2010硕士研究生分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义
（硕士研究生试用）
山西医科大学
基础医学院
生物化学与分子生物学实验室
2011.5
实验一动物组织蛋白质的提取
【目的要求】
1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。
2．了解动物组织蛋白质提取的原理。
【实验原理】
由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。
【试剂器材】
1．实验小鼠
2．0.9%NaCl
3．动物组织蛋白裂解缓冲液
Tris 50mM
NaCl 150mM
EDTA 0.5mM
DTT 1mM
Triton X-100 1%
去氧胆酸钠0.5%
SDS 0.1%
4．PMSF/异丙醇储备液100mM（174mg/10ml）于-20℃储存
5．-20℃储存的冰块
【操作步骤】
1. 颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精擦拭皮肤，剪开腹部，剪切肝脏组织，称取0.6g，置
于含预冷0.9%NaCl（6mL）的平皿中。
2.在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。
3.在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液（20μL/2mL）。
4.迅速将2mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。
5.将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中，于4℃离心（1 4000rpm，10min）。
6.离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。
7.所获蛋白提取液可保存于-20℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓
度测定后保存备用。
【注意事项】
在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态，以防蛋白质的降解。
实验二蛋白质的定量（Bradford法）
【目的要求】
掌握考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质含量的原理和方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度，具有快速、灵敏的特点。
考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G250的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范围内二者的结合显色符合朗伯-比尔定律。结合后的产物在595nm处具有最大吸收峰，通过对溶液的光吸收测定可获得与其结合蛋白质的量。
【试剂器材】
1. 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于25mL甲醇中，加入800 mL蒸馏水，再加入100 mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。
2.标准蛋白质溶液（1mg /mL）：牛血清白蛋白100mg，加0.9％NaCl至100 mL。
3.试管及试管架，吸管。
4.比色计。
【操作步骤】
一、标准曲线的制备：取5支试管，编号，按下表操作
编号1号液2号液3号液4号液5号液
标准蛋白质溶液（mL）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
（1mg /mL）
0.9％NaCl（mL）0.8 0.6 0.4 0.2 －
蛋白质浓度 200 400 600 800 1000
（μg /mL）
另取6支试管，编号为0～5，按下表操作
编号0 1 2 3 4 5
1号液2号液3号液4号液5号液
不同浓度蛋白质溶液（mL）－0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.9％NaCl（mL）0.1 －－－－－
考马斯亮蓝试剂（mL） 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg）0 20 40 60 80 100
混匀各管，室温下静置10分钟，于595 nm处进行比色。
二、绘制标准曲线：以A 595 nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准
曲线。
三、测定未知样品蛋白质浓度：
测定方法同上，取适量未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的
A 595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量，从而计算出未知样品的蛋白质
浓度。
【注意事项】
1．在考马斯亮蓝试剂加入后的5－20分钟内测定光吸收，因为在此段时间内颜色最稳定。2．测定中，蛋白—染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的，测定后可用乙醇将比色杯洗干净。
实验三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
【目的要求】
1.了解并掌握SDS-PAGE电泳原理及方法。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
【实验原理】
十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关：
1．凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶，蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时，会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以分离。
2．电荷效应：SDS是一种表面活性剂，在蛋白样品和PAGE凝胶中加入SDS，则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差异消失。
3．变性效应：SDS同时还破坏了蛋白质中的非共价键，导致蛋白质变性，使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小。在进行SDS-PAGE电泳时，同时使用蛋白质分子量标准样品，则可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。
4．凝胶对样品的浓缩效应：SDS-PAGE使用一种不连续的缓冲系统，即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pH值和离子强度也不相同。电泳时，样品中的SDS-蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分离。
SDS-PAGE凝胶已经成为实验室常用的蛋白质分离方法，通常被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量的测定。
【试剂器材】
1．30%凝胶贮备液称取30g 丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺0.8g，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．10%凝胶贮备液称取10g丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺0.5g，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
3．10% SDS 用去离子水配制，贮存于室温中。
4．1% TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）。
5．10% 过硫酸铵用去离子水在临用前配制。
6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）：
Tris 6.0g
甘氨酸28.8g
10% SDS溶液10 ml
用蒸馏水定容至1000ml
7．1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液称取Tris 181.5g，加适量蒸馏水溶解，用浓HCl 调节pH值至8.8，加蒸馏水至1000 ml。
8．0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液称取Tris 60.6g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至6.8，加蒸馏水至1000 ml。
9．0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液称取Tris 6.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.0，加蒸馏水至1000 ml。
10．2 样品缓冲液：
蔗糖4g
溴酚蓝2mg
10% SDS溶液2ml
5% β－巯基乙醇0.5ml
0.05mol/L Tris-HCl（pH 8.0）2ml
用蒸馏水定容至10.0ml
11．0.25%考马斯亮蓝R250 将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450 ml 甲醇中，再加入450ml蒸馏水和100ml 冰乙酸，混匀，过滤除去颗粒物质。
12．洗脱液将50ml 甲醇和75ml 冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中，混匀。
13．预染蛋白质分子量标准:117k D、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质14．电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。
【操作步骤】
1．制备凝胶
（1）准备玻璃板，洗净、晾干。按电泳槽使用说明装好，按下表配制12%分离胶溶液
和5%浓缩胶溶液：
表3-1：浓缩胶与分离胶的配制
溶液成分12%分离胶溶液(ml) 5%浓缩胶溶液(ml)
30% 凝胶贮备液 4.0 －
10% 凝胶贮备液－ 2.5
1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl
2.5 －
0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl － 1.25
10% SDS 0.1 0.05
1% TEMED 0.8 0.4
蒸馏水 2.5 0.75
10% 过硫酸铵0.1 0.05
总体积10.0 5.0
（2）小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中，并为浓缩胶留有空间。轻轻在顶层加入几毫升去离子水，以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。
（3）凝胶聚合后，倒掉上层水，用滤纸吸干凝胶顶端的水。
（4）按表3-1配制浓缩胶，注入分离胶上端，插入梳子，应小心避免产生气泡。
2．点样
（1）待测蛋白样品的制备：若样品为水溶液，且蛋白质含量大于10 mg/ml，可将待测液与样品缓冲液等体积混匀，100℃加热3min。
（2）浓缩胶聚合后，拔去梳子，将凝胶放入电泳槽中；在上、下槽中加入电泳缓冲液。
（3）将样品混合液、标准蛋白按次序加入梳孔中。
3．电泳
起始电压为8V/cm，当染料进入分离胶后，将电压调至15V/cm，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。
4．染色
取下凝胶，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，在摇床上室温缓慢摇动30～60min。
5．脱色
换洗脱液，于摇床上室温缓慢摇动1～2 小时，其间更换1～2次洗脱液。洗脱后的凝胶可以照像或干燥，也可置于含有20%甘油的水中密闭保存。
【注意事项】
1．SDS-PAGE电泳要求样品的离子强度尽量要低，如果离子强度过高，应经透析或离子交换除盐后再进行电泳。
2．丙烯酰胺试剂是一种神经毒素，可通过皮肤吸收，会因多次积蓄而中毒。操作时应极其小心，需要带一次性手套。
3．上样量以10～15μl为宜，如果样品蛋白含量过少，为保证区带清晰，可增加上样量，
同时应将样品缓冲液浓度提高二倍或更高。
4．溴酚蓝染料是指示剂，为电泳时可见的迁移标志物。
5．凝胶聚合的时间与温度有关，夏天聚合快，可置于冰浴中减慢聚合；冬天室温低，可放入温箱中加快聚合。
实验四蛋白质转印实验（半干式）
【目的要求】
1．掌握半干式蛋白质转印技术的基本操作。
2．掌握蛋白质转印后的检测方法。
【实验原理】
蛋白质印迹（Western blotting）是将蛋白质电泳分离技术与免疫标记技术结合所形成的一种鉴定特异性抗原的方法。蛋白质转印应先将含某抗原的蛋白混合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，使各种蛋白成分根据分子量的不同分离开来；再通过电转移将各种蛋白成分转印到硝酸纤维素膜（NC）或PVDF膜上；通过特异试剂（抗体）作为探针，与膜上的相应抗原发生结合，再与酶标记的抗Ig 抗体结合，洗涤后加入底物进行显色。根据显色条带的位置和深浅，可以对抗原及其分子量或相对含量进行检测。蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1-5ng的靶蛋白。
本实验的主要目的是采用半干式电转移将SDS-PAGE凝胶电泳分离后的蛋白质从凝胶
转移至固相支持材料上。裁剪与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜，用去离子水浸湿后，再浸入转移缓冲液内，随后取出进行转移（半干式电转移在室温操作，所需时间较短）；将凝胶及与之相贴的硝酸纤维素膜夹于事先用转移缓冲液浸泡过的滤纸之间，平放在电转仪上，负极在上，正极在下，凝胶在阴极端，薄膜在阳极端，转移方向从阴极到阳极；根据凝胶面积设置电流，室温下进行转移；转移结束，取出薄膜，丽春红染色检测转印效果。
【试剂器材】
1．半干式电泳转印槽
2．硝酸纤维素膜
3．滤纸
4．转移电泳仪
5．培养皿
6．万向旋转摇床
7．转印缓冲液
【操作步骤】
1．将电泳后的SDS-PAGE 凝胶浸在转印缓冲液中，洗10 min。
2．去掉浓缩胶，测量剩余胶的尺寸大小。
3．剪1张和胶大小一致的硝酸纤维素膜，用铅笔在膜的右下角做一个标记，用于定位。剪6张和胶大小一致的滤纸（尺寸一定不能大于胶的尺寸，否则多出的部分会在胶的边缘接触，形成短路，导致转移不充分）。
4．将膜及滤纸在转印缓冲液中浸润10 min 。
5．将3张湿滤纸放到半干电转仪的底部平板电极上（负极），然后依次放置胶、硝酸纤维素膜、滤纸（3张），注意堆放整齐，同时注意每层之间避免气泡存在，一般可用试管碾压赶走气泡（注意：一旦胶和膜接触，位于胶表面的蛋白就会结合到膜上，所以胶一定要一次成功，不要试图调整胶的位置，否则蛋白质色带可能会印上去，最后产生重迭影像）。
6．待所有的膜和胶都放好后，盖上转印仪的上盖，让上部的平板电极压紧由滤纸、膜、胶形成的三明治结构（注意正负极，转印结束后，才可以打开上盖）。
7．连接转移电泳仪，电流通常设为1 mA/cm2左右。8 cm X 7 cm的胶通常使用100 mA恒流转移。大胶必须限制电流在0.8 mA/cm2，防止电流过大，产生过多热量，影响转印。
转印时间如下表所示。
表4-1转印时间和蛋白分子量的关系*
分子量(MW) 转印时间
<20 kDa 30 分钟
>80 kDa 90 分钟
8．转印结束，取出转印三明治，打开后依次取出转印膜及凝胶。
9．将转印膜浸入丽春红染色液中，观察是否有红色蛋白条带出现；转印后的凝胶可以进行考马斯亮蓝染色，看有无蛋白质残留；若电泳时加有预染标准蛋白质marker ，则可在转印膜上看到相应色带，帮助确定转印成功，并可评估转印效率。
10．若继续进行免疫杂交实验，则用去离子水漂洗转印膜后可进行封闭。
【注意事项】
1. 不要切去胶的一角以作标记，因为这样容易导致短路或转移不充分。尽可能在电泳结束后就进行转印，防止样品在胶内弥散开来。
2. 丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。所以应选择可以分离蛋白最低浓度的凝胶进
行电泳。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良
好。
3. 蛋白质结合到硝酸纤维素膜上主要是通过疏水键，对于常规使用效果非常好。但对于小
的多肽，建议使用小孔径(0.2 μm)的膜。
4. PVDF膜比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件，适用于蛋白测序。尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合，其SDS耐受度甚至高于PVDF膜，但也需要更严谨的封闭条件，主要建议用于Northern和Southern杂交。
实验五质粒DNA的提取（碱裂解法）
【目的要求】
1．掌握碱裂解法制备质粒DNA的原理和方法, 进一步认识质粒DNA 的性质。
2．初步掌握分子克隆基本操作技术。
【实验原理】
质粒（plasmid），是能在染色体外自我复制的稳定共生型遗传单位，主要存在于细菌、放线菌、真菌和某些动植物细胞中。它能在细菌中垂直遗传，且保持稳定的拷贝数，赋予宿主细胞某些特殊的表型。迄今为止从细菌中分离得到的质粒都是双链闭合环状DNA分子, 大小为1 kb～200 kb。在基因工程研究中，质粒是最常用的一种基因克隆载体，用于运载外源基因进入宿主细胞。因此，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学技术中的一项基础工作。
质粒DNA提取的关键是要与细菌染色质DNA分开。常用的提取方法有煮沸法、碱裂解法、去污剂法、有机溶剂法和溶菌酶法等, 不同方法各有利弊，应根据不同质粒的性质、不同宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合加以选择。一般以碱裂解法最为常用，因为它对细菌的裂解完全，对染色质DNA和蛋白质的变性充分，因而所提取的质粒DNA 产量高、纯度高。但如果碱变性时间过长，有可能会导致质粒DNA变性，导致随后的内切酶酶切困难。
碱裂解法提取质粒DNA的主要原理和步骤是：
1．接种含质粒的单个菌落到培养基中过夜培养。随着细菌的生长, 质粒DNA也随之自主复制。必要时，可以在细菌生长后期在培养基中适量加入氯霉素，以抑制宿主细胞的蛋白质合成和染色质DNA的复制，细菌的数量不再增加，而质粒DNA的复制基本不受影响，从而大量扩增质粒DNA的拷贝数。
2．离心收集细菌。
3．加入强碱溶液裂解菌体，必要时可以适量加入溶菌酶。此时大分子量线状的细菌染色质DNA和蛋白质发生变性，而闭合环状的质粒DNA多数仍不变性，处于自然状态。
4．几分钟后加入中和液，将pH值调至中性。在高盐浓度条件下，大部分染色质DNA 与蛋白质不能复性，交连成不溶性网状结构，在去污剂SDS的作用下形成絮状沉淀。而质粒DNA分子量小，且为闭合环状结构，少数变性的质粒DNA也能够迅速复性，呈溶解状态。
5．离心，去除大部分细胞碎片、染色质DNA、RNA和蛋白质。质粒DNA保留在上清中。
6．最后再用RNA酶消化，酚/氯仿抽提、透析和乙醇（或异丙醇）沉淀等方法进一步去除残余蛋白质和核酸，纯化质粒DNA。
【试剂器材】
1．LB培养基：蛋白胨10 g, 酵母抽提液5 g，NaCl 10 g, 加蒸馏水至1 000 mL, 用NaOH调pH至7.5 , 高压蒸汽消毒20 min。
2．I号液：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA（必要时在使用前加溶菌酶4mg/mL）
3．II号液：0.2mol/L NaOH，含1%SDS（II号液必须在实验时新鲜配制）
4．III号液：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml（含3mol/L钾，5mol/L醋酸，pH4.8）
5．RNase：10mg/mL －20℃保存备用
6．TE：10mmol/L Tris﹒HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)。高压灭菌20min，4℃保存备用。
7．STE ：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tri s﹒Cl （pH 8.0），1mmol/L EDTA
8．酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
9．乙醇（无水乙醇、70%乙醇），-20℃保存备用
10．台式低温高速离心机
11．涡旋混合器（Vortex）
12．1.5ml eppendorf离心管（灭菌）
13．移液器
【操作步骤】
1．培养：在5ml含适当抗生素的LB培养液中接种含质粒的单个菌落，37℃，150rpm 振荡培养过夜。
2．收菌：取1-1.5ml培养液于1.5ml Ependorf管中，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细菌。
3．重悬：弃上清，在沉淀中加入预冷的I号液100μl，vortex强烈振荡，充分悬浮菌体。
4．裂解：加新鲜配制的II号液200μl，立即温和颠倒离心管5次，混匀。置冰水浴中3-5分钟。
5．中和：加入150μl预冷的III号液，立即温和颠倒混匀数次，混匀。置冰水浴中3-5分钟。
6．沉淀：12 000 rpm离心10分钟，取上清液置新Ependorf管中。
7．酚/氯仿抽提：加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000rpm 离心2分钟。取上清液（小心不要吸到中间蛋白膜），转入另一个Eppendorf管中。
8．氯仿抽提：加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心2分钟，取上清液转入另一个Eppendorf管中。
9．乙醇沉淀：加入2倍体积的无水乙醇（或0.6倍体积异丙醇），混匀，室温放置10分钟。4℃，12000rpm离心5分钟。
10．洗涤：弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，4℃，12000rpm离心2分钟。
11．干燥：弃上清，用消毒滤纸条小心吸净管壁乙醇滴。将Eppendorf管倒置于滤纸上，室温蒸发乙醇10分钟。
12．溶解：加入20μl TE（含无DNA酶的RNA 酶20μg/ml），温和振荡2分钟。置于－20℃冰箱保存。
实验六聚合酶链反应（PCR）体外扩增DNA
【目的要求】
掌握PCR的基本原理与实验技术。
【实验原理】
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种通过体外酶促反应大量、快速、选择性地合成目的DNA片段的核酸合成技术，具有高度特异性、操作简单、高效快速、灵敏度高等特点，是最常用的分子生物学技术之一。
PCR的基本原理如图6-1所示。
PCR反应体系主要由以下5种成分组成：与目的基因上下游互补的两条单链DNA引物（primer）、含目的基因片段的模板DNA、耐热DNA聚合酶、四种dNTP底物和缓冲液。经过约94℃的热变性（使双链DNA模板解离为单链）、37～60℃退火（使引物与模板特异性结合）、72℃延伸（在DNA聚合酶的催化下合成DNA互补链）三步反应为一个循环。每循环一次，目的基因片段数量即大约增加1倍（理论值为2n），而每一次循环所产生的DNA 又成为了下一次循环的模板。通过20～30次变性、退火、延伸三种温度的循环，目的基因片段的数量可以在几个小时内以指数形式扩增上百万倍。因此可以迅速地从极其微量的样品（如一根毛发、一滴血）中大量获取目的基因片段。
PCR反应条件的优化：优化的目的主要有两个，即提高扩增产物特异性和提高产物产量。但在多数情况下，这两个目的却是互相矛盾的。总体来说，适当减少模板、引物、聚合酶、Mg2+的浓度和适当提高退火温度、减少循环次数，可以提高产物的特异性，但相应会减少产量；反之，则可以提高产物的产量，但增加非特异性扩增产物。因此，应根据实验目的合理选择最佳反应条件，必要时可进行多次预实验反复摸索。
1．引物：引物是决定PCR成败的最关键因素。①必须保证引物碱基序列的高度特异性；②引物长度一般为15-30bp，过短则特异性降低；③G+C含量控制在40-60%，且两个引物的Tm值不得相差太大；④引物自身不得存在3bp以上的互补碱基序列；⑤两条引物之间不应存在4个以上连续的同源性或互补性碱基；⑥避免4个以上同一碱基的连续出现；⑦引物合成质量要好，并需要纯化；⑧反应体系中引物浓度一般应控制在0.2-1μmol/L，过低则产量降低，过高则导致非特异性扩增。
2．耐热DNA聚合酶：①通常Taq DNA聚合酶用量为0.5-5U/100μl，酶量过大会导致非特异产物的增加；②传统使用的Taq DNA聚合酶的一个致命缺点是不具备3′→5′校正外切酶活性，错配率高（大约每聚合9000个核苷酸发生一次错误掺入，经过约20个循环后，扩增产物中随机突变率大致为1/400-1/900），导致扩增产物发生突变。现已有多种高保真耐热DNA聚合酶（如Pfu DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等）可供选择，用于某些精度要求高的实验。
3．模板：PCR对模板的质和量要求都不是太高。RNA也可作为模板，但须先逆转录为cDNA。模板不需要太纯，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的加入量一般为0.2-2μg。对于质粒DNA模板只需要20ng。模板量过多，会增加非特异性扩增机会。
4．Mg2+浓度：Mg2+是维持Taq DNA聚合酶活性所必需的，还影响DNA的Tm值、产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2+浓度过低时，酶活性显著降低，使产量降低；过高时，易生成非特异性扩增产物。由于模板DNA、引物、EDTA和dNTP均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，因此Mg2+的浓度应比dNTP高0.2-2.5 mmol/L，模板的DNA应溶于10mmol/L Tris-HCl(pH7.6)/0.1mmol/L EDTA中。
5．dNTPs：dNTP具有较强的酸性，使用前应调节pH至7.0-7.5。浓度范围为20-200μmol/L，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低则降低反应物的产量。四种dNTP应
等当量配制，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成。在100μl反应体系中，20μmol/L dNTPs基本满足合成2.6μg DNA，50μmol/L dNTPs可以合成6.6μg DNA，而200μmol/L dNTPs则足以合成25μgDNA。
6．变性温度与时间：通常采用94-95℃变性1分钟。一般在第1次热循环前预先94℃变性5-10分钟，然后再进入循环过程的94℃变性阶段。
7．复性温度与时间：这是决定PCR成败的又一个关键因素，它直接决定了扩增产物的特异性。合适的复性温度应低于PCR条件下真实Tm值。℃。降低温度可提高产量，但增加非特异性扩增；反之则提高特异性但降低产量。
8、延伸温度和时间：延伸温度一般为72℃。延伸时间主要视目标DNA片段长度而定。正常掺入速度为35-100nt/秒，一般情况下30-60秒就足够，时间过长也增加非特异性扩增。但最后一个循环可将时间延长到4-10分钟。
9．循环次数：在PCR反应后期，由于底物和引物的消耗、酶活性的下降、终产物（双链DNA、焦磷酸）的堆积等原因，导致产物从原来以指数级增加的形式转变为线性形式，即所谓平台效应。所以即便再增加循环数，由于产物的增加量有限，反而会增加非特异性扩增的机会。常规循环数为25-40，多数为30次左右。如果要进一步提高产量，可将样品稀释1000-10000倍后进行第二轮PCR扩增。
10、其它因素：50mmol/L KCl可提高酶促效率。BSA、DTT、明胶、Tween- 20等能有助于酶的稳定。5-10%DMSO有利于DNA变性，但抑制酶活性。5-20%甘油有利于DNA 复性。
【试剂器材】
1．DNA模板（0.5mg/ml）
2．10 pmol/L上游引物
3．10 pmol/L下游引物
4．10×PCR buffer：
200 mmol/L Tris-HCl pH 8.3
15 mmol/L MgCl2
250 mmol/L KCl
0.5% Tween-20
l mg/ml BSA
5．10 mmol/L dNTPs：四种dNTP各2.5mmol/L
6．Taq DNA聚合酶（1 U/μl）
7．PCR仪
8．0.2ml Eppendorf离心管
9．微量移液器
【操作步骤】
1．在0.2ml离心管中加入：
10×PCR缓冲液 5.0μl
10 mmol/L dNTPs 4.0μl
上游引物 2.0μl
下游引物 2.0μl
模板DNA 10μl
Taq DNA聚合酶0.3-0.5μl（1-2U）。
加去离子水至终体积为50μl
2．混匀后，短暂离心。
3．将离心管置PCR仪中。
4．设定热循环参数：
94℃5分钟
94℃30秒
55℃30秒循环30次
72℃30秒
72℃10分钟
4℃1小时
5．进行扩增反应（约2-3小时）。
6．取出反应管，吸取少量进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。其余样品置-20℃保存备用。
实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳
【目的要求】
学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA纯度、含量和分子量。
【实验原理】
凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约3.5）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA 凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量
表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围
琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-4
2.0 0.1-3
大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MW marker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA （covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（open circular DNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA >线性DNA >ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。
DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。
为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直接加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，这样可以在电泳过程中随时利用紫外灯观察核酸的迁移情况。但是EB与DNA的结合会影响DNA的迁移率，因此对于需要较精确测定DNA片段大小、或需根据荧光强度测定DNA含量时，EB 染色应在电泳结束后再进行（将凝胶浸入0.5μg/ml的溴乙锭水溶液中10min即可）。注意：EB是强诱变剂，使用EB必须戴一次性手套，不要洒在桌面地面上，被污染的物品必须专门处理后（加少量漂白粉可使EB分解），再彻底清洗或丢弃。
指示剂溴酚蓝和二甲苯青的作用是指示样品在凝胶中的迁移过程，以确定终止电泳时间。在0.6 %、1%、2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝分别约与1kb、600bp、150bp双链线状DNA片段的迁移率大致相同。在1%琼脂糖凝胶中，二甲苯青大致相当于2kb双链线状DNA 的位置。
图7-1：凝胶灌胶过程示意图
【试剂器材】
1．5×TBE ：
Tris 碱 54 g
硼酸 27.5 g
0.5mol/L EDTA 20 ml
加去离子水定容为1000 ml
2．10mg/ml 溴化乙锭（EB ），避光4℃保存
3．6×上样缓冲液（loading buffer ）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%(W/V)蔗糖
4．琼脂糖
5．实验五制备的质粒DNA 、实验六获得的PCR 扩增产物
6．DNA 标准分子量marker （λDNA/Hind III ）
7．水平式电泳槽、电泳仪
8．透射式紫外灯
9．胶带
10．微波炉或恒温水浴
11．微量移液器
【操作步骤】
1．称取琼脂糖1g ，置三角烧瓶中，加入0.5×TBE 100 ml ，置沸水浴或微波炉中加热，使充分溶解。注意：微波炉煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反复加热1-2次，注意此时可能出现爆沸现象，避免蒸汽烫伤。
2．待琼脂糖溶液冷却至60-65℃左右时加入溴化乙锭，使终浓度为0.5μg/ml ，混匀。
3．用胶带把制胶模具的两端边缘封好，置水平位置，选择孔径适宜的加样孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齿必须与模具
底面保持一定距离（约0.5-1mm ），防止样
品槽破裂，导致样品泄漏。
4．将冷却至50-60℃左右的琼脂糖溶
液缓慢倒入制胶模具中，使凝胶液缓慢展
开，直至形成厚度适当（一般为0.3-0.5cm ）
的胶层。小心去除加样孔周围的气泡。室温
静置30-60分钟。（如图7-1）
5．琼脂糖完全凝固后，小心取出梳
子，去掉模具两端的胶带，将凝胶放入电泳
槽中。
6．电泳槽中注入适量0.5×TBE 缓冲液，使液面高于凝胶约1mm 左右。
7．分别取10μl质粒DNA、10μl PCR产物和约0.5μg DNA分子量marker，加入1/5体积的上样缓冲液，混匀。
8．小心缓慢将样品上样于凝胶加样孔中。记录样品加样孔顺序。
9．上样完成后，尽快开始电泳，以防止样品漂流。接通电源，注意正负极是否正确。调节电压在1-5V/cm左右，样品进胶前电压不要太高。电泳开始后不久就可以观察到溴酚蓝从加样孔迁移到凝胶中。
10．根据指示剂迁移的位置，或根据反射紫外灯显示的DNA迁移位置，判断是否需要终止电泳。切断电源后，取出凝胶。
11．将凝胶置于透射紫外灯上，打开紫外灯（注意尽量避免使用254nm短波紫外灯，并戴好防护眼镜或防护罩），观察染色后发出橘红色荧光的DNA条带，拍照记录。
注意观察样品DNA条带是否清晰，有无拖尾现象，条带数量、大小是否正确，判断样品DNA分子大小，与预期大小是否相符，并目测粗略估算样品DNA含量。
医学分子生物学讲义复习重点
分子生物学 1.ORF 答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。 2.结构基因 答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。 3.断裂基因 答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。 4.选择性剪接 答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。 5.C值 答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。 6.生物大分子 答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 7.酚抽提法 答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 8.凝胶过滤层析 答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 9.多重PCR 答：多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。 10.荧光域值 答：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。 11.退火 答：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢
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现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第三版)上
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学期末考试重点
1.定义重组DNA技术 将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，然后在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 2.说出分子生物学的主要研究内容 1.DNA重组技术 2.基因表达研究调控 3.生物大分子的结构功能研究 4.基因组、功能基因组与生物信息学研究 3.简述DNA的一、二、三级结构 一级：4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了该DNA分子的化学成分 二级：2条多核苷酸连反向平行盘绕所形成的双螺旋结构 三级：DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定的空间结构 4.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？ ①DNA双螺旋是由2条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成，多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定，一条是5---3，另一条是3---5②DNA双螺旋中脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧构成基本骨架，碱基排在内侧③两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对 5.DNA双螺旋结构模型是由谁提出的？沃森和克里克 6.DNA以何种方式进行复制，如何保证DNA复制的准确性？ 线性DNA的双链复制：将线性复制子转变为环状或者多聚分子，在DNA末端形成发卡式结构，使分子没有游离末端，在某种蛋白质的介入下在真正的末端上启动复制。环状DNA 复制：θ型、滚环型、D型 ①以亲代DNA分子为模板进行半保留复制，复制时严格按照碱基配对原则 ②DNA聚合酶I 非主要聚合酶，可确保DNA合成的准确性
③DNA修复系统：错配修复、切除修复、重组修复、DNA直接修复、SOS系统 7.简述原核生物DNA复制特点 只有一个复制起点，复制起始点上可以连续开始新的DNA复制，变现为虽只有一个复制单元，但可以有多个复制叉 8.真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控？ 细胞生活周期水平调控；染色体水平调控；复制子水平调控 9.细胞通过哪几种修复系统对DNA损伤进行修复？ 错配修复，恢复错配；切除修复，切除突变的碱基和核苷酸片段；重组修复，复制后的修复；DNA直接修复，修复嘧啶二聚体；SOS系统，DNA的修复，导致变异 10.什么是转座子？分为哪些种类？ 是存在于染色体DNA上可自主复制和移动的基本单位。可分为插入序列和复合型转座子11.什么是编码链？什么是模板链？ 与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链，另一条根据碱基互补配对原则指导mRNA 合成DNA链称为模板链 12.简述RNA的种类及其生物学作用 mRNA：编码了一个或多个多肽链序列。 tRNA：把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息。 rRNA：是核糖体中的主要成分。 hnRNA：由DNA转录生成的原始转录产物。 snRNA：核小RNA，在前体mRNA加工中，参与去除内含子。 snoRNA：核仁小RNA，主要参与rRNA及其它RNA的修饰、加工、成熟等过程。scRNA：细胞质小RNA在蛋白质合成过程起作用。
分子生物学终极复习资料汇总
《分子生物学》复习题 1、染色体：是指在细胞分裂期出现的一种能被碱性染料强烈染色，并具有一定 形态、结构特征的物体。携带很多基因的分离单位。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。 2、染色质：是指细胞周期间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA 组成的复合结构，因其易被碱性染料染色而得名。 3、核小体：染色质的基本结构亚基，由约200 bp的DNA和组蛋白八聚体所组 成 4、C值谬误：一个有机体的C值与它的编码能力缺乏相关性称为C值矛盾 5、半保留复制：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中， 一条链来自6、亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制 6、DNA重组技术又称基因工程，目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基 因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 7、半不连续复制：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的 合成是不连续的，故称半不连续复制。 8、引发酶：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引 物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 9、转坐子：存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。 10、多顺反子：一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的信使RNA，由DNA 链上的邻近顺反子所界定。 11、基因：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。 12、启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 13、增强子：能强化转录起始的序列 14、全酶：含有表达其基础酶活力所必需的5个亚基的酶蛋白复合物，拥有σ因子。 （即核心酶+σ因子） 15、核心酶：仅含有表达其基础酶活力所必需亚基的酶蛋白复合物，没有σ因子。 16、核酶：是一类具有催化功能的RNA分子 17、三元复合物：开放复合物与最初的两个NTP相结合，并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后，转变成包括RNA聚合酶，DNA和新生的RNA的三元复合物。 18、SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。30S亚基通过其
现代分子生物学总结题库
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
肿瘤分子生物学讲义
肿瘤分子生物学讲义 第一节概述 (1) 第二节肿瘤的发生机制 (4) 第三节癌基因及其致癌的分子机制 (5) 第四节抑癌基因及其抑癌的分子机制 (9) 第五节肿瘤转移相关基因 (11) 第六节肿瘤的预防和治疗 (13) 第一节概述 一、肿瘤及肿瘤分子生物学的概念 肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。 良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。不过有极少数良性肿瘤因其靠近生命中枢或能合成大量生物活性物质也可能杀伤宿主。例如，脑膜上生长缓慢的良性肿瘤通过压迫使得生命中枢萎缩破坏，最终导致宿主死亡；胰岛细胞良性肿瘤可以分泌大量胰岛素而引起体内胰岛素过量，导致低血糖和死亡。 恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。由于技术水平的限制，目前临床诊断的癌症患者多处于中晚期。加上不良生活方式如吸烟、过度饮酒、不合理饮食习惯，以及环境污染增加等因素，在刚过去的20世纪，世界各国许多常见癌症的发病率在总体上呈上升趋势，或维持在高水平，在我国的情况亦大致如此。目前除几种较少见的癌症如妇科的宫颈癌、绒癌等的死亡率有明显下降外，多数常见恶性肿瘤死亡率还处于令人忧心的高位态势下。有研究者预测，在21世纪癌症仍将是危害人类健康的主要疾病之一，故应引起预防、临床和基础研究者的高度关注。 恶性肿瘤几乎在所有类型的细胞中均可发生。根据组织学来源，癌症的起源可分为三种：癌（carcinoma）起源于上皮细胞，大部分成人癌症属此类；淋巴瘤起源于脾和淋巴结等的淋巴细胞；肉瘤（sarcoma）起源于间叶组织如结缔组织、骨和肌肉等。以上在各种实质性组织、脏器中发生的癌症属实体肿瘤（solid tumor）。白血病起源于骨髓造血细胞，恶性细胞存在于流动的血液中，属液体肿瘤（liquid tumor）。 肿瘤分子生物学，就是用分子生物学的理论和技术来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的一门交叉学科 二、肿瘤的生物学特征 1、癌症是体细胞遗传病 就本质而论，癌症是一种遗传学疾病或体细胞遗传学疾病，可简称为遗传病。在癌细胞中发生的遗传学变异有：基因内的碱基替代、缺失、插入和基因扩增等，以及染色体的数量和结构的改变，如非整倍体、易位等；表遗传学改变有：DNA甲基化型式改变、组蛋白修饰和染色质改型等。这些改变引起了肿瘤抑制基因灭活和原癌基因的活化，它们所产生的恶性表型通过有丝分裂能在细胞世代间传递。上述过程均发生在体细胞，这是占全部癌症中绝大多数的、散发性癌症的发生模式。遗传性癌综合征不同于其他一些遗传病，它遗传的仅是癌易感性，还需要体细胞的多次击中才能产生恶性表型。 基因组内存在两类癌相关基因：一类基因直接调控细胞增殖与凋亡、运动与黏着，以及细胞基质的改型等，并参与细胞的信号转导，结果得以维持正常组织细胞的自稳性。当这些基因缺陷造成上述过程失衡，随着细胞各种恶性特征的积累，最终癌症发生。这些基因包括癌基因、肿瘤抑制基因中把关基因（gatekeeper gene）；另一类基因并不直接调控细胞的增殖和凋亡，而是影响第一类癌相关基因的突变速率的管护基因（caretaker gene），这包括各类DNA修复基因，还包括代谢酶多态性在内的一组修饰基因（modifier gene）。 2、癌细胞的恶性生物学特征
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，