实验二 细胞器的分离与提纯

实验二细胞器的分离与观察

一、教学目的与要求

1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。

2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。

二、实验原理

线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。

制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。

悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。

线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。

三、实验用品

器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。

材料：新鲜的猪肝脏。

试剂：见PAGE 64

四、实验步骤

1. 制备猪肝细胞匀浆。实验前购买新鲜猪肝脏备用。

割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。

2. 差速离心。先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml 肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。

3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。

4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。

5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。

5. 分离物鉴定。

①细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，加甲醇-冰醋酸液1滴固定15min，充分吹干，滴1滴姬姆萨染液染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。

②线粒体：取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染色20min，覆上盖玻片，镜检。线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。

取猪肝2g

用预冷的0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤3次，

研磨成匀浆

匀浆液

多层纱布过滤，

700×g 离心10min

沉淀上清液

10000×g离心

10min 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次

每次1000×g离心15min 沉淀（线粒体）

沉淀洗涤

（细胞核及质膜碎片） 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次,

每次10000×g离心15min

镜检

沉淀

镜检

五、作业

1、根据镜检结果，绘制线粒体结构简图。

2、分离得到的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后染色，两者着色有何不同。

高一物质的分离与提纯练习题及答案

物质的分离与提纯 补充习题 一、选择题 1．下列分离混合物的操作中，必须加热的是（） A. 过滤B．分液C．结晶D．蒸馏 2．用天然水制取纯度较高的水通常采用的方法是( ) A.煮沸并加入石灰纯碱 B. 加明矾搅拌 C. 进行多次过滤 D.蒸馏 3．现有三组溶液：①汽油和氯化钠溶液②39％的乙醇溶液⑧氯化钠和单质溴的水溶液，分离以上各混合液的正确方法依次是（） A . 分液、萃取、蒸馏 B. 萃取、蒸馏、分液 C . 分液、蒸馏、萃取 D. 蒸馏、萃取、分液 4下列从混合物中分离出其中的一种成分，所采取分离方法正确的是（）A．由于碘在酒精中的溶解度大，所以，可用酒精把碘水中的碘萃取出来。 B．水的沸点是100℃，酒精的沸点是78.5℃，所以，可用加热蒸馏方法使含水酒精变成无水酒精。 C．氯化钠的溶解度随着温度下降而减少，所以，用冷却法从热的含有少量氯化钾浓溶液中得到纯净的氯化钠晶体。 D．在实验室中，通常采用加热氯酸钾和二氧化锰的混合物方法制取氧气。我们可以用溶解、过滤的方法从反应产物中得到二氧化锰。 5．下列化学实验操作或事故处理方法不正确的是（）A．不慎将酸溅到眼中，应立即用水冲洗，边洗边眨眼睛 B．不慎将浓碱溶液沾到皮肤上，要立即用大量水冲洗，然后涂上硼酸 C．酒精灯着火时可用水扑灭 D．配制硫酸溶液时，可先在量筒中加入一定体积的水，再在搅拌条件下慢慢加浓硫酸 6．在“粗盐提纯”的实验中，蒸发时正确的操作是（）A．把浑浊的液体倒人蒸发皿内加热

B．开始析出晶体后用玻璃棒搅拌 C．蒸发时液体不超过蒸发皿容积的1/3 D．蒸发皿中出现大量固体时即停止加热 ＊7．过滤后的食盐水仍含有可溶性的CaCl2、MgCl2、Na2SO4等杂质，通过如下几个实验步骤，可制得纯净的食盐水：①加入稍过量的Na2CO3溶液；②加入稍过量的NaOH溶液；③加入稍过量的BaCl2 溶液；④滴入稀盐酸至无气泡产生；⑤过滤正确的操作顺序是（）A．③②①⑤④B．①②③⑤④ C．②③①④⑤D．③⑤②①④ 二、填空题 8．粗食盐中除含有钙离子、镁离子、硫酸根离子等可溶性杂质外，还含有泥砂等不溶性杂质。我们食用的精盐是用粗食盐提纯而得到的。通过教材中“粗盐的提纯”及你做过的该实验回答下列问题。 （1）实验室进行NaCl溶液蒸发时，一般有以下操作过程①放置酒精灯； ②固定铁圈位置；③放上蒸发皿（蒸发皿中盛有NaCl溶液）；④加热搅拌;⑤停止加热。其正确的操作顺序为 （2）如何运用最简方法检验溶液中有无SO42－离子？。如果有，应该如何除去SO42－离子？。 （3）在粗盐经过溶解→过滤后的溶液中滴加饱和Na2CO3溶液，直至不再产生沉淀为止。请问这步操作的目的是。 （4）将经过操作（3）后的溶液过滤。请问这一操作能除掉哪些杂质？ 。 （5）实验室里将粗盐制成精盐的过程中，在溶解、过滤、蒸发三个步骤的操作中都要用到玻璃棒，分别说明在这三种情况下使用玻璃棒的目的：溶解时：。 过滤时: 。 蒸发时：。 9．就有关物质的分离回答下面的问题 （1）分离沸点不同但又互溶的液体混合物，常用什么方法？试举例说明。

化学除杂分离和提纯的专项培优 易错 难题练习题(含答案)含答案解析

一、中考初中化学除杂分离和提纯 1．下列实验方案能达到实验目的的是（） A．A B．B C．C D．D 【答案】D 【解析】 【详解】 A、除去KCl溶液中的K2CO3，加入适量的硝酸钙溶液，硝酸钙与碳酸钾反应生成硝酸钾和碳酸钙沉淀，过滤可除去碳酸钙，但引入了新的杂质硝酸钾，故A不正确； B、除去BaCl2溶液中的HCl，加入过量Ba(OH)2溶液，除去了杂质但引入了新杂质Ba(OH)2（过量的），故B不正确； C、稀盐酸和稀硫酸都属于强酸，不能通过比较溶液的pH来区分，故C不正确； D、氢氧化钠固体加水溶解会放出大量的热，溶液温度升高；硝酸铵固体加水溶解会吸收热量，溶液温度降低，可鉴别二者，故D正确。故选D。 2．下表中，除去物质所含少量杂质的方法和反应类型归类均正确的是

A．A B．B C．C D．D 【答案】A 【解析】 【分析】 【详解】 A、铜和氧气加热生成氧化铜，反应为化合反应，氧化铜和氧气加热不反应，可以除去铜粉，故A正确； B、一氧化碳和氧化铜反应生成铜和二氧化碳，反应不属于置换反应，故B不正确； C、盐酸和氢氧化钠反应生成氯化钠和水，反应类型为复分解反应，故C不正确； D、硫酸钾和硝酸钡反应生成硫酸钡和硝酸钾，引进新杂质硝酸钾，故D不正确。 故选A。 3．下列依据实验目的所设计的实验方案正确的是（） A．A B．B C．C D．D 【答案】C 【解析】 【分析】 【详解】 A、除去CO2中的HCl气体，将混合气体通入足量NaOH溶液中，NaOH不仅与杂质氯化氢反应，还与原物质二氧化碳反应，不符合除杂的“原物质不减少”原则，不能用于除氯化氢杂质，选项说法错误，故不符合题意； B、区分尿素CO(NH2)2、NH4Cl和NH4NO3，加熟石灰研磨闻气味，只能区分出尿素，NH4Cl 和NH4NO3都与熟石灰反应产生刺激性气味的氨气，无法区分，选项说法错误，故不符合题意； C、区分稀HCl( 酸性)、Na2CO3溶液（碱性)、NaCl溶液（中性)，滴加紫色石蕊溶液，紫色石蕊遇稀HCl显红色，遇Na2CO3溶液显蓝色，遇NaCl溶液显紫色，可以通过观察颜色

实验四 线粒体的分离与观察

实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

生化分离《生物分离与纯化技术》实验题目

2009生化分离工程实验（闭卷考试） 2012生化工艺实验 简答题（23选6题，每个实验选一题） 1.在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO？ 2.索氏提取装置由哪几部分组成（画图）？工作原理？ 3.咖啡因升华过程中用到了什么装置？咖啡因的升华结晶应注意哪些操作？ 4.茶叶咖啡因的提取实验中，浓缩去除乙醇的过程中用到了哪些设备？ 5.动物脏器DNA提取实验中，蛋白质是如何去除的？ 6.动物脏器DNA提取实验中，如何鉴定DNA的纯度？ 7.动物脏器DNA提取实验中，RNA是怎样去除的？ 8.动物脏器DNA提取实验中，氯仿-异戊醇的作用是什么？离心后分哪几层？ 9.动物脏器DNA提取实验中，为什么用0.1M NaCl-SSC间歇式的搅拌猪肝？ 10.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上半部），粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？ 11.鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中，所用树脂是哪种？树脂为什么预处理，如何预处理？ 12.DEAE-纤维素是哪种类型离子交换剂，如何预处理DEAE-纤维素？ 13.在鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中固定相、流动相分别是什么？ 14.简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图。 15.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上），为什么提取液的pH在3.5左右？ 16.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（下），pH6.5的用意何在？ 17.简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶的实验原理 18.栀子黄提取实验中，栀子苷是如何去除的？为什么用此方法去除？ 19.栀子黄提取实验中，如何鉴定藏花红素中栀子苷的去除情况？ 20.栀子黄提取实验中，吸附前为什么将滤液稀释至240mL乙醇？ 21.栀子黄提取实验中，吸附前为什么将滤液pH调至3 22.大蒜SOD提取实验中，是如何去除杂蛋白的？PBS与丙酮的作用分别是什么？ 23.大蒜SOD提取实验中，用哪种方法测定SOD活性？其原理是什么？ 1. 在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO? 答:吸取水分，防止咖啡因蒸汽溶于水； 中和鞣酸； 2. 索氏提取装置有哪几部分组成？（画图）

流式细胞分离细胞

流式细胞仪分离原理和步骤 流式细胞术（flow cytometer,FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。本实验以间接免疫荧光标记法为例。 实验原理 因淋巴细胞表面有特征性的抗原或受体表达，故先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，经流式细胞仪测定荧光强度和阳性百分率，即可知相应抗原的密度和分布。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 材料和仪器 1 特异性鼠抗人单克隆抗体（McAb）（如抗CD3、抗CD4等）、荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体、灭活正常兔血清，含10％FBS的FBS的RPMI-1640溶液、DPBS、洗涤液、固定液等。 2 玻璃管、塑料离心管、离心机、流式细胞仪、倒置显微镜。 实验方法 1 制备活性高的外周血单个核细胞悬液，用含有10％FCS的RPMI-1640溶液调整细胞浓度为5×106~1×107/mL。 2 取40μL细胞悬液加入预先有特异性鼠抗人McAb 5~50μL的小玻璃管或塑料离心管中，再加50μL 1：2（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4℃，30min。 3 用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右，1000r/min，离心5min，弃去上清液。 4 加入50μL工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记二抗，充分振荡，4℃，30min。 5 用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右，1000r/min，离心5min。 6加1mL固定液，混匀，上流式细胞仪分选细胞。标本在试管中可保存5~7天。

1-2-1物质的分离与提纯练习题及答案解析

(本栏目内容，在学生用书中以活页形式分册装订！) 一、选择题 1．(2009年海淀高一检测)下列实验操作中错误的是() A．使用分液漏斗分液时，应将漏斗颈上的玻璃塞打开 B．蒸馏实验必须使用温度计 C．用CCl4萃取碘水中的碘 D．过滤(如图)时，可将悬浊液从烧杯直接倒入漏斗中 【解析】制蒸馏水时，因水的沸点是100 ℃，即沸腾产生的气体为水蒸气，故不需温度计。过滤要用玻璃棒引流。 【答案】BD 2．下列分离物质的方法中，不正确的是() A．利用分馏的方法从石油中分离出汽油和煤油 B．利用分液的方法将水和酒精分离开来 C．利用结晶的方法除去硝酸钾中混有的少量氯化钾 D．利用过滤的方法除去水中的泥沙 【解析】水和酒精互溶，不分层，故无法分液。 【答案】 B 3．现有三组溶液：①汽油和氯化钠溶液②39%的乙醇溶液③氯化钠和单质溴的水溶液，分离以上各混合液的正确方法依次是() A．分液、蒸馏、萃取B．萃取、蒸发、分液 C．分液、萃取、蒸馏D．蒸馏、萃取、分液 【解析】①分层，②互溶，乙醇与水的沸点不同，③单质溴能溶于水，更易溶于有机溶剂，故分离以上三种混合液应选A。 【答案】 A 4．通过溶解、过滤、蒸发等操作，可将下列各组混合物分离的是() A．硝酸钠、氢氧化钠B．氧化铜、二氧化锰 C．氯化钾、二氧化锰D．硫酸铜、氢氧化钙 【解析】A项，NaNO3和NaOH都溶于水，无法用过滤法分离；B项，CuO和MnO2都不溶于水；D项CuSO4、Ca(OH)2溶于水后两者会发生反应；而KCl和MnO2可用过滤法分离，然后蒸发滤液即可得到KCl。 【答案】 C 5 A．萃取法B．过滤法 C．蒸馏法D．分液法 【解析】两种物质的熔点都很低，在常温下都是液体，二者都溶于水，说明甲和乙可以

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室 合作者指导老师 总分教师签名批改日期 碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。 AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。 一实验原理 1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm 处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。 3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表 示： 式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。 ①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物

物质的分离与提纯练习题及答案解析

物质的分离与提纯练习 题及答案解析 LEKIBM standardization office【IBM5AB- LEKIBMK08- LEKIBM2C】

(本栏目内容，在学生用书中以活页形式分册装订！) 一、选择题 1．(2009年海淀高一检测)下列实验操作中错误的是() A．使用分液漏斗分液时，应将漏斗颈上的玻璃塞打开 B．蒸馏实验必须使用温度计 C．用CCl4萃取碘水中的碘 D．过滤(如图)时，可将悬浊液从烧杯直接倒入漏斗中 【解析】制蒸馏水时，因水的沸点是100 ℃，即沸腾产生的气体为水蒸气，故不需温度计。过滤要用玻璃棒引流。 【答案】BD 2．下列分离物质的方法中，不正确的是() A．利用分馏的方法从石油中分离出汽油和煤油 B．利用分液的方法将水和酒精分离开来 C．利用结晶的方法除去硝酸钾中混有的少量氯化钾 D．利用过滤的方法除去水中的泥沙 【解析】水和酒精互溶，不分层，故无法分液。 【答案】 B 3．现有三组溶液：①汽油和氯化钠溶液②39%的乙醇溶液③氯化钠和单质溴的水溶液，分离以上各混合液的正确方法依次是() A．分液、蒸馏、萃取B．萃取、蒸发、分液 C．分液、萃取、蒸馏D．蒸馏、萃取、分液 【解析】①分层，②互溶，乙醇与水的沸点不同，③单质溴能溶于水，更易溶于有机溶剂，故分离以上三种混合液应选A。 【答案】 A 4．通过溶解、过滤、蒸发等操作，可将下列各组混合物分离的是() A．硝酸钠、氢氧化钠B．氧化铜、二氧化锰 C．氯化钾、二氧化锰D．硫酸铜、氢氧化钙 【解析】A项，NaNO3和NaOH都溶于水，无法用过滤法分离；B项，CuO和MnO2都不溶于水；D项CuSO4、Ca(OH)2溶于水后两者会发生反应；而KCl和MnO2可用过滤法分离，然后蒸发滤液即可得到KCl。 【答案】 C 5 物质熔点沸点密度 水中溶解 性 甲－ 98 ℃ ℃ g·cm－3可溶 乙－ 84 ℃ 77 ℃ g·cm－3可溶 A．萃取法B．过滤法C．蒸馏法D．分液法

溶菌酶的提取分离和纯化实验报告

生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 实验报告集 班级生工1411 学号 组别7 姓名

实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。

预习报告（手写，可自行续页）

实验报告 溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 一、目的 对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定 二、原理 鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。 1、溶菌酶分离纯化原理： （1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白 （2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白 2、溶菌酶鉴定分析 （1）考马斯亮蓝法测蛋白含量 （2）分光光度法测定酶活性 （3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度 三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂 鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等 2、实验仪器 低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。 3、实验方法 1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离 2. 树脂柱层析分离纯化 （1）D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱 3.透析与浓缩 (1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩 4.蛋白质含量的测定 5.溶菌酶纯度的测定（SDS凝胶电泳）

中考化学综合题专题复习【除杂分离和提纯】专题解析含答案解析

一、中考初中化学除杂分离和提纯 1．要除去氯化钠溶液中含有的少量碳酸钠，可采用的方法是①通入适量的二氧化碳②加入适量的氯化钡溶液③加入适量的稀盐酸④加入适量的石灰水（） A．①或③B．②或③C．②或④D．③或④ 【答案】B 【解析】 【分析】 【详解】 ①二氧化碳不和碳酸钠溶液反应，不能除去杂质，此项错误； ②氯化钡能和碳酸钠反应生成碳酸钡沉淀和氯化钠，反应时不会带入新的杂质，故此项正确； ③盐酸能和碳酸钠反应，且生成氯化钠，不会带入新的杂质，此项正确； ④氢氧化钙溶液能和碳酸钠反应，但反应时会生成氢氧化钠，带入新的杂质，此项错误，故选B。 2．除去下列物质中混有的少量杂质（括号内为杂质），拟定的实验方案可行的是 （） A．木炭粉（CuO）——在空气中灼烧 B．KCl溶液（CaCl2）——通入过量的CO2气体，过滤 C．NaCl溶液（Na2CO3）——加入适量的澄清石灰水，过滤 D．H2气体（HCl气体）——依次通过足量的NaOH溶液和浓硫酸 【答案】D 【解析】 【分析】 除杂质的要求是：要把杂质除去，但不能除去需要的物质更不能带入新的杂质。 【详解】 A、木炭粉会与氧气反应生成二氧化碳，不但氧化铜没有除去，还把需要的物质除去了，选项A不正确； B、通入的二氧化碳不能与氯化钙反应，不能除去氯化钙，选项B错误； C、氢氧化钙与碳酸钠反应生成碳酸钙沉淀和氢氧化钠，虽然把碳酸钠除去了，但是带入氢氧化钠这种新的杂质，选项C错误； D、氯化氢气体溶于水形成盐酸，盐酸与氢氧化钠溶液反应生成氯化钠和水，水蒸汽通过浓硫酸后会被浓硫酸吸收，选项D正确。故选D。 3．除去下列物质中的少量杂质，所选用的试剂和操作方法都正确的是()

造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min 得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min 离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE 充分混合 , 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上机检测。 磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂 , 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。 MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS 缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500μL PBS

1.1混合物的分离和提纯练习题打印版

混合物的分离和提纯练习题 1．能够用来鉴别BaCl2、NaCl、Na2CO3三种物质的试剂是()。 A．AgNO3溶液B．稀硫酸C．稀盐酸D．稀硝酸2.实验室进行NaCl溶液蒸发时，一般有以下操作过程：①放置酒精灯；②固定铁圈位置；③放置蒸发皿；④加热搅拌；⑤停止加热，余热蒸干。其正确的操作顺序为() A．①③②④⑤B．①②③④⑤C．②③①④⑤D．②①③④⑤3.提纯下列物质除去其中的杂质(括号中为杂质)，所用试剂和方法正确的是() A．H2SO4(HCl)：AgNO3溶液、过滤B．KNO3(K2SO4)：Ba(NO3)2溶液、过滤 C．Cu(CuO)：盐酸、过滤D．CaCO3(CaO)：水、过滤 4．某溶液中含有较大量的Cl－、CO2－3、OH－等三种阴离子，如果只取一次该溶液就能够分别将三种阴离子依次检验出来，下列实验操作顺序正确的是() ①滴加Mg(NO3)2溶液②过滤③滴加AgNO3溶液④滴加Ba(NO3)2溶液 A．①②④②③B．④②①②③C．①②③②④D．④②③②① 5．现有三组溶液：①汽油和氯化钠溶液②39％的乙醇溶液③氯化钠和单质溴的水溶液，分离以上各混合液的正确方法依次是()。 A．分液、萃取、蒸馏B．萃取、蒸馏、分液C．分液、蒸馏、萃取D．蒸馏、萃取、分液 6．某溶液中含有较大量的Cl－、 2 3 CO、OH－3种阴离子，如果只取一次该溶液就能够分别将3种阴离子依次检验出来，下列实验操作顺序中，正确的是()。 ①滴加Mg(NO3)2溶液；②过滤；③滴加AgNO3溶液；④滴加Ba(NO3)2溶液A．①②④②③ B．④②①②③C．①②③②④D．④②③②① 7. 除去下列物质中的杂质，所用试剂和方法不正确的是（） 物质杂质除杂所用试剂和方法 A．H 2SO 4 HCl AgNO 3 溶液、过滤 B．KNO 3 K 2 SO 4 Ba（NO 3 ） 2 溶液、过滤 C．Cu CuO 盐酸、过滤 D．CaCO 3 CaO H 2 O、过滤 8.下列离子检验的方法正确的是() A．某溶液中加硝酸银溶液生成白色沉淀，说明原溶液中有Cl－ B．某溶液中加BaCl2溶液生成白色沉淀，说明原溶液中有SO2－4 C．某溶液中加NaOH溶液生成蓝色沉淀，说明原溶液中有Cu2＋ D．某溶液加稀硫酸生成白色沉淀，说明原溶液中有Ba2＋ 9.可用于分离或提纯物质的方法有：（） A．过滤B．升华C．加热分解D．洗气法 10．下列分离混合物的操作中，必须加热的是（）

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的

中考化学 除杂分离和提纯综合试题及答案解析

一、中考初中化学除杂分离和提纯 1．下列除去杂质的方法中，不正确的是（） A．①②B．②③C．③④D．②④ 【答案】D 【解析】 【分析】 【详解】 ①氯化钠易溶于水，泥沙难溶于水，可采取加水溶解、过滤、蒸发的方法进行分离除杂，故选项所采取的方法正确； ②二氧化碳能与氢氧化钠固体反应生成碳酸钠和水，氢氧化钠固体具有吸水性，不但能把杂质除去，也会把原物质除去，不符合除杂原则，故选项所采取的方法错误； ③铁粉能与CuSO4反应生成硫酸亚铁和铜，再过滤除去不溶物，能除去杂质且没有引入新的杂质，符合除杂原则，故选项所采取的方法正确； ④Na2CO3能与过量的Ca(OH)2溶液反应生成碳酸钙沉淀和氢氧化钠，能除去杂质但引入了新的杂质氢氧化钙，不符合除杂原则，故选项所采取的方法错误，故②④方法不正确，故选D。 【点睛】 本题为除杂题，是中考的重点，也是难点，解决除杂问题时，抓住除杂的必需条件（加入的试剂只与杂质反应，反应后不能引入新杂质）是正确解题的关键。 2．除去下列物质中的杂质，所用试剂和方法不正确的是（）

A．A B．B C．C D．D 【答案】D 【解析】 【分析】 【详解】 A、KC1易溶于水，泥沙难溶于水，可采取加水溶解、过滤、蒸发的方法进行分离除杂，选项A正确； B、CO2能与氢氧化钠溶液反应生成碳酸钠和水，CO不与氢氧化钠溶液反应，能除去杂质且没有引入新的杂质，符合除杂原则，选项B正确； C、盐酸能与过量的碳酸钙反应生成氯化钙、水和二氧化碳，再过滤除去过量的碳酸钙，能除去杂质且没有引入新的杂质，符合除杂原则，选项C正确； D、Ca(OH)2能与过量碳酸钠溶液反应生成碳酸钙沉淀和氢氧化钠，能除去杂质但引入了新的杂质碳酸钠（过量的），不符合除杂原则，选项D不正确。故选D。 【点睛】 除杂质至少要满足两个条件：①加入的试剂只能与杂质反应，不能与原物质反应；②反应后不能引入新的杂质。 3．下列选项中的除杂方法不能达到目的的是（） A．A B．B C．C D．D 【答案】D 【解析】 【分析】 除杂（提纯），是指除去杂质，同时被提纯物质不得改变。 【详解】

DC细胞的分离及培养

DC细胞的分离及培养 一、单个核细胞的分离 1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。 2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。 3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。 4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。 5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。 6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。 7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。 8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。 9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液。 10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。 二、CD34阳性细胞分选 1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。 2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。 3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。 4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。 5. 把重悬后的细胞和磁珠缓缓加到分选柱上，使其缓慢流下。 6. 用分选buffer清洗分选柱3个柱体积。 7. 将分选柱自磁极上取下，加入一个柱体积的分选buffer，快速将之打入离心管中。为提高回收效率，可重复一次。 8. 将洗下的细胞以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并用PBS重悬。 9. 重复步骤8并用合适的培养基重悬以适应下面的细胞培养。 三、CD34阳性细胞培养 1. 培养基配置：IMDM培养基+10% FBS，细胞因子SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml、IL-6 20 ng/ml、FL-3t 50 ng/ml、TPO 20 ng/ml，加双抗。 2. 将分离好的CD34阳性细胞置于六孔版的一孔或分于两孔中（视血量和细胞

有机物的分离提纯练习题

课时作业(五) 一、选择题 1．以下实验装置一般不用于分离物质的是() 解析：D为配制溶液。 答案：D 2．用分液漏斗可以分离的一组液体混合物是() A．苯和CCl4B．溴和戊烷 C．溴苯和水D．汽油和煤油 解析：溴苯和水互不相溶，分层析出。 答案：C 3．下列说法不正确的是() A．蒸馏是分离，提纯液态有机物的常用方法 B．重结晶的首要工作是选择适当的溶剂 C．萃取包括液—液萃取和固——液萃取 D．研究有机化合物可首先进行元素定量分析，再分离、提纯 解析：研究有机化合物的基本步骤首先应该是分离、提纯然后再进行元素定量分析，所以D不正确。 答案：D 4．天然色素的提取往往应用到萃取操作，现在有用大量水提取的天然色素，下列溶剂不能用来萃取富集这些天然色素的是()

A．四氯化碳B．苯 C．乙醇D．直馏汽油 解析：乙醇极易溶于水。 答案：C 5．下列萃取与分液结合进行的操作(用CCl4为萃取剂，从碘水中萃取碘)中错误的是() A．饱和碘水和CCl4加入分液漏斗中后，塞上上口部的塞子，用一手压住分液漏斗上口部，一手握住活塞部分，把分液漏斗倒转过来振荡 B．静置，待分液漏斗中液体分层后，先使分液漏斗内外空气相通(准备放出液体) C．打开分液漏斗的活塞，使全部下层液体沿盛接液体的烧杯内壁慢慢流出D．最后继续打开活塞，另用容器盛接并保存上层液体 解析：萃取后，分液漏斗中的下层液体从下端放出，上层液体应从上口倒出。 答案：D 6．下列关于物质的分离、提纯实验中的一些操作或做法，正确的是() A．在组装蒸馏装置时，温度计的水银球应伸入液面下 B．用96%的工业酒精制取无水乙醇，可采用的方法是加生石灰，再蒸馏C．在苯甲酸重结晶实验中，粗苯甲酸加热溶解后还要加少量NaOH溶液D．在苯甲酸重结晶实验中，待粗苯甲酸完全溶解后，要冷却到常温才过滤解析：用生石灰吸水，利用乙醇沸点低加热蒸出。 答案：B 7．现有一瓶乙二醇和丙三醇的混合物，已知它们的性质如下表。据此，将乙二醇和丙三醇相互分离的最佳方法是() C．分液法D．分馏法 解析：混合物的分离方法，取决于组成混合物的各物质的性质差异。萃取法适用于同一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解度差异，将混合物分离；结晶

原代细胞培养之--细胞分离技术

原代细胞培养之－－细胞分离技术 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （1）胰蛋白酶分散技术

原代细胞分离纯化SOP

原代肝细胞分离纯化SOP 1、实验目的 分离和纯化原代干细胞，体外研究药物对原代肝脏细胞的毒性 2、实验方法 实验材料：ICR小鼠（20-30g） 实验试剂：20%乌拉坦或水合氯醛 0.1%肝素钠（Glucose 0.2g，0.125mM EDTA 8Ml,肝素钠 0.2g，1Mm HEPS 4.6Ml） 0.025%胶原酶（胶原酶12.5mg，L-15无血清培养基50Ml）Pecoll分离液：9份Pecoll+1份10×D-PBS（PH7.4）制成分离液。 3、实验步骤： 1．ICR小鼠禁食过夜。 2．取ICR小鼠，用20%乌拉坦或水合氯醛0.2-0.3ml腹腔麻醉。3．10-15min后固定小鼠，75%酒精消毒腹部后正中切开打开腹腔并更换器械。 4．显露肝门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下腔静脉2-3cm，置一结扎线，暂不结扎。 5．穿刺针插入肝下腔静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵，输液器亦可）同时剪断肝门静脉远端。 6．从门静脉入肝素，使小鼠全身肝素化，并持续灌注至肝脏呈米黄色。 7．换肝素钠为胶原酶消化液（37℃预热）循环灌注消化，至肝质变

软，压之凹陷不易恢复。 8．停止灌注，小心剪取个肝叶置入消毒平皿内，加入约20mlDMEM 培养基（含血清，4℃预冷）祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。 9．200目筛网过滤入15ml离心管，100rpm离心5min。去上清，沉淀加入DMEM培养基（含血清，4℃预冷）7ml重悬。 10．取等体积肝细胞悬液悬浮于Pecoll分离液，颠倒混匀。11．4℃1000rpm离心10min，弃上清液，用PBS清洗肝细胞2次，4℃1000rpm离心10min。 12．肝细胞沉淀加入（含血清）重悬为3ml，取适量计数并用台盼蓝（3：1）判断活率。 13．活率在90%以上的肝细胞按2×103细胞密度接种于96孔板，每孔加入100ul DMEM培养基，于37℃ 5% CO2条件下培养24h。14．将化合物用DMSO稀释到所需浓度，每孔加药1ul（化合物终浓度通常为1000uM起始，10×梯度稀释，6个梯度），空白对照加入1ulDMSO。 15．细胞于37℃ 5% CO2条件下培养24h后，加入100ulATP检测试剂，震荡孵育10min。 16．于酶标仪上读取每孔荧光值。 17．计算各药物处理组细胞存活率。