体结构畸变，包括缺失、重复、倒位、易位等，导致原癌基因及抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。有些基因是调控细胞增殖、分化和凋亡的转录因子，当基因发生变异，直接影响了下游信号传递途径，导致细胞增殖能力增强、凋亡障碍，分化障碍等，产生白血病表型。 一些典型的白血病融合基因是某种白血病的特异性分子诊断标志，如 BCR-ABL融合基因，可出现在95%以上的慢性粒细胞白血病（CML）。患者预后效果的好坏，与融合基因的类型有一定关系，如急性早幼粒细胞白血病（APL）特有的PML-RARa融合基因，对APL患者用全反式维甲酸（ATRA）诱导缓解治疗，其预后非常好，复发率低。而有些基因，如MLL相关融合基因，预后差，死亡率高。 1.融合基因检测对白血病诊断的意义 通过临床实践发现单纯细胞形态学分型，检测者的主观成分较大，相互间的符合率及正确率有一定限制，随着细胞和分子生物学技术的迅速发展及对白血病发病机制研究的不断深入，认识到白血病发病过程中的基因和表型变化对各类白血病的诊断与治疗具有重要意义，因此提出了白血病MICM分型。近两年白血病分子特征的研究取得了明显进展，尤其是对染色体易位形成融合基因，有一些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标志和确定诊断的唯一依据，如急性早幼粒细胞白血病APL：PML/RARA，t(15;17)(q21;q22)；急性髓细胞白血病AML-M4Eo：CBFB/MYH11,inv(16)(p13;q22)；慢性粒细胞白血病CML或部分急性淋巴细胞白血病ALL：BCR/ABL，t (9;22)(q34;q11)；AML-M2：AML1/ETO，t(8;21)(q22;q22)；ALL-L3：MYC/IgH，t(8;14) (q24;q32)；AML-M4/M5：11q23MLL异常等。白血病融合基因可以通过逆转录PCR（RT-PCR）技术加以检出，有助于评价白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的诊断分型更加科学化和规范化。2007年卫生部颁布的《医疗机构临床检验项目目录》，其中有要求利用RT-PCR或real-time PCR技术的白血病融合基因检查，主要涉及6种融合基因的检查，包括BCR/ABL、PML/RARA、AML1/MPSI/EVI1、DEK/CAN、AML1/MTG8、E2A/PBX1。 RT-PCR可比传统的细胞学方法及临床症状出现早5～8个月，可检出1×106个有核细胞中的一个白血病细胞，在白血病的早期诊断方面有着其它方法无可比拟的特异性和敏感性。 2.融合基因检测对白血病治疗和预后判断的意义 细胞遗传学分型与疾病的预后关系密切，对于指导临床个性化治疗方案的选择和判断预后具有十分重要的意义。急性白血病有PML/RARA， CBFB/MYH11，AML1/ETO融合基因预后较好，化疗完全，缓解率高，可长期