沙门菌鞭毛蛋白作为偶联疫苗载体的应用
中国生物制品学杂志2016年7月第29卷第7期Chin J Biologicals July 2016，Vol.29No.7
鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要成分，
其亚单位呈紧密螺旋状缠绕而形成中空管状结构的丝状体，若干鞭毛丝状体组装成鞭毛。毛不仅是细菌的运动器官，也是细菌的一种感受器官。沙门菌是周毛菌，
其鞭毛具有特殊的抗原性，称为H 抗原，是沙门菌
分型的依据之一。沙门菌的鞭毛分为两相，第一相鞭毛的丝状体由鞭毛蛋白FliC 构成，第二相鞭毛的丝状体由鞭毛蛋白FljB 构成，FliC 和FljB 基因交替
表达，
即所谓的相变换。鞭毛蛋白氨基酸序列的N ?末端和C ?末端区域是序列保守区，而中间区域是序列变异区，晶体结构显示，沙门菌鞭毛蛋白回折使其N ?末端与C ?末端靠拢，形成如大写的希腊字母γ的形状［1］，N ?末端与C ?末端组成鞭毛蛋白的功能区域，并处于鞭毛丝状体的内部，而鞭毛蛋白中央的
变异区则暴露在鞭毛蛋白丝状体的表面。作为Toll
样受体5（Toll ?like receptors 5，TLR5）等先天性免疫系统受体的配体，沙门菌鞭毛蛋白是一种强效的蛋白型佐剂，已尝试应用于多种病原体疫苗，且作为载体蛋白在偶联疫苗的研制中呈现出良好的应用前景。
1沙门菌鞭毛蛋白的免疫佐剂活性
沙门菌鞭毛蛋白是具有强免疫原性的蛋白，在
不加入任何佐剂的情况下，
可诱导出强烈的局部和全身体液免疫应答，诱导的免疫应答具有一定的抗沙门菌作用。沙门菌的鞭毛蛋白同时又具有较强的免疫佐剂作用，早期工作中将一些抗原表位基因插
入减毒沙门菌鞭毛蛋白的变异区基因中，
使菌株表沙门菌鞭毛蛋白作为偶联疫苗载体的应用
钱锋综述，徐沪济审校
第二军医大学附属长征医院风湿免疫科，
上海200003摘要：鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要成分，
通过聚合鞭毛蛋白单体形成鞭毛的丝状体。鞭毛蛋白的N ?末端和C ?末端区域相互靠拢形成功能区域，该区域处于鞭毛丝状体的内部；中间区域是序列变异区，暴露于鞭毛丝状体表面。沙门菌鞭毛蛋白具有特殊的抗原性，称为H 抗原，是沙门菌分型的依据之一。作为Toll 样受体5（Toll ?like receptors 5，TLR5）等先天性免疫系统受体的配体，沙门菌鞭毛蛋白是一种强效的蛋白型佐剂，已广泛应用于细菌、
病毒和寄生虫的疫苗研制。本文就沙门菌鞭毛蛋白作为载体蛋白在偶联疫苗的应用作一综述。关键词：沙门菌；鞭毛蛋白；偶联疫苗；
载体蛋白中图分类号：R378.2+2R392?33文献标识码：A 文章编号：1004?5503（2016）07?0765?05
Application of Salmonella flagellin as carrier protein of
conjugate vaccine
QIAN Feng,XU Hu ?ji
Department of Rheumatology and Immunology,Shanghai Changzheng Hospital,
Second Military Medical University,Shanghai 200003,China Corresponding author:QIAN Feng,E 鄄mail:fqian_cn@https://www.wendangku.net/doc/331560303.html,
Abstract ：Flagellin is a main component of bacterial flagella.By polymerization,flagellin monomers form flagellar
filament.The N ?and C ?terminal regions of flagellin are in close proximity and compose its functional domain which is buried in the center of filament.The central fragment of flagellin is a variable region exposed on the surface of filament.Salmonella flagellin is named as H ?antigen because of its antigen specificity,which is employed as a basis for Salmonella serotyping.As a ligand of some innate immune system receptors such as Toll ?like receptor 5（TLR5）,Salmonella flagellin is a potent protein ?adjuvant and widely used in the preparation of vaccines against bacteria,viruses and parasites.In this article,the application of Salmonella flagellin as a carrier protein of conjugate vaccine is reviewed.Key words ：Salmonella;Flagellin;Conjugate vaccine;Carrier protein
·综述·
通讯作者：钱锋，E ?mail ：fqian_cn@https://www.wendangku.net/doc/331560303.html,
765··
DOI ：10.13200/https://www.wendangku.net/doc/331560303.html,ki.cjb.001385 网络出版时间：2016-07-14 13:46:01
网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/331560303.html,/kcms/detail/22.1197.Q.20160714.1346.044.html
达含异源抗原表位的杂合鞭毛蛋白，用重组菌或从重组菌中分离纯化的杂合鞭毛蛋白，通过黏膜或注射免疫动物，在免疫动物中可激发出异源抗原表位特异的局部和全身体液免疫应答。
近年来，沙门菌鞭毛蛋白作为佐剂已得到越来越多的应用，无论是与抗原混合还是与抗原融合表达，经注射免疫还是黏膜免疫，均显示出良好的免疫佐剂作用［2?5］，已尝试应用于细菌［6?10］、病毒［11?12］和寄生虫［13?14］等多种类型病原体的多肽和蛋白疫苗中，也可用于增强病毒疫苗株的免疫作用，如将沙门菌鞭毛蛋白与甲型H1N1流感病毒灭活株混合使用［15］或将其基因插入至猴副流感病毒SV5基因中表达［16］。近期研究显示，沙门菌鞭毛蛋白还可作为
DAN疫苗的佐剂［17］。当抗原与沙门菌鞭毛蛋白融合表达时，抗原可融合在沙门菌鞭毛蛋白的N?末端，也可融合于C?末端，甚至可插入其氨基酸序列的可变区中，均不破坏沙门菌鞭毛蛋白的生物活性，但具体采用哪种融合方式应视不同抗原而定。与沙门菌鞭毛蛋白融合表达的两个甲型流感病毒疫苗已完成I期临床试验，试验结果显示，融合蛋白在人体内具有良好的免疫原性和安全性［18?19］。
在鼠疫杆菌疫苗的应用中，研究者将鼠疫杆菌的抗原与鼠伤寒沙门菌的重组鞭毛蛋白混合，将混合蛋白经鼻黏膜或气管黏膜免疫小鼠，在无任何佐剂的情况下均可激发较高的抗原特异性抗体应答，且在第2次免疫后的12周内，抗体水平无明显降低，用致死型鼠疫杆菌攻击免疫小鼠，存活率达到93%~100%；而鼠疫杆菌的抗原单独免疫后未检测到相应抗体应答。将混合蛋白通过鼻黏膜或肌肉注射免疫短尾猕猴，也均可激发较高的特异性抗体应答［6］。研究者进一步将鼠疫杆菌抗原与沙门菌鞭毛蛋白融合表达，获得与混合蛋白相同的免疫效果，而所需的免疫剂量远低于混合蛋白［7］。在这些动物实验中，均未发生由于使用沙门菌鞭毛蛋白作为佐剂而诱导IgE介导的过敏反应，且动物体内已存在的抗鞭毛蛋白抗体不影响鞭毛蛋白的佐剂效果。
2沙门菌鞭毛蛋白佐剂活性的可能机理
TLR属于一类模式识别受体，识别病原体相关分子模式或危险/损伤相关分子模式，存在于多种免疫细胞和非免疫细胞中，在先天性免疫反应中发挥重要作用［20］。当宿主免疫系统遇到病原体时，抗原递呈细胞摄取病原体的抗原，加工后与MHC分子结合，作为第1信号通过T细胞受体呈递给T细胞，同时，病原体的相关分子模式刺激抗原递呈细胞中的TLR，通过信号级联传递最终使抗原递呈细胞上调协同刺激分子，提高促炎细胞因子和趋化因子的分泌水平，这些分子和因子作为第2信号作用于T 细胞。在这两种信号的共同作用下，使T细胞活化，从而启动获得性免疫应答。因此，许多TLR的配体和激动剂均是较强的免疫佐剂。
细胞外的沙门菌鞭毛蛋白是TLR5的配体［21］。TLR5是I型跨膜蛋白，位于细胞表面，胞外区序列中有多个富含亮氨酸的重复基序（leucine?rich repeats，LRR）识别鞭毛蛋白，胞内区起信号传递的功能，其序列与IL?1受体胞内区序列同源，因此称为Toll/ IL?1R（TIR）区域。TLR5分布广泛，在上皮细胞、内皮细胞、粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞、NK细胞、树突细胞等细胞上均检测到TLR5的转录和/或表达。TLR5信号传递是髓样分化因子88（myeloid differe?ntial factor88，MyD88）依赖的，衔接分子MyD88接受来自TLR5的信号，通过信号级联反应使核转录因子?κB（nuclear factor kappa B，NF?κB）的抑制因子发生磷酸化和泛素化而降解，NF?κB得以释放，从细胞质移入细胞核内，与靶基因上的特定序列结合促使一些促炎细胞因子、趋化因子和协同刺激分子的合成，也可通过激活剂蛋白?1（activator protein?1，AP?1）调控这些因子和分子的合成［20?21］。用鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白体外刺激单核细胞来源的人未成熟树突细胞，可使树突细胞成熟，上调协同刺激分子，增强促炎细胞因子和趋化因子的分泌，由鞭毛蛋白刺激成熟的树突细胞可在体外促进CD4+T细胞的分化［22］。
沙门菌鞭毛蛋白的免疫佐剂作用与TLR5途径有关［23］，将来源于CD11c?DTR?GFP转基因小鼠的骨髓细胞（猴霍乱毒素受体和绿色荧光蛋白的表达受CD11c启动子的调控，注射一定剂量的霍乱毒素后，85%~90%的CD11c+细胞可被清除）分别与TLR5基因敲除小鼠及野生型小鼠的骨髓细胞等比例混合，移植经辐射照射的C57BL/6小鼠，构建两种骨髓杂合小鼠（分别称为骨髓杂合鼠1和骨髓杂合鼠2），再向两种骨髓杂合小鼠分别移植CFSE?OT?ⅡT细胞（荧光染料CFSE标记的卵清蛋白OVA特异T4细胞），向骨髓杂合小鼠注射了一定剂量的霍乱毒素后，用融合表达的OVA?鞭毛蛋白免疫小鼠，结果发现，骨髓杂合鼠1中CFSE?OT?ⅡT细胞的增殖大幅下降，而在骨髓杂合鼠2中未受霍乱毒素的影响，如果用PBS替代霍乱毒素，骨髓杂合鼠1中CFSE?OT?ⅡT细胞增殖未发生下降。该实验直接证明了TLR5
途径参与了沙门菌鞭毛蛋白的免疫佐剂作用［23］。
细胞内的沙门菌鞭毛蛋白是NOD样受体（nu?cleotide binding oligomerization domain?like receptor，NLR）家族成员NLRC4（又称IPAF）的配体［24］。NLR 家族成员的蛋白分子由3部分组成：N?末端是信号传递的功能结构域，中间是NOD结构域（又称NA?CHT盒），C?末端是具有识别功能的LRR结构域。根据N?末端功能结构域的不同，将NLR家族成员分为NLRA、NLRB、NLRC和NLRP4个主要的大类，其中NLRC的N?末端含CARD（caspase recruiting domain）结构域。NLRC4在感知进入胞质中的鞭毛蛋白后构型发生改变并聚合成寡聚体，与衔接分子ASC（apo?ptosis associated speck like protein containing a C?terminal CARD）和caspase?1前体分子构成所谓的炎症体（inflammasome），即NLRC4炎症体，激活cas?pase?1前体成为有活性的caspase?1，后者使IL?1β和IL?18前体分子成为有活性的IL?1β和IL?18分子［1］。将OVA与沙门菌鞭毛蛋白混合，注射免疫TLR5或NLRC4敲除小鼠，与野生型小鼠比较，抗OVA抗体水平未发生明显下降，但以同样的方式免疫TLR5和NLRC4基因双敲除小鼠，则抗OVA抗体水平明显下降，表明NLRC4途径也应参与了沙门菌鞭毛蛋白的佐剂作用［25］，但其在该过程中的作用机理尚不明确。当沙门菌鞭毛蛋白作为黏膜佐剂时，其佐剂活性是通过TLR5途径直接激活黏膜上皮细胞和间接激活传统树突细胞实现的［26?27］，与NLRC4炎症体途径无关［26］。
有研究表明，TLR11也可识别沙门菌鞭毛蛋白［28］，其主要表达于小鼠上皮细胞及小鼠巨噬细胞和树突细胞，但人不表达TLR11，TLR11的信号传递也是MyD88依赖的。将OVA与沙门菌鞭毛蛋白混合，分别免疫TLR5和MyD88敲除小鼠，抗OVA抗体水平在TLR5敲除小鼠中未发生明显下降，而在MyD88敲除小鼠中则明显下降，可能是TLR11途径也涉及沙门菌鞭毛蛋白的佐剂作用［29］。如果TLR11的确涉及沙门菌鞭毛蛋白在小鼠中的佐剂作用，则在小鼠中评价以沙门菌鞭毛蛋白为佐剂的人用疫苗时，最好使用TLR11敲除小鼠，以排除TLR11的影响。
3沙门菌鞭毛蛋白作为偶联疫苗的载体
偶联疫苗是通过化学的方法在体外将抗原与其他分子连接在一起的一种疫苗类型，多数应用于病毒、细菌的多肽和多糖疫苗，通过与载体蛋白的偶联使作为半抗原的多肽和多糖成为全抗原，一些多肽和多糖的偶联疫苗已完成临床试验［30?31］。通过偶联也可提升弱免疫原的免疫原性，如一些免疫原性低下的蛋白抗原［32］。偶联可使一个疫苗分子上含有多个抗原分子，从而增强免疫刺激作用，如载体分子具有佐剂活性，则偶联使抗原与载体结合成为一个分子，免疫时抗原与载体可针对同一个抗原递呈细胞，从而增强载体的佐剂作用。细菌的去毒外毒素和无毒的外毒素突变体及一些细菌的外膜复合体是常用的偶联疫苗载体蛋白，如铜绿假单胞菌外毒素突变体（exoprotein A，EPA）、白喉毒素突变体（cross?
reacting material197，CRM197）和B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物（out?membrane protein complex，OMPC）［33］，但这些载体蛋白制备复杂，部分有专利保护，且细菌的外毒素均不含模式识别受体的配体或激动剂成分，限制了其应用。
沙门菌鞭毛蛋白无论是与抗原单纯混合还是融合表达，均显示出较强的佐剂活性，但较少有将沙门菌鞭毛蛋白作为偶联疫苗载体的研究，可见的几篇报道是将沙门菌鞭毛蛋白与细菌多糖偶联，如与沙门菌核心和O多糖偶联构建双价疫苗［34?35］，以及尝试与金黄色葡萄球菌荚膜多糖偶联，用于动物乳腺炎的预防［36］，最近，有研究将沙门菌鞭毛蛋白作为偶联载体来提高可卡因疫苗的免疫原性［37］。由于表位肽可激发特定的免疫反应，随着生物技术的快速发展，用计算机可预测有特定作用的表位序列，经人工合成高纯度的表位肽，使表位肽疫苗得到越来越广泛的应用，但如何提高表位肽的免疫原性从而增强免疫效果仍是一个棘手的问题。因此，本实验室开展了以沙门菌鞭毛蛋白作为表位肽偶联载体的研究，通过将表位肽与沙门菌鞭毛蛋白偶联来提高表位肽的免疫原性，并评估其作为偶联载体的应用价值。
用化学连接剂Sulfo?EMCS在纯化的重组FliC 蛋白上通过伯胺基添加马来酰亚胺基团，人工合成恶性疟原虫输出蛋白1的一个B细胞表位肽EXP?153（CDNNLVSGP，N?末端的一个半胱氨酸为人为添加，用于偶联反应），马来酰亚胺修饰的FliC与合成肽EXP153反应，形成偶联产物EXP153?rFliC。Ell?man反应检测偶联产物的偶联比约为4∶1（肽与载体蛋白的摩尔数比），生物活性检测显示，无论是化学修饰还是偶联，FliC均未明显失去TLR5配体的生物活性［38］。用EXP153?rFliC经皮下注射免疫BALB/c小鼠，在无任何其他佐剂的情况下，可激发出高效价的肽特异性IgG抗体，且该抗体可识别疟
原虫的天然抗原；而表位肽EXP153与FliC的单纯混合在小鼠中未激发出肽特异性抗体［38］。用EXP?
153?rFliC经鼻腔免疫BALB/c小鼠，同样在无任何其他佐剂的情况下，不仅在小鼠血清中检测到高效价的肽特异性IgG抗体，且在小鼠的肺灌洗液和鼻腔冲洗液，甚至在小肠和阴道冲洗液中均检测到肽特异性IgA抗体（具体资料未发表）。因此，沙门菌鞭毛蛋白作为偶联载体时具有黏膜佐剂活性，是一个具有较大应用潜力的肽偶联疫苗载体蛋白。
4展望
我们已建立起以沙门菌鞭毛蛋白为载体的肽偶联技术平台，今后的工作将利用该平台开展病原体肽疫苗的研究工作。首先进行以沙门菌鞭毛蛋白为载体的A族链球菌（group A streptococcus，GAS）M 蛋白肽疫苗的研究，GAS与风湿热和风湿性心脏病的发病密切相关，这两种疾病严重危害少年儿童的健康和生命，阻断GAS的感染将会极大降低这两种疾病的患病风险［39］。
在类风湿关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病治疗中，如何通过提高免疫调节能力来降低个体对自身抗原过强的免疫反应是这类疾病治疗的一个新思路。用T调节细胞（Treg）表位肽制备的肽疫苗已尝试用于治疗多种自身免疫性疾病［40?41］，有些已进入临床试验。通过这种表位肽疫苗来刺激Treg的活性，抑制T效应细胞的活化与增殖，从而维持机体的免疫应答稳态，降低甚至消除自身免疫反应对机体的伤害。这些治疗性Treg表位肽疫苗同样需要佐剂来激发有效的免疫反应，例如氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、霍乱毒素B亚单位、Toll样受体9激动剂CpG?ODN等，均取得了一定增强免疫作用的效果［42］，但这些佐剂在Treg表位肽疫苗中的应用具有各自的局限性。今后应开展以沙门菌鞭毛蛋白为偶联载体的Treg表位肽疫苗的研究，以期增强Treg表位肽的免疫效果。
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收稿日期：2015?07?20编辑：李靓
伤寒沙门杆菌
伤寒、副伤寒沙门菌感染 伤寒、副伤寒沙门菌感染主要是通过消化道传播，少部分也可通过微生物或感染性材料的胃肠道外接种传播。伤寒由伤寒沙门菌引起，副伤寒由副伤寒甲、乙、丙沙门菌引起。沙门菌还可引起胃肠炎和败血症。伤寒沙门菌进入消化道后，未被胃酸杀灭的细菌进入小肠，在肠腔内碱性环境、胆汁和营养物质的适宜条件下繁殖。伤寒沙门菌入侵肠黏膜，经淋巴管进入肠道淋因组织及肠系膜淋巴结继续繁殖，再由胸导管进入血流，引起第一次菌血症。此阶段属潜伏期，患者无症状。伤寒沙门菌随血流进入肝脾、胆囊、骨髓等组织器官内继续大量繁殖，再次进入血流引起第二次菌血症，释放内毒素，产生临床症状（相当于初期）。（腹痛）病程第2～3 周，伤寒沙门菌继续随血流播散全身，经胆囊进入肠道，大量细菌从粪便排出。来自胆囊的伤寒沙门菌，部分通过小肠黏膜，再次入侵肠道淋巴组织，使原已致敏的肠道淋巴组织产生严重炎症反应，加重肠道病变。在所有肠道病原感染中，伤寒沙门菌（Salmonella typhi）感染是最严重的，伤寒沙门菌内毒素是重要的致病因素。但伤寒持续发热的发生机制则主要是由于病灶中的单核-吞噬细胞和中性粒细胞释放内源性致热原所致。随着机体免疫反应，尤其是细胞免疫作用的发展，细胞内伤寒沙门菌逐渐被消灭，病变亦逐渐愈合，患者随之恢复健康。少数患者在病愈后，由于胆囊长期保留病菌而成为慢性带菌者。副伤寒致病机制与伤寒类似。 从临床表现上看伤寒的潜伏期为7~23d ，一般为10~14d。病程第1 周，起病大多缓慢。发热，常伴全身不适、乏力、食欲减退、咽痛和咳嗽等。病情逐渐加重，体温呈梯形上升，可在5~7d 内高达39~40℃。病程第2~3周常出现伤寒的典型表现，如高热、稽留热持续10~14d；出现明显食欲不振、腹部不适、腹胀、便秘、腹泻等消化道症状；尚可出现精神恍惚、表情淡漠、呆滞、反应迟钝、听力减退等神经系 统症状，重者可出现谵妄、昏迷、病理反射等中毒性脑病表现；常有相对缓脉或有重脉； 肝脾肿大；部分患者于病程7~13d 皮肤出现淡红色玫瑰疹。肠出血、肠穿孔等并发症较多在本期出现。病程第3~4周体温出现波动，并开始逐步下降。病程第 5 周体温恢复正常， 食欲好转，通常在 1 个月左右完全康复。 副伤寒甲、乙潜伏期为2~15d ，一般在8~10d 。起病时可有急性胃肠炎症状，如腹痛、呕吐、腹泻等。2~3d 后出现发热等伤寒临床表现，胃肠炎症状减轻。弛张型发热较多见，每天波动大，热程较短（副伤寒甲平均3 周，副伤寒乙2 周），毒血症状较轻，但胃肠症状明显（副伤寒乙尤为多见）。玫瑰疹出现转早、较多、较大，颜色较深。 副伤寒丙临床表现复杂，起病急，体温上升快，不规则热型，常伴寒战。主要表现为败血症型，其次为伤寒或胃肠炎型。热程一般约2~3 周。 二、细菌的生物学特性 伤寒、副伤寒甲乙丙均属于肠杆菌科、沙门菌属，为革兰氏阴性直杆菌，大小
解偶联蛋白2的功能调控方式
解偶联蛋白2的功能调控方式 解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）是线粒体内膜的一类线粒体载体蛋白。大量的研究结果显示，UCP功能的异常与多种疾病关系密切。UCP2是UCP的一种重要类型，现综述概括UCP2的主要功能调控方式以及这些调控的生理意义。 肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病、免疫失调等慢性疾病是严重影响人民群众身心健康的重要公共卫生问题。深入探讨这些疾病发生的分子机制并在此基础上探索有效的防护措施具有重要的意义。解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）属于一类存在于线粒体内膜的线粒体离子转运体家族成员。近年的研究发现解偶联蛋白在前述多种慢性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。而其本身的功能又受到多种机制的调控，现对这方面的进展进行综述。 1 解偶联蛋白概述 线粒体是真核细胞内主要的供能细胞器，通过对底物的降解反应产生ATP。在这个过程中，通过质子电化学梯度将底物的氧化与A TP合成偶联起来。但这种偶联并不是绝对的，质子可以通过线粒体内膜漏出（质子漏）而不引起A TP的产生，这个过程中一部分氧化产生的能量最后以热量的形式被消耗掉。质子漏与解偶联蛋白相关联，通过允许质子进入线粒体基质的方式，解偶联蛋白使质子梯度下将，从而导致氧化呼吸链的解偶联以及热量的产生[1]。最具特征性的解偶联蛋白为UCP1，UCP1在1978年被鉴定并在1988年被首次克隆。UCP1表达于棕色组织，在寒冷和食物所导致的非寒战性产热过程中发挥重要作用[2]。1997年，2种与UCP1相似的基因被克隆并分别命名为UCP2和UCP3。随后又筛选出2种新的UCP1相似物，并被分别命名为UCP4和UCP5/BMCP[3]。在各种UCP中，UCP2的组织分布最为广泛。 2 UCP2功能概述 人类的UCP2基因定位于11号染色体，主要表达于脂肪组织、骨骼肌、脾、肺、胰腺的β细胞以及巨噬细胞。虽然结构与UCP1相似，但是干扰、抑制UCP2的表达不会导致肥胖以及对寒冷敏感性的升高[4]。关于UCP2是否参与对寒冷应答的研究结果不尽一致，一般认为它不是主要的产热调控因子。但当特定的效应因子激活时，UCP2同样可以发挥促进产热的作用。由于对偶联过程、活性氧产物（ROS）产生以及脂肪酸代谢等多方面都有着广泛的影响，UCP2已经被发现参与多种生理、病理过程，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、感染、衰老、肿瘤发生等。例如UCP2能够抑制β细胞分泌胰岛素，从而与Ⅱ型糖尿病有关[5]。UCP2诱导质子漏的一个重要作用是减少线粒体ROS的产生。UCP2的高表达可预防氧化损伤，而抑制UCP2的表达则可在多种细胞类型中促进氧化损伤[6]。此外，UCP2还通过缓解氧化应激抑制结肠癌以及动脉粥样硬化的发生[7]。 3 UCP2功能调控 3.1 遗传多态性在加拿大魁北克开展的一项人群研究发现UCP2基因的3个微随体与能量消耗有关[8]。此外，UCP2启动子866有一个G/A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。而该SNP被证实与血液三酰甘油、总胆固醇以及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）胆固醇水平有关[9]。在Ⅱ型糖尿病患者，866-A等位基因携带者的胰岛素分泌能力比G等位基因携带者要低得多[10]。在德国的高加索人中，携带同样等位基因的糖尿病患者神经病变发生危险性显著降低[11]。而在中国人、马来人以及印度人，携带同样等位基因者拥有更高的腰/臀比，同时代谢性综合征的危险性也增高[12]。虽然在女性韩国人866-G等位基因携带者UCP2的表达和转录水平都显著降低，同时具有更高的体重指数（body mass index，BMI）以及脂肪量[13]，拥有866-G等位基因的澳大利亚高加索人却拥有较低的血清三酰甘油以及较高的胰岛素敏感性水平[14]。另外，UCP2基因4号
PyBOP_多肽偶联试剂_128625-52-5_Apexbio
客户使用Apexbio产品发表的文献 COA (Certificate Of Analysis) MSDS (Material Safety Data Sheet) SDF benzotriazol-1-yloxy(tripyrrolidin-1-yl)phosphanium;hexafluorophosphate C1CCN(C1)[P+](N2CCCC2)(N3CCCC3)ON4C5=CC=CC=C5N=N4.F[P-](F)(F)(F)(F)F 分子量 Soluble in water or 1% acetic acid储存条件
一般建议为了使其更好的溶解，请用37℃加热试管并在超声波水浴中震动片刻。储液可以在零下20℃中保存数月。 运输条件试用装：蓝冰运输。 其他可选规格：常温运输或根据您的要求用蓝冰运输。 产品描述 IC50值：N/A 作为BOP（其中二甲氨基由吡咯烷基替代）的类似物，PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)是用于固相多肽合成的多肽偶联剂。作为在肽键形成中具有等价性能 的BOP的唯一类似物，PyBOP广泛用作BOP的替代物，以此避免形成致癌副产物六甲基磷酰胺（HMPA）。其毒性经广泛报道后，最近HMPA作为危险化学品被列入“塞韦索名单”。在液相和固相多肽合成中，BOP均是一种良好的多肽偶联剂。然而，在生产和使用BOP的过程中，HPMA的形成不可避免[1]。 体外实验：在与BOP相同的条件下，将PyBOP作为偶联剂进行耦合试验。在包含N端保护的氨基酸的DCM摩尔溶液中，加入以下化合物：偶联剂、C端保护的氨基酸盐酸及DIEA。甚至在氨基酸受阻的情况下，通过薄层色谱（TLC）监测可观察到即时反应。此外，外消旋作用似乎比Young测试中BOP存在时低50%，且在Anteunis测试中具有优势[1]。 体内实验：到目前为止，还没有报道过体内数据。 临床试验：到目前为止，还未进行临床试验。 参考文献： [1]Coste J, Le-Nguyen D and Castro B. PyBOP@: A new peptide coupling reagent devoid of toxic by-product. Tetrahedron Lett. 1990 Mar; 31(2): 205-8.
沙门氏菌感染
沈阳儿童医院PICU 2020-05-11
医院污物种类 根据医院用品的危险性分类及其消毒、灭菌的原则 医院日常清洁、消毒、灭菌工作 病理性放射性 化学性 各种感染性 创伤性 药剂 爆炸性 一般生活性
患儿女，2个月15天，以“发热、腹泻4天”为主诉入院。 病例简介 查体 患儿于入院前4天总有无明显有瘾出现发热，体温最高39.2℃，无寒战及抽搐，口服“对乙酰氨基酚”体温可降至 37.5℃，间隔月6-7小时反复发热，伴有腹泻，每日排7-8次黄绿色粘液变，口服“琥乙红霉素”0.1克，日2次，“电解质泡腾片”随服，“酪酸梭菌二联活菌散”500mg，日2次，治疗4天病情无好转，入院当天大便可见血丝，再次来我院，急诊以“细菌性痢疾”为诊断收入院，患儿病后精神状态一般，有鼻塞，偶有喉中痰鸣，无咳嗽及喘息，人工喂养，配方奶 120ml/次，无呕吐及腹胀，尿量略少 T：36.9℃，P：154次/分，R：44次/分，BP：94/46mmHg,意识清楚，状态反应可，全身皮肤无黄染，皮肤弹性可，无皮疹及出血点，全身浅表淋巴结无肿大。前囟平坦，2.0*2.0cm，对光反射 灵敏，无鼻扇，口唇粘膜略干燥、无发绀，口腔粘膜光滑，眼部粘膜充血，颈软无抵抗，无三凹征，双肺叩诊轻音，双肺呼吸音粗糙，心前区无隆起，心尖搏动范围正常，心浊音界无扩大，心率：154次/分，节律齐，心音有力，心前区可闻及2/6级收缩期杂音，无心包摩擦感，腹部略膨隆，柔软，无压痛，无包块，肝下界在中线肋缘下1cm，质地软，脾肋下未触及。肠鸣音4次/分。 现病史
根据医院用品的危险性分类及其消毒、灭菌的原则 治疗 2020-04-29本院便常规：白细胞（高倍视野>40个/HPF）红细胞（高倍视野20-25个/HPF），潜血阳性。血常规：白细胞计数：11.9*109/L， 中性粒细胞百分比54.5%，淋巴细胞百分比31.5%，CRP 14.36mg/L。胸部正侧位DR：双肺纹理增强、左下肺纹理模糊，双肺透光度良好，双肺门不大。 入院后肠道菌群：细菌总数较正常减少，G+杆菌明显减少，G-杆菌减少，G+球菌增加，印象诊断：II度菌群失调。2020-05-01脑脊液常规：外观无色透明液体，潘氏蛋白定性阴性，脑脊液细胞计数2*106/L，脑脊液生化：脑脊液蛋白0.26g/L，脑脊液氯化物122.1mmol/L，脑脊液葡萄糖 2.90mmol/L。脑脊液图片：未见细菌。头部MRI：双侧颞额蛛网膜下腔增宽，枕大池大。血培养：沙门菌属某些种菌，头孢曲松、环丙沙星敏感。 入院后予头孢米诺静滴、干扰素泵吸抗感染治疗，有鼻塞及喉中痰鸣，予布地奈德、特步他林泵吸局部抗炎，口服微生态制剂调节肠道菌群，口服蒙脱石散保护肠道粘膜，口服补液盐频服、静脉补液支持治疗。第2病日患儿仍有发热，发热峰值下降、发热间隔延长，第3日，便培养：沙门菌属某些种菌，血培养阳性，复查血培养，完善腰穿除外颅内感染。第4病日，日内体温最高37.5℃，予物理降温可降至正常。第4病日，患儿睡眠时偶有喉鸣音，补充诊断：先天性喉喘鸣，自备维生素AD口服。第6病日，热退，复查血常规及CRP等炎性指标。 辅助检查
G蛋白偶联受体
G蛋白偶联受体标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
：G-protein coupled receptor 一种与三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体。含有7个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有1000多个。与配体结合后通过激活所偶联的G蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应。 G蛋白偶联型受体是具有七个跨膜螺旋的受体，在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。与G蛋白偶联受体有关的信号通路有：腺苷酸环化酶系统（AC系统），磷酸肌醇系统，视网膜光电信号传递系统，与嗅觉相关的信号传导系统，一氧化氮系统等。三聚体GTP结合调节蛋白（trimeric GTP-binding regulatory protein）简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由α、β、γ三个亚基组成，α 和γ亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G 蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当α亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，α亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS（regulator of G protein signaling）增强。RGS也属于GAP（GTPase activating protein）。G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内。G蛋白耦联型受体包括多种神经递质、肽类激素和趋化因子的受体，在味觉、视觉和嗅觉中接受外源理化因素的受体亦属G蛋白耦联型受体。由G蛋白耦联受体所介导的细胞信号通路主要包括：和磷脂酰肌醇信号通路。（一）cAMP信号途径在cAMP信号途径中，细胞外信号与相应受体结合，调节腺苷酸环化酶活性，通过第二信使cAMP水平的变化，将细胞外信号转变为细胞内信号。 1、cAMP信号的组分①.激活型激素受体（Rs）或抑制型激素受体（Ri）；②.活化型调节蛋白（Gs）或抑制型调节蛋白（Gi）；③.腺苷酸环化酶
多肽合成方法
多肽合成中肽键形成的基本原理 一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。 在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。 因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚： 第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在； 第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。 第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。 由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。 在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。 在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。 多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。 最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
第3节：G蛋白偶联受体介导的信号转导
途径一：激活离子通道的G 蛋白偶联受体所介导的信号通路 G 蛋白偶联受体介导的信号转导受体：G 蛋白 结构三个亚基组成 G α：分子开关锚定在膜上 G β、G γ：二聚体形式，锚定在膜上 7次跨膜α螺旋（右图上） N 端在胞外、C 端在胞内激活的普遍机制（右图下） 根据效应蛋白分类 1、激活离子通道的G 蛋白偶联受体 2、激活或抑制腺苷酸环化酶，以cAMP 为第二信使的G 蛋白偶联受体 3、激活磷脂酶C ，以IP 3和DGA 作为双信使的G 蛋白偶联受体 三类方式比较典型例子心肌细胞M 乙酰胆碱受体激活G 蛋白开启K +通道附图p168（下图⑤）Gt 蛋白偶联的光敏感受体的活化诱 发cGMP 门控阳离子通道的关闭 附图p168（下图⑥） 第二信使：cGMP
图⑤ 图⑥ 途径二：激活或抑制腺苷酸环化酶的G 蛋白偶联受体 腺苷酸环化酶的G 蛋白偶联受体 刺激AC 的物质 肾上腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素受体：刺激性激素受体（Rs ），Gs α抑制AC 的物质前列腺素、腺苷 受体：抑制性激素受体（Ri ），Gi αAC AC 结构12次跨膜蛋白C 端与N 端均在细胞内胞质侧有两个大的相似的结构域，跨膜区有两个整合结构域 AC 功能在Mg 2+或Mn 2+存在下，催化ATP 生成cAMP 蛋白激酶A （PKA ）未激活状态2个调节亚基与2个催化亚基结合激活状态激活物：cAMP 调节亚基与催化亚基分开作用底物特点磷酸化基序：X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-Φ（X ：任意AA ，Φ：疏水AA ）cAMP 与PKA 的结合协同方式（类似血红蛋白结合氧） cAMP 的降解环腺苷酸磷酸二酯酶（PED ）降解cAMP 生成5'-AMP 信号通路模式图p169（图⑦）cAMP-PKA 信号通道对肝细胞和肌细胞糖原代谢的调节p171（下图⑧）、对真核细胞基因表达的调控p171（下图⑨）
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联 方法简介 Last revision date: 13 December 2020.
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
沙门氏菌病
沙门氏菌病 沙门氏菌在各种动物以及人类当中分布广泛。其中有些菌株可导致猪病。 这种细菌主要在生长猪以及有些母猪的肠道内繁殖。感染猪只可连续数周甚至数月从粪便中排出病原，而不表现任何症状。在屠宰的时候，猪只肠道中的沙门氏菌可能污染胴体，导致人类食物中毒，对公共健康构成潜在威胁。 霍乱沙门氏菌S. choleraesuis和德比沙门氏菌S. derby对猪具有宿主适应性，感染母猪可携带病原很长时间。其中霍乱沙门氏菌有时会引发母猪的临床症状（体温升高、抑郁、败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎和腹泻），但很少引起人类的疾病。然而猪当中最常见的血清型是鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium，这种沙门氏菌有时会导致仔猪腹泻，更是导致人类食物中毒的一种主要原因。该沙门氏菌的有些毒株具有多种抗药性。如果确诊猪群中感染了这种病原，就应采取必要卫生措施，以防工作人员被感染。猪体内还常会检到一些以其它动物为宿主的沙门氏菌，但这些细菌不会导致发病。 发病与否与病原剂量有关，病原数量达到一定水平之后才会引发临床症状。 需要注意，鼠伤寒沙门氏菌是造成人类食物中毒的常见原因。这种病菌常可在猪身上检出。任何日龄猪只均可感染沙门氏菌病，8周龄以上生长猪更常见。典型的、严重的沙门氏菌病通常发生在12～14周龄阶段。 症状 断奶猪与生长猪 ?霍乱沙门氏菌会导致急性败血病和肺炎，表现发烧、厌食、呼吸困难、抑郁、咳嗽和生长缓慢等病症。 ?肢体末端（鼻、蹄、尾等部位）皮肤变蓝。 ?下痢恶臭，有时带血。这是个常见的典型症状。 ?肝脏受损时会表现黄疸，关节受损时会表现跛行。 ?患脑膜炎后会表现神经症状。 ?若不治疗，死亡率会上升。 ?鼠伤寒沙门氏菌感染可造成腹泻。 仔猪 ?仔猪通常可从初乳当中获得母源免疫，少见发病。 母猪 霍乱沙门氏菌感染和鼠伤寒沙门氏菌感染可能导致下列症状： ?体温升高。 ?精神抑郁。 ?食欲减退。 ?耳部、鼻吻部及尾部充血（皮肤变红）。 ?肺炎。 ?咳嗽。
羧基磁珠与蛋白偶联方法
羧基磁珠与蛋白偶联方法 来源：时间：2009-6-6 23:34:26 简介 BioMag 和BioMagPlus 超顺磁珠适用于磁分选细胞、细胞器、蛋白、免疫球蛋白、核酸及其它生物或非生物体系中的分子。BioMag 和BioMagPlus 磁珠表面不规则，因此具有比较大的表面积，可以增加磁珠与偶联分子的接触机率，提高偶联效率。此外，这两种磁珠90%以上为氧化铁，可以加快磁分选速度，这特别适用于大批量，高能量分选样品。 BioMag and BioMagPlus 磁珠采用的工艺制备，只不过BioMagPlus经过了另,外的去除细尘处理，偶联试剂盒中提供的就为此类磁珠。 BioMagPlus 羧基磁珠表面的羧基经过二亚胺EDAC活化后，即可以与蛋白偶联。 Bangs 公司的BioMagPlus Carboxy l Protein Coupling Kit 适用于蛋白与BioMagPlus 超顺磁珠的偶联，此kit提供了可供5次偶联的试剂和磁珠。 材料 ?BioMagPlus 羧基磁珠: 2.5mL，1.5μm ，20 mg/mL ?EDAC (1-ethy l-3-(3-dimethy laminopropyl)carbodiimide): 0.10g ?15mL 尖头离心管: 5 tubes ?BioMag 磁分离器 ?0.05M MES 缓冲液(pH 5.2): 2 x 175mL ?淬灭液(1M Glycine, pH 8.0): 25mL ?洗涤缓冲液: 125mL 实验步骤 活化 ?移取 0.5mL (10mg) 的 BioMagPlus 羧基磁珠至 15mL 尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清。 ?加 5mL of MES 缓冲液充分混匀洗涤. 将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 ?重复 Step 2, 三次. 最后一次洗涤后, 重悬磁珠于 5mL 的 MES 缓冲液中。 ?将 EDAC 从冷藏处取出置于室温30分钟。准确称取所需的EDAC (1.6mg EDAC/mg BioMagPlus 磁珠)加入装有磁珠的离心管内， ?剧烈振荡摇匀。 ?室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应 30 分钟。反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚积在一起。 ?将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 ?重复 Step 2, 四次。 蛋白偶联 计算需要偶联的蛋白，抗体量. 一般地，每mg活化的羧基磁珠可以偶联20-500ug的蛋白（抗体），
G蛋白偶联受体介导
G蛋白偶联受体介导的跨膜信号转导 1去甲肾上腺素作用于心肌细胞β 1 受体激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷作用于PKA使钙离子通道打开，钾离子通道抑制，使心肌收缩加快变强。 2乙酰胆碱作用于心肌细胞Μ2受体激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将GTP转变成环鸟嘌呤腺苷作用于PKA使钙离子通道关闭，钾离子通道开放，使心肌舒张。 3乙酰胆碱作用于心肌细胞Μ2受体激活G蛋白打开乙酰胆碱化学门控钾离子通道，使心肌收缩变弱减慢。 4乙酰胆碱作用于胃肠平滑肌细胞Μ3受体激活G蛋白启动PLC使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使肌肉收缩。 5去甲肾上腺素作用于胃肠平滑肌细胞β2受体激活相关的G蛋白启动，经过一系列作反应用降低了环磷酸腺苷浓度，进而抑制了胃肠平滑肌的收缩。 6去甲肾上腺素作用于血管内皮上的α1受体激活G蛋白启动PLC使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使内皮源因子产生，作用于平滑肌促进血管的收缩。
7乙酰胆碱作用于血管内皮上的Μ3受体激活G蛋白启动PLC 使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使内皮源舒张因子产生，释放NO, 作用于平滑肌促进血管的舒张。 8乙酰胆碱作用于唾液腺细胞Μ3受体激活G蛋白启动PLC 使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使细胞发生分泌的指令，产生大量的稀唾液。 9去甲肾上腺素作用于唾液腺细胞α1受体激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷作用于PKA使蛋白质水平磷酸化，进而促使细胞分泌少量浓稠的唾液。 10嗅细胞受体接受到外来气体的刺激激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷，作用于钠离子依赖性通道产生去极化进而兴奋。 11心房钠尿肽与受体结合刺激激活G蛋白启动鸟苷酸环化酶将GTP转变成环鸟嘌呤腺苷作用于PKG使蛋白质磷酸化引起C 内生物学效应，实现排钠、排水、血管舒张。 12.胰高血糖素与受体结合刺激激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷作用于PKA，引起蛋白质磷酸化，引起C内生物学效应，然后完成信号传导，实现功能。 13.催乳素与受体结合刺激激活G蛋白启动使GTP变为GDP激活PLC使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系
蛋白偶联操作步骤(20120503)
Bio-Plex 氨基耦联原理与操作 一、原理 Bio-Plex 氨基耦联试剂盒提供了一些缓冲液，用于将6－150kD分子量的蛋白质共价耦联到5.5um荧光染色的微珠上。耦联反应发生在微珠表面的羧基和蛋白质N末端的氨基上，进行羧胺反应。耦联后形成稳定的共价键，不会轻易脱落，甚至可保存数月。试剂盒可进行 30次反应，每次反应需要1.25×106 个羧基化的微珠（1倍浓度）。这种蛋白质耦联微珠可用 于蛋白质相互作用的研究。一般微珠反应得率为80％，即足够用在Bio-Plex上进行检测的每孔5000个微珠。 一般耦联需要3步：蛋白质准备，蛋白耦联和蛋白耦联验证。 A、蛋白质准备： 蛋白质样品的要求： 1、蛋白质分子量：6－150kD， 2、水溶性， 3、样品不得含有如叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它任何含自由氨基的添加物。 4、蛋白质必须溶解在PBS中，pH7.4。 5、必须摸索出最佳的耦联条件，主要是摸索蛋白质的使用量。 注意，不需要用最大量的蛋白质进行反应。 B、蛋白耦联：耦联反应分2步进行，微珠上的羧基在耦联前需要活化，EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]炭化亚胺）与微珠上的羧基反应形成一种活化的O-酰基异脲（O-acylisourea）中间体，在水溶液中用S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯基乙酰基三甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-MAG3）使这种中间体变得稳定。EDC耦联S-NHS产生了S-NHS-活化位点，O-酰基异脲和S-NHS的形成是氨基反应。但是S-NHS酯在生理pH下更稳定，随后这种中间体与蛋白质上的初级氨基反应形成酰胺键。如果这种中间体不能和氨基反应，中间体将脱水并产生羧基，释放出N-未取代脲。这些反应在数分钟内同时迅速反应。 C、蛋白质耦联验证：耦联反应结束后需要对微珠进行计数并验证耦联效率。 用PE（藻红素）标记的抗体连接到耦联的微珠上，再用Bio-Plex进行分析。 或者用生物素化的抗体反应再用Streptavidin-PE(链亲和霉素－藻红素)，机器读出的荧光信号直接与耦联在微珠表面上的蛋白量相关，如果荧光信号超过2000MFI可认为耦联成功。 二、耦联操作 A、蛋白质准备：如果样品不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它含自由氨基的添加物，并且已溶在PBS，pH7.4中，可测定蛋白质浓度后直接用于耦联；如果样品含有以上任何一种添加物，需要进行如下处理：使用Micro Bio-Spin 6微型柱进行更换缓冲液，1000g，2min 离心去除缓冲液，加入500ul PBS，1000g，2min离心，重复5次，20－75ul的样品上样到柱子中，1000g，5min离心，样品冰浴，测定蛋白质浓度后可直接用于耦联。 注意：更换缓冲液可能导致多达20％的蛋白质损失， 必须准备足够耦联反应所需的5－12ug的蛋白质 B、耦联反应：在所有试剂使用前必须解冻或回复到室温
沙门氏菌基本知识及检测方法
沙门氏菌基本知识及检测方法 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有2000多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属Salmonella 。本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。 根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(甲型、乙型、丙型)。第二类群：能引起人类食物中毒——食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。 一、沙门氏菌属的生物学特征： 1.形态染色特性：G-无芽孢杆菌。大小通常为 0.7～1.5μm × 2.0～5.0μm，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。需氧或兼性厌氧菌，生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃，适宜pH为6.8～7.8，对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛，胆盐可促进其生长。 2.培养特性：需氧或兼性厌氧菌；生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃；适宜pH为6.8～7.8；对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛；胆盐可促进其生长。 §普通琼脂：圆形、光滑、无色半透明、边缘整齐或不太整齐的中等大小(2 ～ 4mm)菌落。鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒、甲型副伤寒沙门氏菌等只能长成细小菌落。§麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂(EMB)：菌落无色半透明
解偶联蛋白2与2型糖尿病
?综述与讲座?解偶联蛋白2与2型糖尿病 杨璐 2型糖尿病发病的中心环节之一是胰腺β细胞功能衰竭,其表现为胰岛素分泌功能进行性降低。最近,一种参与下调胰岛素分泌的线粒体上的蛋白质———解偶联蛋白(un2 coupling protein,Ucp)引起普遍关注。其中Ucp2在胰岛素分泌过程中究竟起什么作用,它与2型糖尿病的关系又如何呢?现就线粒体内膜上的Ucp2与2型糖尿病的发病及相关研究进展作一综述。 一、Ucp2的结构和功能 最先,Ucp1的发现是在棕色脂肪,其作用是产热,并能减少A TP的产生,与能量供给作用以及与哺乳动物的体重调节有关。但是成人棕色脂肪含量太少,Ucp1似乎不能起到调节体重的作用,因此相关的研究减少了许多。直到1997年,Ucp2和Ucp3的发现使解偶联蛋白再次成为焦点。研究[1]发现了Ucp2基因,其定位于人类染色体11q13,全长8.7kb,分子质量为33098u,编码308个氨基酸,由8个外显子和7个内含子组成。Ucp2和Ucp3定位的染色体11q13被认为是与人类肥胖相关的候选基因。在植物和啮齿类动物体内都发现Ucp,在啮齿类动物至少已有5种(Ucp1～Ucp5)并被克隆,亚细胞定位均在线粒体内膜,各成员间序列同源性较高,组织分布有一定特异性。Ucp2是该家族中分布最广的成员,在体内分布广泛,脂肪、胎盘、骨骼肌、心脏、脾脏、肾脏、淋巴结以及中枢神经系统都有存在,其中在胰腺中的分布是Ucp2特异表达。 二、Ucp2在β细胞的基本功能 1.Ucp2是胰岛素分泌的负性调节因子:线粒体氧化磷酸化是葡萄糖代谢胰岛β细胞分泌过程的一个重要环节。Ucp2通过使细胞线粒体的氧化磷酸化过程解偶联,降低A TP产生,A TP/ADP比值下降,来减少A TP敏感的钾离子通道的关闭,进而影响细胞除极。使电压依赖性的钙离子通道开放迟缓或幅度减低,钙离子内流抑制,含有胰岛素的颗粒细胞不能释放,胰岛素分泌减少[2]。机体为此所必须付出的代价是能量通过Ucp的作用以热能的形式被消耗,而不是以A TP形式被储存,Ucp2的这种质子传递作用能被细胞内的ADP抑制。 2.抑制活性氧簇(ROS),减少氧化损伤:在Ucp2含量丰富的巨噬细胞中发现,把Ucp2敲除则巨噬细胞内ROS含量增加,表明Ucp2能抑制ROS的生成[3]。活性氧是细胞氧化损伤的主要来源,损伤的后果是加重疾病和老化。ROS 在线粒体中的产生来源于呼吸链产物中一部分氧经单电子 作者单位:524000湛江,广东医学院附属医院内分泌科 还原为水的过程中经过呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ形成,包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。当线粒体内的抗氧化防御系统如谷胱甘肽、MnSOD、CoQ及维生素E不能有效清除超氧化物时,ROS积聚会引发膜磷脂过氧化,蛋白质DNA的损伤激发级联反应最终导致线粒体破坏和细胞凋亡。 三、影响Ucp2mRNA表达的因素 1.脂肪酸的影响:脂肪酸对非胰岛组织Ucp2的诱导作用已经得到证实[4],用250μm油脂酸培养12～16h能使肝细胞内Ucp2的表达增加8倍以上。高脂饮食喂养2d就能明显上调A/J大鼠棕色脂肪组织中Ucp2mRNA的表达。Vettor等[5]发现用脂肪乳剂持续24h灌注能明显增加大鼠心脏和骨骼肌中Ucp2的表达,同时胰岛素调节的葡萄糖转运被抑制。同样游离脂肪酸对胰腺组织中Ucp2上调的影响也被许多实验证实。Tokuyuki等[6]通过将脂肪形成的关键转录因子即固醇调节元件结合蛋白(Sreb-1c)的腺病毒插入胰岛细胞,使细胞内脂肪酸合成大大增加,甘油三酯含量随之增加,Ucp2表达增加。另一项研究是应用高脂高糖和普通饲料喂养GK大鼠,观察其对β细胞胰岛素分泌功能的不同影响发现,高脂高糖能增加胰岛细胞内甘油三酯含量并且影响GK大鼠的胰岛素分泌,而且Ucp2蛋白表达水平增加,这些作用通过胰岛素治疗得到改善,表明Ucp2是β细胞胰岛素分泌的重要负性调节因子[7]。Joseph等[8]通过对Ucp2基因敲除小鼠和野生性小鼠胰岛细胞分别在体外用软脂酸培养48h后观察并比较细胞内甘油三酯含量和软脂酸代谢速率发现,Ucp2基因敲除鼠的β细胞游离脂肪酸的代谢速率提高,避免了甘油三酯细胞内堆积,从而避免脂毒性对β细胞损伤,这可能就是Ucp2表达过度损伤胰岛细胞功能的机制之一。 2.高血糖:高血糖对Ucp2mRNA表达的影响研究结果不尽相同,但多数研究[9-10]表明,高血糖能上调胰岛细胞线粒体的Ucp2表达,而且ROS的产生增加,进而抑制胰岛素的分泌,在协同高脂的环境下,ROS生成的增多有诱导Ucp2的表达增多,表明Ucp2活性增加对胰岛素分泌产生不利作用。同样在Ucp2基因敲除小鼠中发现其β细胞数量增加但在高脂高糖环境中仍能维持一定的胰岛素分泌功能。 3.其他因素:脂联素能减少A Y/a肥胖小鼠的内脏脂肪,可能与上调解偶联蛋白在棕色脂肪、白色脂肪以及骨骼肌中的表达有关[11]。瘦素通过提高白色脂肪中Ucp2的表达来加强或激活脂肪酸类代谢和利用[12]。甲状腺素能增加心脏、骨骼肌以及脂肪组织中Ucp2的mRNA表达。选择性β-3肾上腺素能激动剂能降低肥胖KK小鼠体重,可能是通