SDS-PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理
SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？
①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质
与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS 单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer 中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。
SDS-PAGE缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？
一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。
积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？
在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7时很少解离，其有效泳动速率很低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电压以后，作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态（我不太明白这句话），使这些带电颗粒以相同的速度泳动，两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速率比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，形成一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓缩胶中Tris-HCl的浓度（为什么？），而与样品中蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH明显增加，导致甘氨酸大量解离。此时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加，超越蛋白分子，直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小，蛋白质分子的迁移速率降低，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和pH环境中泳动，并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。
SDS-page电泳小问答
Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？
A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD 到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？
A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL 缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris －甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两
者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q：样品如何处理？
A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在还原剂中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％
SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL 系统，具体作用后面介绍；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
Q：为什么带出现拖尾现象？
A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
Q：为什么带出现纹理现象？
A：主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
Q：什么是“鬼带”，如何处理？
A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被
解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
Q：为什么电泳的条带很粗？
A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；
Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。
Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
处理办法：按正确的操作方法操作。
SDSPAGE电泳常见问题分析
SDS PAGE 电泳常见问题分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统， TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；
SDS-PAGE电泳标准操作流程
SDS-PAG电泳标准操作规程（网上） 3. 程序: 端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2分离胶的配置 3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板 梳齿下缘约1cm）。 3.1 . 2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面 变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸 吸干残留的水液。 3.1.3浓缩胶的配置 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。 3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹 形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与 贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 pl的样品，依次加上20Q 5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。 对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。 3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10 p l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加 入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移 动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时, 完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间 约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5. 拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到 扫描仪上，拍照。 4. 注意事项 4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%交；50KD-30KD选用12%胶； 30KD-10KD选用15%交。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。 4.6 分离胶高度控制得当，确保 有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。 4.7 电泳染色液注意进行回收再利用， 一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过
冷冻干燥原理
冷冻干燥原理 冷冻干燥是指通过升华从冻结的生物产品中去掉水份或其他溶剂的过程。升华指的是溶剂，比如水，像干冰一样，不经过液态，从固态直接变为气态的过程。冷冻干燥得到的产物称作冻干物（lyophilizer），该过程称任冻干（lyophilization）。 为什么要选择冷冻干燥？ 传统的干燥会引起材料皱缩，破坏细胞，在冰冻干燥的过程中样品的结构不会被破坏，因为固体成份被在其位子上的坚冰支持着。在冰升华时，他会留下孔隙在干燥的剩余物质里。这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性。 在实验室中，冻干有很多不同的用途，他在许多生物化学与制药应用中是不可缺少的，它被用获得可长时期保存的生物材料，例如微生物培养、酶、血液与药品，除长期保存的稳定性以外，还保留了其固有的生物活性与结构。为此，冻干被用于准备用做结构研究（例如电镜研究）的组织样品，冷冻干燥也应用于化学分析中，它能得到干燥态的样品，或者浓缩样品以增加化析敏感度。冻干使样品成分稳定，也不需改变化学成分，是理想的分析辅助手段。 冷冻干燥的实现 冷冻干燥可以自然发生，在自然情况下，这一过程缓慢而且不可预测。通过冷冻干燥系统，人们改进，细分了很多步骤加速了这一过程。 冷冻干燥系统 一个基本的冷冻干燥系统包括： 一个干燥室或者多歧管 一个抽真空系统克服阻碍因素和加速气体流动 一个热源提供能量 一个低温冷凝器，用于使蒸气压差最大化并捕捉蒸汽使之冻结，避免水蒸汽污染真空泵 冷冻干燥过程包含三个步骤 预冻，为接下来的升化过程准备样品。 初级干燥，在此过程中冰升化而不融化。 次级干燥，在此过程中，键和于固体物质的残留水分被除去，从而留下干燥样品，这一步骤对保存样品的稳定性非常重要。 在壳式预冻中，冻干瓶中样品浸放在低温热传导液体里旋转，液体样品沿冻干瓶圆周内壁结冻，以达到更大的表面积。这层薄的结冻层能让水份子更加容易地穿过。一旦样品结冰，就可以与冷冻干燥系统连接了。
人乳与牛乳的区别
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人乳与牛乳的区别 从本来意义上讲，人乳是供给婴儿吃的，而牛奶是供给牛犊吃的，人和牛的需要不同，所以人乳和牛奶在成分上也有一定的差别。 1、蛋白质含量不同：人乳含蛋白质约l.2％左右，而且大部分是乳蛋白。这种蛋白质在婴儿胃内形成的乳凝块较小，容易被消化，因而营养价值高。牛奶含蛋白质是人乳的3.2倍。而且是以酪蛋白为主。这种蛋白质的凝乳块大，不容易被消化吸收，因而营养价值没有母乳高。如意引起婴儿消化不良，腹泻或干燥，也使肾脏的负担加重。 2、脂肪含量不同：母乳中所含的脂肪以不饱和脂肪酸为主，其脂肪球小，容易吸收利用。牛奶中的脂肪含量和母乳差不多，但含有人体必需的不饱和脂肪酸仅为母乳的三分之一，大部分是不适于人体消化吸收的饱和脂肪酸及挥发性脂肪酸，而且牛奶脂肪颗粒较大，不易被婴儿消化吸收。 3、含糖量不同：母乳中所含的糖主要是乳糖，其含量比牛奶高一倍。人乳中的乳糖完全溶解在乳液中，极易消化吸收，同时乳糖可抑制肠道中大肠杆菌的生长及促进钙的吸收。另外，母乳中还有一种糖是够策划能够婴儿的血型物质及促进脑神经发育的主要成分，而在牛奶中缺乏这种糖；牛奶中含糖低，所以在吃牛奶时需要加糖，加糖过多又会影响钙的吸收、互相矛盾。 4、母乳中含有婴儿必需的多种矿物质，如铁、铜、锌、钙、磷等。铁是造血的主要原料，铜是婴儿神经系统发育的所必需的物质，锌与婴儿
的智力发育有关。上述这些矿物质在牛奶中的含量都比较少。另外，母乳中钙、磷搭配比例合适，容易被吸收，故的婴儿不易患。牛奶中钙、磷的含量虽然比人乳高，但由于其比例使婴儿难以吸收，所以牛奶喂养的婴儿佝偻病发病率高。 5、母乳中各种的含量一般都比牛奶高。 6、母乳中含有足够的水分，故尺母乳的婴儿可不必再喂糖水。 7、人乳中含有婴儿所需要的各种抗体，吃后能增强婴儿的抵抗力，可起到预防疾病的作用；牛奶几乎没有婴儿所需要的抗体。 8、人乳中绝对没有细菌，吃起来放心；母乳中含有溶菌酶，具有抗菌、消炎、增强机体免疫力等作用。牛奶易被细菌污染，必须经过消毒才能饮用。 9、牛奶也有一个优点，即含无机盐较多，如钙、磷、铁的含量都很丰富，这有利于婴儿的。 总的来讲，母乳是天然的高级营养品，人工无法制造，所以世界上没有一种代乳品能和母乳相比。
SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理
SDS-PAGE电泳原理： 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯 酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓 冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结 果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时 常超过9.0)，使Gly 解 离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复 存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
人乳与牛乳的区别
人乳与牛乳的区别集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
人乳与牛乳的区别从本来意义上讲，人乳是供给婴儿吃的，而牛奶是供给牛犊吃的，人和牛的需要不同，所以人乳和牛奶在成分上也有一定的差别。 1、蛋白质含量不同：人乳含蛋白质约l.2％左右，而且大部分是乳蛋白。这种蛋白质在婴儿胃内形成的乳凝块较小，容易被消化，因而营养价值高。牛奶含蛋白质是人乳的3.2倍。而且是以酪蛋白为主。这种蛋白质的凝乳块大，不容易被消化吸收，因而营养价值没有母乳高。如意引起婴儿消化不良，腹泻或干燥，也使肾脏的负担加重。 2、脂肪含量不同：母乳中所含的脂肪以不饱和脂肪酸为主，其脂肪球小，容易吸收利用。牛奶中的脂肪含量和母乳差不多，但含有人体必需的不饱和脂肪酸仅为母乳的三分之一，大部分是不适于人体消化吸收的饱和脂肪酸及挥发性脂肪酸，而且牛奶脂肪颗粒较大，不易被婴儿消化吸收。 3、含糖量不同：母乳中所含的糖主要是乳糖，其含量比牛奶高一倍。人乳中的乳糖完全溶解在乳液中，极易消化吸收，同时乳糖可抑制肠道中大肠杆菌的生长及促进钙的吸收。另外，母乳中还有一种糖是够策划能够婴儿的血型物质及促进脑神经发育的主要成分，而在牛奶中缺乏这种糖；牛奶中含糖低，所以在吃牛奶时需要加糖，加糖过多又会影响钙的吸收、互相矛盾。 4、母乳中含有婴儿必需的多种矿物质，如铁、铜、锌、钙、磷等。铁是造血的主要原料，铜是婴儿神经系统发育的所必需的物质，锌与婴儿的智力发育有关。上述这些矿物质在牛奶中的含量都比较少。另外，母乳
中钙、磷搭配比例合适，容易被吸收，故的婴儿不易患。牛奶中钙、磷的含量虽然比人乳高，但由于其比例使婴儿难以吸收，所以牛奶喂养的婴儿佝偻病发病率高。 5、母乳中各种的含量一般都比牛奶高。 6、母乳中含有足够的水分，故尺母乳的婴儿可不必再喂糖水。 7、人乳中含有婴儿所需要的各种抗体，吃后能增强婴儿的抵抗力，可起到预防疾病的作用；牛奶几乎没有婴儿所需要的抗体。 8、人乳中绝对没有细菌，吃起来放心；母乳中含有溶菌酶，具有抗菌、消炎、增强机体免疫力等作用。牛奶易被细菌污染，必须经过消毒才能饮用。 9、牛奶也有一个优点，即含无机盐较多，如钙、磷、铁的含量都很丰富，这有利于婴儿的。 总的来讲，母乳是天然的高级营养品，人工无法制造，所以世界上没有一种代乳品能和母乳相比。
浅谈浓缩技术的研究
新疆农业大学 科学技术学院 本科生专业文献综述 题目: 浅谈浓缩技术的研究 姓名: 石莹莹 专业: 食品科学与工程 班级: 062班 学号: 065202617 指导教师: 冯作山职称: 教授 2009年12月10日 新疆农业大学科学技术学院制
浅谈食品浓缩技术的研究现状 作者：新疆农业大学科学技术学院食品科学与工程 062班石莹莹 065202617 指导老师：冯作山 摘要：本篇文章主要阐述了我国浓缩技术的研究现状，分别介绍了食品工业中几种液体浓缩技术，如蒸发浓缩、闪蒸浓缩、蒸馏浓缩、反渗透浓缩、超滤浓缩、透析（渗析）浓缩、电渗析浓缩、冷冻浓缩等，主要对其中的蒸发浓缩、膜浓缩、冷冻浓缩三大浓缩技术的原理、操作技术进行了阐述说明，并通过各浓缩技术方法之间的相互比较，总结其优点和缺点，根据其优缺点来确定各个方法的使用范围，方便食品加工中对浓缩技术的选择。 关键字：浓缩技术；优缺点；选择 Abstract: This text mainly expound the newly application of concentration technology, separately introduce several concentration technology, such as: evaporate concentration, momentary concentration, distill concentration, reverse osmosis, surpass filter, dialyze concentration, freeze concentration and so on. In this text expound the principle and operation of evaporate concentration, osmosis concentration and freeze concentration. According to the comparation of these concentration technology, concluding the advantages and disadvantages, make it convenience to make a choice of these concentration technology in food processing. Key word: concentration; advantage and disadvantage ; option 一、食品浓缩的目的 在食品加工中，一些液态原料或半成品，如果蔬汁液及牛奶等，一般都含有大量的水分（75%-90%），而有营养价值的物质如果糖、有机酸、维生素、盐类、果胶等只占5%-10%,这些物质对热敏感性都很强。在生产中为了便于储藏运输或作为其他工序的预处理，往往要进行浓缩处理。浓缩过程中既要提高其浓度，又要使食品溶液的色、香、味尽可能地保存下来。所以，浓缩是一个比较复杂的过程，是除去食品原料或半成品中部分溶剂（通常是水）的单元操作。 食品浓缩的目的：①作为干燥的预处理以降低产品的加工热耗。如制作乳粉时需使鲜乳由含水率88%降至3%，若用真空浓缩，每蒸发1Kg水分，需要消耗1.1Kg的加热蒸汽；而用喷雾干燥，每蒸发1Kg水分需要消耗3-4Kg的加热蒸汽，故先浓缩后干燥，可以大大节省热能。②提高产品质量。如鲜乳经浓缩再喷雾干燥，所得乳粉颗粒大，密度大，复原性、冲调性和分散性均有改善。③提高制品浓度，增加制品的储藏性。用浓缩方法提高制品的糖度或盐分可降低制品的水分活度，使制品达到微生物学上安全的程度，延长制品的有效储藏期，如将含盐的肉类萃取液浓缩到不致产生细菌性的腐败。④减少产品的体积和质量，便于运输。如在果品产地，就地制成浓缩果汁，然后运往销售地，稀释加工后出售。 ⑤浓缩用作某些结晶操作的预处理。⑥提取果汁中的芳香物质。 二、食品浓缩的方法 在食品工业中有好几种液体浓缩技术，最普通的是蒸发和膜浓缩；冷冻浓缩是另一种浓缩技术，尽管大规模的应用受到限制，但在最近几十年中已经得到了很好的发展。表1列举了液体浓缩的各种技术。
羊奶牛奶和人奶的比较
蛋白质组成：羊奶蛋白质较牛奶稍高，其中酪蛋白占75％，a－S1酪蛋白占总蛋白1－3％，B－乳球蛋白的含量比牛奶小，因此羊奶可解除大部分牛奶过敏症。脂肪：羊奶的脂肪球细胞小，只有牛奶的三分之一，不饱和脂肪酸较牛奶高一倍，更容易吸收。 上皮生长因子：羊奶含有和人乳一样的活性因子－－上皮生长因子（EGF），有益上皮细胞的生长和修称复，增强人体的抵抗力。牛奶中无上皮生长因子。 矿物质：羊奶中矿物质较多，总含量为0.85％，钙、磷含量比牛奶多20％，钙铁之间没有拮抗作用，钙铁吸收率高。 酸碱度：羊奶偏碱性，牛奶偏酸性。 乳类及其制品是人类优质的食品之一。单从动物奶类的角度来看，牛奶与羊奶没有原则上的区别，都含有较优质的蛋白质、脂肪，而且矿物质含量，尤其是钙含量都很丰富。由于牛奶的产量高，所以经常食用的是牛奶，少见羊奶。 羊奶蛋白质比牛奶低，约为一半，脂肪和碳水化合物稍高。但羊奶优势的地方不是简单同牛奶比营养素含量，而是在一些细微的地方表现出来。首先羊奶的蛋白结构与牛奶的不同，羊奶中酪蛋白含量比牛奶为低，乳清蛋白比例高，更接近于人奶，蛋白微粒小，更容易被人体吸收；而且羊奶中异体蛋白含量也较少，因此，对牛奶过敏和体质较弱的人群可以试选用羊奶。其次羊奶中脂肪粒比牛奶细小，更易吸收。 综合起来看，牛奶、羊奶各有优势，不能简单地做出哪个好哪个不好的结论。在实际应用中，牛奶的选择较多，但有消化功能差的人，或者对牛奶不耐受时，可选用羊奶。 羊奶被国际营养学界公认为“可与母乳相媲美”的天然营养品，被称为“奶中之王”。羊奶和人奶的蛋白质形态相似，脂肪球大小与人奶相同，仅为牛奶的三分之一，更接近于人乳，消化时间比牛奶短100分钟，吸收时间比牛奶短14个小时且吸收率高。另外a-乳清蛋白是母乳中的主导蛋白，而牛奶中的这种蛋白少于羊奶。对婴幼儿来说，羊奶呈弱碱性，不含过敏源，用于婴儿可避免用牛奶喂养发生腹泻、便秘和湿疹并使宝宝不上火。另外由于牛奶的分子比羊奶大，宝宝喝牛奶比喝羊奶容易上火和便秘。羊奶有200多种营养物质和生物活性物质，在重要的几十种营养物质里面蛋白质、维生素A、E、B、C、钙、磷、铁等
冻干工艺原理
冻干工艺原理 第一节冷冻干燥的原理 一、冻干的概念、目的及应用 冷冻干燥就是把含有大量水分的物质，预先进行降温冻结成固体。然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，而物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得干燥制品不失原有的固体骨架结构，保持物料原有的形态,且制品复水性极好。 利用冷冻干燥目的是为了贮存潮湿的物质，通常是含有微生物组织的水溶液，或不含微生物组织的水溶液。产品在冻结之后置于一个低水气压下，这时包含冰的升华，直接由固态在不发生熔化的情况下变成汽态。与其他干燥方式相比避免了化学、物理和酶的变化，从而确保了制品物性在保存时不易改变。实际需要的低水汽压是靠真空的状况下达到的。 真空冷冻干燥技术主要应用于： (1)热稳定性差的生物制品，生化类制品，血液制品，基因工程类制品等药物冻干； (2)为保持生物组织结构和活性，外科手术用的皮层、骨骼、角膜、心瓣膜等生物组 织的处理； (3)以保持食物色、香、味和营养成分以及能迅速复水的咖啡、调料、肉类、海产品、 果蔬的冻干； (4)在微胶囊制备、药品控释材料等方面的应用。以保持生鲜物质不变性的人参、蜂 皇浆、龟鳖等保健品及中草药制剂的加工； (5)超微细粉末功能材料如：光导纤维、超导材料、微波介质材料、磁粉以及能加速 反应工程的催化剂的处理等。 二、冷冻干燥的原理及优点 1、水的状态平衡图 物质有固、液、汽三态，物质的状态与其温度和压力有关。图1-1示出水（H2O）的状态平衡图。图中OA、OB、OC三条曲线分别表示冰和水、水和水蒸汽、冰和水蒸汽两相共存时其压力和温度之间的关系。分别称为溶化线、沸腾线和升华线。此三条曲线将图面分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区域，分别称为固相区、液相区和气相区。箭头1、2、3分别表示冰溶化成水，水汽化成水蒸汽和冰升华成水蒸汽的过程。曲线OB的顶端有一点K，其温度为374℃，称为临界点。若水蒸汽的温度高于其临界温度374℃时，无论怎样加大压力，水蒸汽也不能变成水。三曲线的交点O，为固、液、汽三相其存的状态，称为三相点，其温度为0.01℃，压力为610Pa。在三相点以下，不存在液相。 若将冰面的压力保持低于610Pa，且给冰加热，冰就会不经液相直接变成汽相，这一过程称为升华。 真空冷冻干燥是先将湿料冻结到共晶点温度以下,使水分变成固态的冰,然后在较高的真空度下,使冰直接升华为水蒸气,再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸气冷凝,从而获得干燥制品的技术。干燥过程是水的物态变化和移动的过程。这种变化和移动发生在低温低压下。因此，真空冷冻干燥的基本原理就是低温低压下传质传热的机理。 2、冷冻干燥的优点 冷冻干燥与常规的晒干、烘干、煮干、喷雾干燥及真空干燥相比，有许多突出的
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。 在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。 注意问题 1.样品处理 上样缓冲液的作用：形成SDS-蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。 SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。 2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 （1）浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。 3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径 待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 4. .“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 5. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 6. 带出现拖尾现象 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 7. 带出现纹理现象 主要是样品不溶性颗粒引起的。
食品的浓缩技术之冷冻浓缩
食品的浓缩技术之冷冻浓缩 (一)原理和缺点 冷冻浓缩是利用冰与水溶液之间固液相平衡原理的一种浓缩方法，即将溶液的部分溶剂以冰的形式析出，并将其从液相中分离出去从而使料液浓缩。采用冷冻浓缩方法，对溶液的浓度有一定的要求。当溶液中溶质浓度超过低共熔点浓度时，冷冻的结果表现为溶质转化成晶体析出，表现为结晶。这样不仅不会提高溶液中溶质的浓度，反而会降低溶质的浓度。而当溶液中溶质浓度低于低共熔点时，其冷却结果则表现为溶剂(水分)成晶体(冰晶)析出。随着溶剂成晶体析出的同时，余下溶液中的溶质浓度也就提高了，此即冷冻浓缩的基本原理。由此可见，冷冻浓缩的操作包括两个步骤，首先是部分水分从水溶液中结晶析出，而后将冰晶与浓缩液加以分离。结晶和分离两步操作可在同一设备中或在不同设备中进行。 冷冻浓缩方法比较适用于对热敏性物料、生物制药、中草药及对色、香、味均有较高要求的饮料等的浓缩，因为冷冻浓缩过程中，溶液中水分的排除是靠溶液到冰晶的相际传递，避免了加热蒸发，从而减少了挥发性物质和易变性物质的损失。为了更好地使操作中形成的冰晶不混有溶质，分离时又不致使冰晶夹带溶质，防止造成过多的溶质损失，结晶操作时应尽量避免局部过冷，分离操作也要很好地加以控制。冷冻浓缩具有独特的优越性，对于含挥发性芳香物质的食品采用冷冻浓缩，其制品品质将优于蒸发浓缩和膜浓缩法。 冷冻浓缩也存在不可避免的缺点，主要包括： 1.冷冻浓缩方法受溶液浓度的限制，而且冰晶与浓缩液可能分离的程度也影响浓缩的效果。一般而言，溶液粘度愈高，分离就愈困难。 2.冷冻加工过程中，细菌和酶的活性得不到抑制，所以制品还必须再经热处理或加以冷冻保藏。 3.冷冻过程中会造成不可避免的溶质损失且成本高。 (二)冷冻浓缩中的结晶过程 冷冻浓缩中的结晶为溶剂的结晶。同常规的溶质结晶操作一样，被浓缩的溶液中的水分也是利用冷却除去结晶热的方法使其结晶析出。冷冻浓缩的结晶过程
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为%%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度，故多用于结晶，其它情况少见。 使用固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 第二节有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相
SDS-PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理
SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？ ①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质
与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS 单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer 中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。 SDS-PAGE缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？ 一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。 积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？
羊奶、牛奶与人奶的对照
羊奶、牛奶及人乳营养成份分析比较 从羊奶的实际成份来说 世界营养专家都知道：羊奶是世界公认更优于牛奶，而且最接近母乳的奶品！因为羊奶中含有一种与人乳相同的“上皮细胞生长因子”（国际营养学上简称EGF），而这是牛奶完全没有的成份。此－－EGF因子有神奇的修复鼻腔、气管粘膜作用，并能增强人体整体的抵抗力、免疫力，一些国家的医生为患有支气管炎、肺炎的病人开具羊奶作为辅助治疗，并倡导在感冒高发期多饮羊奶以预防感冒，以及其他流行性传染病之预防，成效卓著！而在营养成份的完全比较上，羊奶的优异性更是卓越凸显，下图为每100毫克中，羊奶、牛奶及人乳之营养实际成份分析表： 羊奶、牛奶及人乳营养成份，分析比较表: 乳品成份钙磷蛋白维生素糖质消化时间AB6 C 羊乳140 120 3.8 1500.2 2 4.5 20min 牛乳110 85 2.9 850.1 + 4.8 120min 人乳33 21 1.5 1710.2 4 7.2 30min 由上表可明显知道羊奶的钙、磷含量是人奶的4-8倍，居于各种食物之首，更明显的超高于牛乳。广东人常以“老火骨汤”来补钙，还不如一杯鲜羊奶补钙多。因此，中国权威期刊《家庭医生》（一九九八年第十三期第15页）发表了“羊奶比牛奶好，羊奶含有抗癌及抗关节炎物质”的科学论文，来倡导国人多饮羊奶。二、从人体对奶品的实际吸收时间来说 由上表及世界营养专家的认证皆知，人体对牛奶的消化与吸收时间，需长达2小时-24小时，而且吸收率最高也不过70％左右而已，所以一般人喝牛奶时皆会有胃部不适，而且饱胀，想拉肚子之负面效果，但羊奶却仅需20分钟即可完全被人体吸收，吸收率更高达90％，因此就实际之“吸收效益”而言，羊奶才是最具营养效益之奶。 三、从保健医学之角度而言 自古至今，无论是中国医学宝典《本草纲目》、《中华医学金典》……，或是现代中西方之营养丛书《现代营
真空冷冻干燥的原理
真空冷冻干燥的原理 目录 第一节冷冻干燥的原理 (1) 第二节冻干机的组成和冻干程序 (2) 第三节共溶点及其测量方法 (4) 第四节产品的预冻 (6) 第五节产品的第一阶段干燥 (9) 第六节产品的第二阶段干燥 (12) 第七节影响干燥过程的因素 (13) 第八节冻干曲线时序的制定 (16) 第九节冻干的后处理 (18)
第一节冷冻干燥的原理 干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是在0℃以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。微生物会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等。因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。 而冷冻干燥法不同于以上的干燥方法，产品的干燥基本上在0℃以下的温度进行，即在产品冻结的状态下进行，直到后期，为了进一步降低产品的残余水份含量，才让产品升至0℃以上的温度，但一般不超过40℃。 冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。 冷冻干燥有下列优点： 一．冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用。如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力。因此在医药上得到广泛地应用。 二．在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，适合一些化学产品，药品和食品干燥。 三．在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性装。四．由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。 五．干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。六．由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护。 七．干燥能排除95-99%以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。 因此，冷冻干燥目前在医药工业，食品工业，科研和其他部门得到广泛的应用。