工业微生物育种思考题

工业微生物育种思考题

1.工业菌种的微生物应具有什么基本特征?

?非致病性;

?适合大规模培养工艺要求;

?利于规模化产品加工工艺;

?具有相对稳定的遗传性能和生产性状;

?形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。

2.育种思路原则是什么?

?解除或绕过限速酶

?提高前体浓度

?调节代谢途径,减少副产物及有毒代谢产物

?抑制或消除分解酶

?提高产物分泌能力

?消除产物抑制和提高底物耐受性

3.概述工业微生物育种方法。

一、传统育种方法

(一)以基因突变为理论基础的育种方法:

(1)诱变育种:是用人工诱变方法诱发微生物基因突变,通过随机筛选,从多种多样的突变体中筛选出产量高、性能优良的突变体,并找出突变体的最佳培养基和培养条件,使突变体在最适环境条件下大量合成目的产物。诱变、筛选和改变环境因素是诱变育种的3个重要环节。

(2)推理育种:是根据微生物代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制,选择巧妙的技术路线,通过人工诱发突变的技术获得改变微生物正常代谢调节的突变株,从而人为地使目的产物选择性地大量合成和积累。特点:打破了微生物代谢调节机制这一限制目的产物大量积累的天然屏障;优点:定向、工作量适中、效率高。

(二)以基因重组为理论基础的育种方法:

杂交育种:通过微生物杂交将不同菌株的遗传物质进行转移、交换、重组,使不同菌株的优良特性集中于一个重组体中。可以扩大变异范围、改变产品的产量和质量,甚至创造出新产品。包括常规杂交育种,原生质体融合,转导育种,转化育种等。

二、微生物分子育种技术

(一)重组DNA技术:也称基因克隆,是将一个含目的基因的DNA片段经体外操作与载体连接,并转入到受体细胞,使之在受体细胞内扩增、表达的操作过程。

操作过程通常包括以下步骤:①含目的基因的DNA片段的分离与制备;②载体的构建;③含目的基因的DNA片段与载体相连接;④将重组分子送入受体细胞,并在其中复制、扩增;⑤筛选带有重组DNA分子的转化细胞;⑥鉴定外源基因的表达产物。

重组DNA技术实施的4个必要条件:工具酶,基因,载体和受体细胞。

(二)定向进化:是指在试管中进行的“分子进化”,即在实验室人工控制的条件下模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。其对象可以是蛋白质或多肽,也可以是核酸和其他大分子,甚至是一些生物体中的小分子。通过人工合成或借助于重组DNA技术,人为地制造大量的变异体,然后按照特定的需要和目的,给予选择压力;或通过高通量筛选技术,将满足特定目的的分子筛选出来。其过程包括构建文库和筛选两部分。

(三)基因组重排:该技术可看成是一种细胞水平的体内定向进化技术,可用来改造细菌的基因组,实现表型的改良。经典杂交技术在每一代只有两个亲本进行重组,而重排技术则具有多亲本杂交的优势,对细菌群体进行重复的基因组重排可以有效构建新菌株的组合文库。

(四)代谢工程:利用DNA重组技术修饰细胞中特定生物化学反应(代谢途径)或引入新的生物化学反应,以提高特定代谢物的产量或改善细胞的其他性能的学科。

应用领域主要有:①提高细胞已有的化学物质的产量;②产生宿主细胞本身不能合成的新物质;③扩展细胞的底物使用范围;④形成降解毒性物质的新催化活性;⑤修饰细胞的其他生物学特性。采取的策略主要有:①在现存途径中提高目标产物的代谢流;②在现存途径中改变其物质流的性质;③利用已有途径构建新的代谢旁路。

4.你认为与工业微生物育种有关的最重要发现或发明有那些?为什么?

(1)1684年,列文虎克发现细菌:只有发现了微生物的存在,才能有后来的一系列研究和发现,为其提供进一步研究的前提和基础条件

(2)1881年,科赫研究纯培养细菌的方法:纯培养方法的建立,使需要的目的菌株能从混杂的微生物中分离出来,为对其进行专一的研究提供了方便,并且为纯种发酵提供了理论依据。以纯培养的方式分离出能制造有用物质的细菌和真菌,才开始有可能选出适用于特定需要的菌株,这是对微生物控制及改良的起步。

(3)1929年,弗莱明发现青霉素:青霉素的发现及其大容量的市场需求促进了相应发酵行业多方面的发展,也促使人们对发酵机理进行更多的研究,并不断选育更优良的生产菌株,促使工业育种的发展

(4)1940年,发现红色脉孢菌的突变,及1943年细菌的突变:突变的发现,促进了以后对微生物突变机制的研究,为遗传物质的发现提供了起点,也为诱变育种提供了事实材料和理论基础

(5)1944年,证明DNA是遗传物质:发现DNA是遗传物质,是遗传学里的一项重大突破,为后来的诱变育种、基因重组育种、基因工程等准备了理论基础

(6)1953年,沃森和克里克发现了基因的结构:基因结构的发现,不但使人们清楚了基因的结构,促进了遗传学的发展,也为在分子水平上改造微生物的遗传物质以获得具有优良生产性能的菌株提供了条件,试可行的基因改造成为可能

(7)1977年DNA序列分析,及1988年PCR反应:DNA序列分析和PCR反应,为分子水平上进行研究和育种工作提供了方便有效的实用方法和手段

(8)1995年细菌基因组的完整序列,及1999年百余种微生物基因组序列的测定:为我们进行微生物遗传物质和机理的研究提供了丰富的材料和数据,为重组和基因工程育种提供了更多知识背景和研究素材,促进新的育种方法的开发

5.名词解释:基因和基因组,基因型和表现型

基因:是含特定遗传信息的核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位,在染色体上呈线状排列,也称为遗传因子,是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。

基因组,Genome,一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列,包括全套基因和间隔序列。因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。

基因型:基因型是指生物的遗传型,是生物体从它的亲本获得全部基因的总和,即它的全套DNA。一个微生物的基因型由它的遗传信息组成,它编码微生物的所有特性,基因型代表潜在的特性,但并不是特性本身。

表现型:是与基因型相对应的概念,表现型是一个生物体的实际外表特征如大小、重量、颜色等。表现型主要受生物的基因型和环境影响。表现型是基因型的表现。从某种意义上说,微生物的表现型是它蛋白质的总和。

6.简述如何采集自然界微生物样品

采样--何处采样

要根据筛选的目的,微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等,进行综合地、具体地分析来决定。

由于土壤是微生物的总来源和大本营,尤其细菌和放线菌在土壤中存在得更多。就是水和空气中的微生物

也是从土壤中散发出去的。所以,如果我们不知道某种产品的微生物属类或某些特征时,一般都可以土壤为样品进行分离。

一般有机质较多的土壤,微生物数量也多。在田园土和耕作过的土中,以细菌和放线菌为主;在有很多动植物残体的土壤中,在沼泽土中,酵母和霉菌就较多。

土壤的植被情况对微生物的类型有着一定关系。如豆科植物下的土,根瘤菌较多;果树下的土,酵母菌较多。但是,由于这方面的研究进行得不多,很难说有一定的规律,但在采样时加以注意,对我们今后的工作会有帮助。

●采样--什么季节

春秋季温度、湿度对微生物的生长繁殖最合适,因此,土壤中微生物数量最多,所以春秋两季采样是合适的。

在采样时,还应注意水分的问题。土壤中水分过多,往往造成缺氧状态,因此,即使具有酵母、霉菌需要的温度、湿度,但也不利于其生长。放线菌也在水分较少的情况下繁殖得好。

一般应避免雨季采土,而以秋季采土比较理想。除此以外,土壤的酸碱度也应注意,细菌和放线菌在中性或微碱性土壤中较多,而酵母菌和霉菌则在偏酸性土壤中居多。

●采样--方法

采土的深度不同,其通风、养分、水分、光照等情况就不同,表层土由于日光直接照射,水分也较少,所以不利微生物生长,数量也少,一般离表层5-15厘米深处的土含微生物最多。

采土方法多在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15厘米处的土几十克,盛入预先消毒过的牛皮纸中(塑料袋最好),扎好,记录采样时间、地点、环境情况等,以备查考。

采样后的环境与天然条件有着不同程度的差异,微生物逐渐死亡而减少,种类也会起变化,所以应尽快分离。

7.简述野生型菌株的分离与筛选的步骤

基本步骤如下:

调查研究(包括查阅资料)—实验方案设计(确定采样的生态环境)—采样—增殖培养—平板分离—根据实际情况进行定性或半定量测定—初筛:一株一瓶—复筛:一株3-5瓶—第四次平板分离—第四次原种斜面—再复筛(初步工艺条件摸索)—较优菌株1-3株—保藏

(1)收集微生物资源(采样):用于分离微生物的样品通常为土样、植被和植物瓜果等。为了尽可能的涵盖各类微生物,要在广阔的、分散的地点多点采集样品,最好是不同的大陆地理带和进化带,这将会进一步增加微生物的种类。采土样时,应取离地面5-15cm处的土,并尽快分离。

(2)增殖培养:为了提高样品中目的菌的数量和比例,需要进行增殖培养,主要通过控制营养成分、培养基的酸碱度和培养温度,以及热处理和添加抑制剂等方法。

(3)纯种分离:为了将目的菌从混杂的微生物中分离出来,获得纯培养,需要进行纯种分离,主要有涂布平板分离法、倾注平板分离法、平板划线分离法和组织分离法。纯种分离时可以根据菌种特性采用一些平皿反应快速检出法,如透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法纸片培养显色法等。

(4)初筛:是指对具有潜在工业应用价值的微生物的检测和分离,理想的初筛方法应快速、灵敏、经济。初筛以量为主,对所分离的菌株进行略粗放的生产性能测试。初筛也用到根据菌种特性的一些平皿反应快速检出法,另外还有纸条法、浓度梯度平皿检测法等。

(5)复筛:是进一步挑出那些确实有工业应用价值的微生物,排除那些不具有潜力的微生物。复筛以质为主,对经初筛所获得的少量生产潜力较大的菌株进行比较精确的生产性能测试,并考察产量的稳定性。复筛可反复进行多次,直至选出最优的1-3株。

采样

↓(以可溶性淀粉为唯一碳源)

增殖培养

↓(以生淀粉为唯一碳源)

平板分离(初筛)

原种斜面

摇瓶筛选

复筛

菌株获得

8.简述选择性培养基在育种中的应用及富集培养在育种中作用

①选择性培养基:是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来,但这种富集和选择性是相对的,在这种培养基上生长的微生物并不是一个纯种。

作用:利用这类培养基可以从杂居多种微生物的样品中较容易的分离出目的被标记有特殊生理性能的微生物,若能将培养基的营养成分与培养的环境条件(如通气、温度、渗透压等)结合起来,分离效果更佳。

②富集培养基:是为分离某类微生物而加入助长该类微生物的营养物质或加入抑制其他微生物生长的抑菌剂的培养基。

作用:可以通过富集将目的微生物的数量增大,以便进一步进行分离。主要是根据不同种类微生物对碳氮源、PH、温度、需氧等生理因素的要求不同进行控制,以达到分离纯化的目的。富集培养对于那些样品中含有的微生物数量较少的样品是必须的,但如果按照通常分离方法即能得到足够数量的微生物,则不必进行富集培养,可以直接进行分离纯化。

9.诱变菌悬液的制备要考虑哪些因素?为什么要这样制备诱变菌悬液?

①选择合适的介质。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲液制备,特别是用化学因素处理的,要用缓冲液,因很多化学诱变剂需要在一定的pH值环境中才能发挥作用,而且在处理过程中pH值也会变动。

②使细菌或孢子要处于良好的分散状态。使细菌分散均匀的方法是先用玻璃珠振荡分散,然后再用脱脂棉或过滤纸过滤。对于酵母等个体较大的细胞,可以换用两层擦镜纸过滤,经过如此处理,分散度可达90%以上,供诱变处理较为合适。

③调节适当的细胞或孢子浓度。一般处理真菌孢子或酵母细胞悬浮液的浓度大约为106-1010个/mL。放线菌或细菌密度大些,可在108个/mL左右。悬浮液的细胞数可用平板菌落计数法估计活菌数,也可用血球计数器或光密度法测定细胞总数,其中以活菌计数较为准确。

④细胞要求同步,并且处理的细胞的菌龄是在生理活性最旺盛的对数期。这时细胞遗传性状稳定,对诱变剂敏感,突变率高,重现性也好。

用单细胞菌悬液诱变处理的理由是:如果几个细胞在一起,诱变时受的剂量不均匀,几个细胞变异情况不一致,长出的菌落就有几种状态的细胞,每批、每代筛选结果将产生很大差异,给筛选造成很大麻烦,不能将真正的菌种筛选出来。

10.简述工业微生物物诱变育种程序是什么?

诱变育种的工作程序如下:出发菌株--分离纯化、筛选--斜面--同步培养--离心洗涤--玻璃珠振荡打散--过滤--单细胞或孢子悬浮液--诱变处理--后培养--平板分离--斜面--初筛--复筛--分离筛选--保藏及扩大试验

诱变菌种的基本步骤:出发菌株的选择,诱变菌株的培养,诱变菌悬液的制备,诱变处理,后培养,突变株的分离与筛选等。

①出发菌株的选择:出发菌株应对诱变剂的敏感性强,变异幅度大。用作出发菌株的菌常有以下几类。第一类是从自然界分离的野生型菌株。第二类是诱变育种中常采用的,对在生产中自发突变而经筛选得到的

菌株进行诱变。这类菌株类似野生型菌株,容易得到好的效果。第三类是对已经诱变过的菌株进行再诱变。作为出发菌株,必须具有合成目的产物的代谢途径。这在选育氨基酸和核苷酸类的生产菌时尤为重要。另外,出发菌最好是单倍体的单核细胞。

②诱变菌株的培养:若出发菌株是细胞或酵母菌等单细胞微生物,一般采用营养细胞进行诱变处理。其目的是将诱变细胞的生理状态调整到处于同步生长状态的旺盛的对数生长期,而细胞内又含有丰富的内源性碱基。

对于丝状菌,一般取其孢子进行处理,因为多数丝状菌的孢子是单核,经诱变处理后不易发生分离现象。

③诱变菌悬液的制备

④诱变处理:诱变处理包括三方面内容:诱变剂的选择,剂量的选择,诱变处理方式。诱变剂有化学诱变剂和物理诱变剂两种。化学诱变剂如甲基磺酸乙酯、亚硝基胍等。物理诱变剂如紫外线,离子束,电离辐射等。目前处理剂量已从以前采用的致死率90%-99.9%的剂量降低到致死率为70%-80%,甚至更低的剂量,特别是对于高产菌株更偏低。对于多核细胞或孢子来说,则宜采用较高的诱变剂量。诱变处理方式有单一诱变处理、复合处理、不同诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等。

⑤后培养:诱变处理后,立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养,使突变基因稳定、纯合并表达。后培养所用的培养基的营养一定要丰富,必须含有足量的氨基酸和嘌呤嘧啶碱基。

⑥突变株的分离与筛选:筛选工作分为初筛和复筛。初筛在初筛阶段,要在工作条件固定的情况下,尽快地把较多的菌株筛选完。复筛时为了更有效地获得生产用菌株,还可参照生产的工艺条件来就进行试验。

11.如何选用诱变剂和诱变方法?

(1)诱变剂的选择:

①根据诱变剂作用的特异性来选择诱变剂

选择诱变剂要注意,诱变剂主要是对DNA分子上的某些位点发生作用,如紫外线的作用主要是形成嘧啶二聚体;亚硝酸主要作用于碱基上,脱去氨基变成酮基;碱基类似物主要取代DNA分子中的碱基;烷化剂亚硝基胍对诱发营养缺陷型效果较好;移码诱变剂诱发质粒脱落效果较好。

②根据菌种的特性和遗传稳定性来选择诱变剂对遗传稳定的菌种,可以采用尚未使用过的、诱变谱宽、诱变率高的强诱变剂;对遗传性不稳定的菌种,可以先进行自然选育,然后采用缓和的诱变剂进行诱变处理。对经过长期诱变后的高产菌株,以及遗传性不太稳定的菌株,宜采用较缓和的诱变剂和低剂量处理。选择诱变剂和诱变剂量,还要考虑选育的目的。筛选具有特殊特性的菌种或要较大幅度提高产量,宜采用强诱变剂和高剂量处理。对诱变史短的野生型低产菌株,开始时宜采用强诱变剂、高剂量处理,然后逐步使用较温和诱变剂或低剂量进行处理。

③参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂诱变之前要考察出发君主的诱变系谱,详细分析、总结规律。要选择一种最佳的诱变剂,同时要避免长期用同一种诱变剂。

(2)诱变方法的选择:

诱变剂的处理方式有单因子处理和复合因子处理两种方式。单因子处理指采用单一诱变剂处理出发菌株;而复合因子处理指两种以上的诱变剂诱发菌体突变。复合因子处理又可分为如下几种方式:两个以上因子同时处理;不同诱变剂交替处理;同一诱变剂连续重复使用;紫外线光复活交替处理。

复合因子处理时需要考虑两个问题,即诱变剂处理时间与诱变效应的关系以及诱变剂处理先后和协同效应问题。一般来说,低浓度长时间处理较高剂量短时间处理效果好;先用弱诱变因子后用强诱变因子往往是比较有效的。

另外,诱变剂的处理方式也可分为直接处理方法和生长过程处理方法。直接处理方法是指先对出发菌株进行诱变处理,然后涂平板分离突变株。生长过程处理方法适用于某些诱变率强而杀菌率低的诱变剂,或只对分裂DNA起作用的诱变剂。生长过程处理方法通常采用以下几种做法:一是将诱变剂假如培养基中涂平板;二是现将培养基制成平板,再将诱变剂和菌体加入平板;三是摇瓶振荡培养处理,即在摇瓶培养基中加入诱变剂,经摇瓶培养后涂平板。

12.举例特殊性能变异株的初筛方案设计。

(1)定向筛选组氨酸营养缺陷型突变菌株

菌种:北京棒杆菌;培养基:完全培养基(C.M.)、基本培养基(M.M.)、种子培养基(S.M.)、无氮基本培养基、二倍氮源高渗培养基、补充培养基(M.M.+His)

方法:青霉素法定向筛选His- 菌株

①NTG诱变:将对数生长前期的种子液离心、洗涤3 次,打散至分散度高于90%,用pH6.98的磷酸缓冲液悬浮至菌浓约108 ~109 /ml,转入已配制好的NTG溶液中,至NTG浓度为0.25mg/ml、菌浓为10 8/ml,28~30 ℃水浴锅中诱变30min(致死曲线已作) ,离心、洗涤3 次,悬浮菌体,待用NTG有剧毒,操作时注意防护,实验结束后要妥善处理染毒器物,保障他人安全。②中间培养:将以上所得菌液以5%接种量,接入MM+His 100 ug/ml 培养基,28 ℃下于220rpm培养6~8h,使细胞分裂几代,以排除表型延迟对实验结果的干扰,使得营养缺陷突变型表型充分表现出来。③饥饿培养:将以上菌液离心、洗涤 2 次后转接(接种量10%)至无氮基本培养基中培养至菌浓基本不再增加(根据O.D.600nm 判断),以消耗菌体残留的氮源尤其是氨基酸类氮源④青霉素处理前的培养及青霉素处理:向以上培养液中补加等体积的二倍氮源基本培养基,该培养基中含20%葡萄糖、100 ug/ml 氨基酸混合液(除组氨酸外)和0.02M 的Mg2SO4,28 ℃下于220rpm培养至菌浓加倍,使得原养型菌株生长至对数期;向其中加入青霉素溶液,至最终浓度为2000 单位/ml,置28 ℃水浴锅中静置保温处理,不时轻轻摇动,每30min 镜检一次,至约有50%~60%细胞变为原生质体时,离心、洗涤3 次,以停止青霉素的作用,使得原生质体破裂并洗去因原生质体涨破而释放出的营养物质;所得菌液稀释涂布MM+His平板,余者待用。⑤青霉素处理后的浓缩培养:以上菌液接MM+His(100 ug/ml ),培养6~8h,使得His- 细胞(以及残余原养型细胞)增殖,所得培养物离心、洗涤 2 次以除去残存组氨酸,稀释涂布MM+His平板。⑥His- 突变株的筛选:将MM+His 平板上长出的菌落一一对应,先后点种至MM 和MM+His (100 ug/ml )平板上,挑选前者上不生长而后者上生长的菌落,复检,鉴定His- 突变株。

13.代谢调控育种的基础与方法有那些?

代谢调控育种是通过遗传变异来改变微生物的正常代谢,使某种代谢产物形成和积累。在代谢调节控制育种中通过特定突变型的选育,人为地打破微生物细胞内代谢的自动调节,改变代谢流向,减少或切断支路代谢产物的形成以及提高细胞膜的通透性,使目的代谢产物大量累积。从细胞生理的角度上看选育获得的都是代谢异常的突变株。

微生物代谢调控育种的措施很多,主要包括以下几种:营养缺陷型突变,渗漏营养缺陷突变,营养缺陷回复突变,结构类似物抗性突变等的筛选。

14.筛选营养缺陷型菌株在操作上应注意那些?

①配制培养基及试剂时所用水必须为不含杂质或其他微量元素的纯净水,培养皿三角瓶等玻璃仪器需用水彻底清洗干净,防止带入杂质影响实验结果。②单核细胞在对数生长期,由于细胞分裂,在一个细胞中常常有两个核,若变异发生在一个核上时必须经过一代繁殖,才能把一个变异了的细胞和没有变异的细胞分开。如果是多核细胞,必须繁殖几代,才能把各种类型的核各个分离开来。这种现象对各种细胞都是存在的。为了减少以后筛选中再产生这种分离的混种现象,所以在缺陷型首次分离之前,先进行中间培养是必要的,中间培养用的培养基可以是完全培养基,也可以是补充培养基。③淘汰野生型时,浓缩前应在无氮培养基中培养一段时间耗尽细胞内所含的养料,避免在处理期间由于细胞自溶产生的营养物质促进缺陷型细胞的生长。

15.经典基因重组方法有那几种?遗传物质的转递有什么不同?

一、同源重组:发生在同源序列间的重组,又称基本重组,是最基本的DNA重组方式,通过链的断裂和再连接。在真核生物减数分裂中发生的同源重组是一种交互重组;在细菌的转化、接合和普遍性转导中所发生的同源重组是一种单向重组,即仅受体发生重组,供体并未发生改变。

(1)真核生物中,两个DNA分子同源序列间单链或双链片段的交换。

①对于有性生殖的霉菌和酵母:主要通过两个有性孢子之间的结合,在减数分裂过程中实现涉及整个染色体组的基因重组。

②对于不进行典型有性生殖的某些霉菌:可以在准性生殖过程中实现基因重组,通过两个体细胞之间的结合,在有丝分裂过程中实现涉及整个染色体组的基因重组。

(2)原核微生物的基因转移与重组:

①细菌的接合:主要存在于大肠杆菌等菌中,在供体、受体细菌细胞的暂时沟通中,受体菌接受供体菌的部分染色体形成局部合子,通过染色体的双交换而实现基因重组。结合需要一种松弛型的环状DNA质粒作为介质,结合需要细胞间的直接接触,并且接合细胞必须具备相对的接合型。

②转导:以噬菌体为媒介而将供体菌的个别或少数基因传递给受体菌,然后在受体菌中实现基因重组。转导分两步,首先噬菌体感染细菌,细菌裂解释放出携带有供体菌染色体基因的转导噬菌体,转导噬菌体感染受体菌,将所携带的供体染色体基因传递到受体菌内。包括普遍性转导和局限性转导,前者只能传递供体细菌染色体上原噬菌体整合位点附近少数基因的转导,后者则能传递供体细菌染色体上任何基因的转导。

③转化:受体菌直接吸收供体菌的游离DNA,并将其整合到自己烦人染色体基因组中发生基因重组而获得后者遗传性状的现象。

二、位点特异性重组:发生在特殊位点上,此位点含有短的同源序列,供重组蛋白识别。最典型的位点特异性重组是λ噬菌体在att位点整合到E.coli的基因组中。

三、转座重组:转座是重组的特殊类型,是由转座子产生的特殊行为。转座的机制依赖于DNA的交错切割和复制,不依赖于同源序列。

四、原生质体融合:指用物理、化学或生物学的方法,促进两亲株原生质体融合,经过染色体交换、重组而达到杂交目的,通过筛选获得集两亲株优良性状于一体的稳定融合子的过程。与常规的基因重组相比,基因重组的频率提高,重组的亲本范围扩大、融合子集中两亲本优良性状的机会增大。

16.简述原生质体融合育种的特点。

原生质体系列育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术,此外尚有原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。

●杂交频率较高

●受结合型或致育型的限制较小

●遗传物质传递更为完整

●存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性

有可能采用产量性状较高的菌株作为融合亲株

提高菌株产量的潜力较大

有助于建立工业微生物转化体系

17.原生质体融合育种步骤是什么?

●原生质体融合育种步骤

1.标记菌株的筛选和稳定性验证。

2.原生质体制备。

3.等量原生质体加聚乙二醇促进融合。

4.涂布于再生培养基,再生出菌落。

5.选择性培养基上划线生长,分离验证,挑取融合子进一步试验、保藏。

6.生产性能筛选。

18.原生质体的制备过程应注意那些?影响原生质体制备的因素

(1)注意①去除细胞壁是制备原生质体的关键,一般采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同,需分别采用不同的酶,如溶菌酶,纤维素酶,蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施,如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等,以提高细胞壁对酶解的敏感性。②菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低,对溶菌酶敏感。③原生质体对渗透压极其敏感,低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。对于不同微生物,原生质体

的高渗稳定液组成也是不同的。④制备好的原生质体最好立即使用,其活性随保持时间的延长而降低。在一般冷藏条件下可保存的时间很短,有些种类几小时就失活。可加入5%的二甲亚砜或甘油等保护剂。(2)影响原生质体制备的因素有:①菌体的前处理:为了使酶作用的效果好一些,可将菌做一些前处理。②菌体的培养时间:为了使细胞易于原生质化,一般选择增殖期的菌体。

③酶浓度:对于不同种属的微生物,不仅对酶的种类要求不同,就是对酶的浓度也有差异。④酶处理温度:处理对象不同,处理温度要求不一样。⑤破壁时的pH值⑥渗透压稳定剂:等渗透压在原生质体制备中,不仅起到保护原生质体免于胀裂,而且还有利于酶和底物的结合。

19.如何断定原生质体化的程度

原生质体对渗透压较细胞敏感得多,所以在蒸馏水这样的低渗溶液中可立即被破裂,在一般固体培养基中也无法形成菌落。

根据上述原理,就可以分别用血球计数比较低渗处理前后的被处理细胞加原生质体总数量,或在平板上的菌落数以求得原生质体得率。

对于丝状菌就困难了,因它们形成凝集块和菌丝状,无法直接观察计数。

这时可将进行酶解的菌体混合液分别等量悬浮于低渗和高渗的溶液中,然后将它们分别于高渗的再生培养基上涂布分离计数。

还可将高渗液中的菌体涂布于普通固体培养基和再生培养基上分别计数,这样也可大体求得原生质体得率。

20.简述抗生素浓缩法、夹层法、菌丝过滤浓缩法

抗生素浓缩法:只有野生型菌株才能在基本培养基上生长,一旦生长,即被加入培养基中的抗生素杀死,而营养缺陷型突变株由于在基本培养基中不能生长,因而,抗生素对这不起作用.最终通过终止法或稀释法消除抗生素的作用后,把有限的幸存的营养缺陷型突变株置于完全培养基中培养扩增,从而达到“浓缩”的目的. 夹层培养法sandwich culture多数用于营养缺陷型菌株的筛选。将含菌的一层培养基置于两层基本培养基中先进行培养,待出现菌落后,再加一层完全堵养基,后者出现的多为营养缺陷型新菌落

菌丝过滤法:适用于丝状生长的真菌或放线菌。其原理是:在基本培养基中,野生型的孢子能发芽成菌丝,而营养缺陷型的孢子则不能。因此,可将诱变剂处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后,再用擦镜纸等合适滤纸过滤。重复数次后,就可去除大部分野生型个体,达到了“浓缩”营养缺陷型的目的。

21.举例说明生长谱测定

生长谱法:在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况,称为生长谱法。

具体方法是:把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞配成106~108ml-1的菌悬液,随后取0.1ml菌悬液加入到未凝固的固态基本培养基中均匀混合,倒在培养皿上。待平板表面稍干燥后,按不同区域加入氨基酸、维生素、核酸等营养物。经培养后,如果发现在某一营养物周围有微生物的生长圈,说明它就是该营养物的营养缺陷型

22.如何进行抗性菌株的筛选?

有两种方法:一次性筛选法;阶梯性筛选法

(1)一次性筛选法:在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性突变株的方法。在筛选抗性突变株时,首先要测定药物对出发菌株的临界致死浓度。然后将经过后培养的细胞以较高的密度涂布或倾注到含有高于临界致死浓度药物的平板上,经培养后长出的菌落即为抗性突变株。抗噬菌体突变株常用一次性筛选法进行筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经过诱变处理和后培养后,大量接种含有噬菌体的培养液中,为了保证敏感菌不能生存,应使噬菌体数多于细胞数,此时可确保敏感菌株完全致死,只有突变株能在此环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离该培养液,即可获得纯的抗噬菌体突变株。(2)阶梯性筛选法:使用药物浓度梯度平板筛选在对敏感菌致死的药物浓度区生长的抗性突变株的方法。①梯度平板法:在培养皿中倾注7-10mL不含药物的琼脂培养基,将培养皿一侧搁置在木条上,使培养基形成的斜面刚好完全覆盖培养皿的底部。待培养基凝固后将培养皿放平,再倾注7-10mL含有一定浓度药物的

琼脂培养基,也使之刚好完全覆盖下层培养基,凝固并放置过夜。由于药物在上下层培养基之间的扩散作用,在平板内形成了随上层培养基由厚到薄的药物浓度梯度。将经过后培养的细胞涂布此平板,经培养后会逆药物的浓度梯度形成菌落的密度梯度。在低药物浓度区,细胞大量生长,形成厚厚的菌苔;高药物浓度区,菌落数逐渐减少。在菌落的稀少及几乎空白区域长出的少数菌落即为抗性突变株。②另一种方法是将固体药物直接加到涂有菌的平板表面,在培养过程中,药物逐渐溶解并向周围扩散,形成一个以固体药物为中心的药物浓度梯度。经培养后,能看到固体药物的周围有一个明显的抑菌圈,存在清晰或模糊的边缘,在抑菌圈区域长出的少数菌落即为抗药性菌株。③纸片扩散法:在无菌滤纸片上加入一定量的药物,干燥后放入涂布菌体的平板上,在抑菌圈内长出的菌为抗性菌,越接近药物抗性越强。

23.质粒的定义、特性和作用。

质粒是独立于染色体外,能进行自我复制的DNA分子,通常为环状DNA分子,多以超

螺旋的形式存在,主要存在各种微生物细胞中。

质粒的性质:

1.可以在细胞质中独立于染色体之外存在,也可以通过交换渗入染色体上,以附加体

的形式存在。

2.质粒是一种复制子,根据自我复制能力的不同,可把质粒复制的控制形式分为严禁

型和松弛型。

3可以通过转化,转导或接合作用由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中,而成为基因工程的载体。

4.对于细菌的生存并不是必要的

5.功能多样化。

作用:质粒通常是非必需的,但在特定条件下,质粒携带的基因对于细胞的生存和生长十分关键。某些质粒赋予微生物特殊的能力使其能够在十分复杂恶劣的环境中生存;有些质粒编码的蛋白可以增加细菌的致病性;R因子是充当基因传递介质的质粒,它携带的基因赋予宿主细胞对抗生素、重金属和细胞毒素的抗性;质粒是一种重要的基因工程工具,常用人工构建的质粒作为载体。

24.简述PCR扩增特定基因序列的原理。PCR注意事项有哪些?

(1)PCR的全称是聚合酶链式反应,是一种体外在DNA聚合酶催化下、通过两条人工合成的单链引物的引导而扩增模板DNA分子上两引物序列之间DNA片段的方法。PCR技术最基本的应用是从大量DNA 中将已知序列的目标基因的拷贝数极大提高,以便将其分离出来;还可以用于克隆新基因和基因的改造,并广泛应用于疾病检测、司法鉴定等许多领域。

(2)基本过程及原理:首先针对已知序列的目标基因,设计一对引物。每一条引物的序列分别与目标DNA 双链的一条链的3’端互补。①PCR反应一个循环的第一步是高温变性,在95℃下目标基因所在的DNA 片段双链分开成为单链。②第二步是复性,即体系温度降低,DNA双链又重新结合为双链,在反应体系中,引物的拷贝数远远超过模板的拷贝数,因此目标基因复性时,其两端首先和引物结合为双链,复性温度因引物和实验目的不同而变化,一般为40—70℃,以50—60℃最常见。③第三步是链的延伸,体系温度升到72℃,这是耐热DNA聚合酶作用的最适温度,从引物的3’端开始合成DNA链。一次PCR反应多为25-35个循环。

(3)注意事项:1:避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。

2:引物设计要正确,选择可靠的生物公司合成引物

3:DNA提取要成功。

4:引物和模板和体系所加的比例要合适,模板过量会抑制体系的反应。

5:跑胶时注意区分开EB污染区和清洁区。

6:配制的时候需要充分混匀,比如溶解引物,需要先混匀再分装。

还有DNA提取之后最好4度过夜之后再做PCR,这有利于DNA的充分溶解。

25.简述基因克隆的技术路线

基因克隆(分子克隆molecular cloning)----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞,扩增形成大量子代分子的过程。

基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。

目的基因载体

体外重组

重组子(杂合DNA)

转化

受体细胞

筛选阳性克隆

大量扩增,获得子代DNA子代DNA

基因克隆技术在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接,转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括:制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接,制成重组DNA分子→导入受体细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。1.目的基因的获得:目的基因是所要研究或应用的基因,即将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有:限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等,其中限制性内切酶法直接分离目的基因和多聚酶链式反应或反转录-多聚酶链式反应体外扩增目的DNA片段是目前最常用的方法。2.目的基因和载体的连接:获得目的基因以后必须将其放在一定的载体内才能够在宿主细胞内扩增或表达。目的基因与载体的连接及后续的转化过程习惯上称为克隆,可以是由于通过目的基因与载体的连接获得了一个新的重组分子,这一重组分子最后必然会产生一个新的菌体克隆。3.重组分子的扩增和鉴定:重组DNA分子导入受体细胞:目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后,需要被导入受体细胞中才能进行增殖或(和)表达。接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞(如大肠杆菌)和真核细胞(如酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞)。原核细胞可作为基因复制扩增的场所,也可作为基因表达的场所;而真核细胞一般只用作基因表达系统。重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增,扩增后的重组DNA分子是否正确,导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段,重组DNA分子能否表达插入的目的基因。一般可采用以下方法对重组DNA分子进行鉴定:抗生素筛选;X-gal筛选;酶切电泳鉴定;序列分析;其他方法也可以采用核酸分子杂交或菌落原位杂交鉴定重组DNA分子,或采用Western blot直接检测目的蛋白的表达情况,但这些方法都不是日常工作中常采用的。

另:①目的基因的获取:目的基因根据需要有DNA或mRNA 等形式。②目的基因的扩增:根据基因序列设计引物,利用PCR技术在生物体外扩增目的基因。③目的基因的酶切:利用适当的限制性内切酶酶切目的基因。④重组载体的构建:选择合适的载体,外源基因与经同样酶切的载体连接。⑤转化受体细胞及阳性转化子的筛选:利用重组载体的抗性设计实验来筛选阳性重组子

26.利用基因工程技术育种研究的主要步骤是什么?你认为最关键的步骤是什么?说

明理由

1.目的基因的获得

2.载体的选定

3.目的基因克隆入载体中构成重组载体

4.将重组载体引入宿主细胞内进行无性繁殖

5.鉴定带有目的基因的克隆株

6.目的基因的次克隆及表达

最关键的步骤:①筛选带有重组DNA分子的转化细胞,鉴定外源基因的表达产物。在

构建重组表达体系时,由于各种不可控制因素的干扰,真正获得目的基因并能有效表达

的重组子只是一小部分,而绝大部分仍是原来的受体细胞,或者是不含目的基因的克隆,

为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正所需的重组子,需要采用一系列筛选和鉴定

的方法②目的基因的获取也很重要:目的基因的获取是基因工程育种的核心问题,根据

对目的基因的了解程度可采用鸟枪克隆法、cDNA克隆法、PCR法以及化学合成法等。

每一种操作方法都有各自的特点,难易程度不同。这一步操作是整个基因工程育种的基

础,获得完整正确的目的基因不仅是后续操作能顺利进行的保证而且关系到整个实验的

成败。如果是获取一个未知基因序列,那么设计一种方法来获得目的基因的关键性就更

明显了。

27.在工业酶表达应用中,大肠杆菌pET系统常用的载体和宿主有哪些、该表达系统的

优缺点?pET 系统表达可能存在的问题及解决策略?

●pET 系列高表达载体

用于大肠杆菌高表达的启动子非常多,其中来源于噬菌体的启动子可能是表达水平最高的。

pET20b,这个载体采用了T7噬菌体的外壳蛋白f10的启动子,习惯常称为T7启动子。

pET-21(+) pET-24(+)

具有T7 RNA聚合酶的宿主:

BL21(DE3),JM109(DE3),Rosetta (DE3),Rosetta-gami (DE3),

Rosetta-gami plysS (DE3)

其中DE3代表这些宿主菌是噬菌体DE3的溶源菌。

pET系统的优点:1.优化靶蛋白表达,pET系统为各种启动子和不同蛋白表达产量提供了重要的选择。2.严格控制基础表达水平。

不表达:稀有密码子,诱导剂浓度

表达为包涵体:降低温度、降低诱导剂浓度、使用trx标签和具有辅助二硫键折叠功能的宿

目的蛋白对宿主存在毒性:使用严谨调控质粒和宿主,降低目的蛋白合成熟练

在多方尝试仍无法高效得到有活性的目的蛋白,可以考虑更换表达系统,作为原核的大肠杆

菌毕竟存在很多缺陷

28.毕赤酵母表达系统的优缺点,其常用表达载体的结构是什么?

●毕赤酵母表达系统的优点

1. 具有强有力的醇氧化酶基因(AOX1)启动子,可严格调控外源基因的表达;

2. 能高密度发酵培养,而且营养要求低,利于工业化放大生产;

3. 自身分泌的蛋白质非常少,使高分泌的外源蛋白质便于纯化;

4.外源基因通过整合型质粒进入毕赤酵母染色体基因组,结构稳定,不易丢失;

5.自身含有亚细胞器结构,可对表达的蛋白质进行翻译后的修饰如信号序列的加工、蛋白质的折叠、二硫键形成以及糖基化

6.基因表达的产物既可在胞内积聚,又可分泌到胞外;

7.外源蛋白质的表达量较高

毕赤酵母表达系统的缺点

不能实现全部的翻译后修饰功能

酵母的表达周期较长, 一般为4~7 天, 从而增加了被污染的可能性;

外源蛋白的过度糖基化;

利用有毒的甲醇作原料, 表达产物难通过有关卫生鉴定等

毕赤酵母与人及其它物种一样对所使用的氨基酸密码子具有不同的偏好性,这可能限制其蛋白质翻译速度

表达载体的结构一般包括:复制起点,用于载体的复制扩增;单克隆位点,用于插入外源DNA片段;AOX 启动子,用于控制目的基因的高效表达;选择性标记,如卡拉霉素抗性和组氨酸缺陷型,用于筛选重组子;前导肽序列,用于分泌胞外产物(表达胞外产物的载体有此序列)

29.表达载体与克隆载体的区别是什么?pPIC9K是什么载体?

(1)①克隆载体:能够插入外源片段的质粒(或噬菌体),其目的是在导入细胞后伴随细胞增殖产生更多拷贝,伴随克隆载体的拷贝使其携带的目的片段得到大量增殖。传统的克隆载体一般包括复制起始位点Ori,多克隆位点MCS,抗性标记如Ampr,有的还会带有用于蓝白斑检验的LacZ operator。现在最常用到的大肠杆菌克隆载体是T载体。

②表达载体:是为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的载体。

③表达载体与克隆载体的最大区别在于两者目的不同。克隆载体目的在于大量克隆目的基因并为随之而来的测序或酶切做好准备;而表达载体目的在于更好地表达目的蛋白,并为得到目的蛋白之后的纯化等步骤做好准备。由目的的差别使得两者的结构差别主要在于表达载体比目的载体多了转录启动子和终止子,并且在表达载体上往往还有一些辅助纯化,折叠或胞外分泌的特殊DNA如His-tag等。因此表达载体一般比克隆载体大一些,而表达蛋白所造成的后果是表达载体复制效率往往不如克隆载体。大肠杆菌常用的表达载体如Navogen公司的pET系列载体。

(2)pPIC9k是毕赤酵母表达载体。

30.酶基因是否表达如何确定?

对于某些特殊蛋白可以通过相偶联的一些显色反应或现象确定。通常最常用的方法可以通过表达后跑SDS-PAGE看与原始菌相比目的条带附近是否有表达条带形成;更可信的方法是通过Western Blot检测是否有杂交;当然也可以通过飞行时间质谱等一些更为昂贵的手段进一步确认。

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