Annexin V---PI双染方法
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。
用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基；
用冷PBS洗涤细胞两次；
用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 10 cells/ml；
在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。5. 加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟；
在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。
Annexin V相关图片(8张)
1.上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
2.建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
3.检测annexin V-FITC单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL2 （或FL3）PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL2（或FL3）荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL2的阳性信号，此时要降低FL2（或FL3）PMT的电压。
4.检测PI单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL2（或FL3）漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。
注：如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
5.设定十字门的位置，FL1和FL2（或FL3）的划定方法如下：
5.1设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是Annexin V染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。将垂直的FL1标尺设定在紧靠Annexin V阴性群体右侧0.1-0.2Log单位的地方。
5.2 设定FL2 （或FL3）标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。
注：在阴性群体门以外的细胞可被识为Annexin V或Annexin V和PI阳性的细胞。
荧光显微镜观察：
滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
注：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。
在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。
WDP系列无盲区低偏差双色水位计使用说明书
WDP系列 汽包水位低偏差云母水位计使用说明书 华电测控设备 地址：市海港区北环路108号 ：0 5300192 5300122 客服：400-811-8908 800-911-3000 传真：0邮编：066001 E-mail：https://www.wendangku.net/doc/3a5696611.html, ： https://www.wendangku.net/doc/3a5696611.html,
一、用途及特点 WDP系列汽包水位低偏差云母水位计是用于各发电厂、石油化工及各工矿企业的高压蒸汽锅炉或其他压力容器监测水位的一次就地直读仪表。它是在总结国外各种水位计优点基础上最新研制的低偏差云母水位计，用汽红水绿显示液位，无水全红，满水全绿，红绿界面即为实际水位。可在现场直接观察也可以配套彩色工业电视监视系统，在控制室的监视器荧屏上远程监测现场实际水位。它与其他双色水位计相比较，具有如下几个特点： 1、低偏差。由于加入饱和汽伴热管和饱和水置换装置，能够真实反映汽包中的水位。 2、无盲区、窗口布置合理。在水位计本体上设置两排多个窗口，所以在水位计观察围没 有盲区。 3、自冲洗效果好，水位计左右侧管水位相差小。由于本系列水位计是长窗式，与冷凝水 接触面积大，而且在上部加装了冷凝器，所以当蒸汽流经上连接管时，一部分变为冷凝水后可顺窗口表面冲洗观察窗，使窗口不易挂垢。加装冷凝器的另外一个作用是：远离连通管一侧的冷凝器壁厚小一些，冷凝速度快，向水位计补充饱和水水量大，使得左右侧管水位差非常小。 4、光源采用特制的二极管冷光源，只需接220V电源到变压器，二极管灯连接到变压器即 可，发光均匀，耐高温，寿命长。整体光源调整更方便。 5、该型号水位计具有观察围宽、颜色清晰、透明逼真的优点。 6、水位计本体都采用优良材质，不锈死，不变形。 7、窗口组件选用国际一流材质，承压好，不泄漏，运行长久。 8、使用寿命长，维护费用低。 二、结构与工作原理 1、外形结构图（以汽水侧取样管间距为670的为例）
细胞凋亡实验步骤及注意事项
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞凋亡试验常用的方法
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
双色水位计工作原理
双色水位计工作原理 tut光 tL Jtt 图6述取色水位计匣理结梅示意庆W 6-7衣色水位计安餃孫抚图 W基車结构：（bi期童室F
高中生物细胞凋亡的知识点(一)
高中生物细胞凋亡的知识点(一) ［背景知识互动］ 1.人的自然寿命是多少岁？人的寿命的长短与什么有关？ 2.人体每天都有哪些细胞死亡？举例说明。 答案: 1.人的自然寿命是120岁。人的寿命与细胞衰老有直接关系。 2.人体每天死亡的细胞有小肠上皮细胞、皮肤细胞、血红细胞等。知识链接 人体的衰老与细胞的衰老有关。 人体内每天都有大量的细胞死亡。 ［典型例题探究］ 【例1】什么是细胞凋亡？ 解析：高等真核生物的大多数细胞，在丧失生理功能或严重受损时，激活固有的细胞自杀程序而自灭。这一过程称为细胞程序化死亡。细胞凋亡这个词指细胞程序化死亡所表现的生理变化和形态变化，其中包括细胞收缩、膜泡化、染色质浓缩和降解成小片段。 答案：细胞凋亡是指生物体生长发育过程中，由基因控制的，按照一定的程序发生的'细胞死亡，因而细胞凋亡又称为程序性死亡。规律发现 细胞凋亡中的细胞经常降解成为膜包裹的凋亡体，被巨噬细胞或邻近的细胞吞噬或消化，但不产生炎症反应。 【例2】细胞凋亡的大致过程可分为三个阶段，它们是：________、________、 ________。 解析：.细胞凋亡的过程的三个阶段为： 凋亡的起始：细胞皱缩，细胞连接消失，内质网膨胀，染色体固缩并沿着核膜分布，但细胞膜依然完整。 凋亡小体的形成：核膜破裂，染色体断裂为大小不等的片段，与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围，在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起，这些突起叫做凋亡小体。 细胞的解体：凋亡小体逐渐与细胞分离，脱落至细胞间质，最终被周围的细胞吞噬并消化。 答案：凋亡的起始凋亡小体的形成细胞的解体注意对细胞凋亡过程的掌握。 1
第五章：流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡 Annexin V检测细胞凋亡 Annexin V (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的断裂片段分析 (7) DNA 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits检测细胞增殖 BrdU Flow (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3检测细胞凋亡 Active (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。 3. 微量加样器和加样头。
双色水位计的使用及维护手册
水位计的使用方法 为了锅炉和您的人身安全，希望操作者严格地按本说明书指导操作，以避免发生各种事故，且可延长水位计的使用寿命。正常使用寿命八年不许超期使用。 无论是首次投入使用，还是停车后再用，本使用方法都是适用的。 调试及启用的整个过程，应在接通电源，视场明亮条件下进行。 1)向水位计导入热水、蒸汽、并确定水位。 在导入水汽之前，操作者一定站在水们计的侧面，不可站在前面工作。 a)关闭排污阀。 b)把水阀缓慢开1/4周，向水位计内徐徐导入热水。 注意：水阀切不可开得太大，否则安全球将动作，堵死水路无法进行工作。如果安全球已堵住通路，可重新关闭此阀，并重新缓慢开启。 c)慢慢打开汽阀1/4周，向水位计内徐徐导入蒸汽，若在此之前安全球已动作，则由于水位计内蒸汽压升高，安全球会自动脱落，再开水阀即可放入热水。 d)把汽阀及水阀全部打开。 e)认真观察水位，锅水开始进入水位计，使水位逐渐升高，直到水位基本不变为止。但水位应有微小波动，表示水、汽管路畅通。 如看到不水部分的窗口变暗甚至全黑，也不必惊慌。这是因为水中夹带有大量铁锈及其它脏物所致。这可用日常维护中的第2项中排污清洗办法解决。 f)如果通过以上操作，而水位计中没有导入水或汽，可关闭水、汽阀，开排污阀，并重复(a-e)操作一次。再有问题应检查水汽管路阀门或焊接管焊口处是否堵塞。 g)水汽界面最好处在观察窗内，如果处于词盲区，虽不影响判断水汽大概位
置，但看不到水面波动，应微调水位高度。尽量让水位露出来。 h)一切正常后，把水阀、汽阀各自回旋(逆时针) 1/4周，这样可以防止在长期连续使用后，阀杆与后座烧结在一起。 i)检查玻璃、云母，没有裂纹，压盖及阀不出现泄漏为正常。 2)调试光学系统 半导体冷光源： 发现红绿颜色不好时，或更换二极管板重新安装后： a)首先旋松光源壳底部的蝶形螺母，然后旋转光源壳外侧顶部的小手轮，水 平移动壳体里的红绿色镜架体，向里移动为绿色，向外移动为红色； b)镜架也可作自身旋转，倾斜3°角，效果更好； c)一人调整镜架，另一人在水位计正前方3米远处观测红绿，达到汽红、水 绿、界面清晰为止； d)工业电视监视应安装在水位计正前方大约3米远的±3°角范围内观看水 位计的两排窗口，镜头正对着水位计窗口中心（即零点），否则将影响红 绿颜色的观测效果（水位计红绿颜色观测角很小，位置不对，颜色不好）。灯管型热光源： a)左、右调整镜架，或镜架绕轴线旋转，在水位计正前方观看，汽红、水绿，界面清晰，红绿不渗杂为止。 b)调整灯管及反光碗，使在前方观看亮度最亮为止。 c)重复a)调整达到最佳效果。 d)如果是五窗水位计，要调整到在水位计正前方同时观看两排窗口，均应达到汽红、水绿、界面清晰，到此为止，水位计进入正常运行状态。 3)水位计不得参与锅炉酸洗、煮炉。
细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
双色水位计的正确操作方法
双色水位计的正确操作方法 为加强双色水位计运行维护，保证机组稳定运行，运行各班对双色水位计运行要予以充分重视，确使每一位班员都会正确冲洗水位计。 一．双色水位计的投入 1.锅炉冷态时的投入： [A]. 确认水位计检修工作结束，照明齐全。 [b]. 开启水位计侧一、二次门，关闭放水门。 [c]. 水位计随锅炉一起升温升压。 2.锅炉热态时水位计的投入： 注意双色水位计解列后重新投运时，需要充分预热。 [a]. 确认水位计检修工作结束，照明齐全。 [b]. 打开水位计排污门。 [c]. 微开水位计汽侧一出门。 [d]. 微开水位计汽侧二次门，对水位计预热20 ~ 30分钟，直至水位计本体温度稳定。 [f]. 进行水位计螺母复紧。 [g]. 开启水位计汽、水侧一次门。 [h]. 开水位计汽侧二次门1/5圈。 [I]. 开水位计水侧二次门1/5圈。 [j]. 水位计正常后，交替开启水位计汽，水侧二次门。二．双色水位计解列 水位计在运行中，如发生水位计严重泄露和爆破时，应将水位计
解列，其操作步骤如下： [a]. 关闭水位计汽、水侧一次门。 [b]. 关闭汽、水侧二次门。 [c]. 开启排污门。 三．双色水位计冲洗 水位计长期运行会结垢，导致显示不清，运行中需冲洗，以免运行人员误判断而造成水位事故。冲洗水位计的步骤如下： [a]. 先将水位计汽、水侧二次门关闭后，再微开1/4 ~ 1/5圈，然后开启放水门，进行汽水管路及云母片的清洗。 [b]. 关闭汽侧二次门进行水侧管路及云母片冲洗。 [c]. 关闭水侧二次门，开汽侧二次门1/4 ~ 1/5圈，进行汽侧及云母片冲洗。 [d]. 微开水侧二次门1/4 ~ 1/5圈，关放水门，水位计应很快波动，指示清晰，否则应重新冲洗一次。 [e]. 缓慢将汽水侧二次门全开，认真观察水位，炉水开始进入水位计，使水位逐渐升高，直到水位有微小波动为止。 [f].冲洗完毕后并与另一只水位计水位对照指示相符。 [f]. 注意冲洗水位计时间不应过长，冲洗时防止开的过大或快会导致水位计中保护弹子堵死无法工作。 锅炉专业
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡
A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。
无盲区双色水位计作业指导书
无盲区双色水位计作业指导书 1结构特点及工作原理 (2) 2主要技术参数 (4) 3安全措施 (5) 4工具及备件准备 (6) 5云母组件的技术要求 (6) 6检修工序及质量标准 (6) 7维修注意事项 (8) 8热紧 (8)
1 结构特点及工作原理 本水位计主要由表体，阀门，冲洗器，光源总成（光源箱，观察罩）及电源器组成。 本水位计观察孔在表体两条直线上，通过将观察孔交错组合消除了中间盲区。由光源发出的光通过红绿玻璃片，滤成红光，绿光，分别射向表体的观测窗，在表体的汽项部分，红光射向正前方，而绿光斜射到壁上被吸收;与此同时在液相部分，由于水的折射是绿光射向正前方，红光斜射到壁上被吸收，因此在正前方观察将获得汽红，水绿；汽满全红，水满全绿的显示效果（见图2）。
（1）本水位计通过汽，水阀门与汽包汽侧，水侧相联接，形成连通体，利用连通体的原理是水位计的水位与汽包水位一致。 （2）本水位计所附带的冲洗器所产生的饱和冷凝水不仅能够实现更新水位计表体里面的水质，并且在流过云母片表面时还能起到冲刷云母片的作用，在云母片表面形成一层薄薄的水膜，阻止云母片表面结垢，使水位计始终保持清晰的观测效果。.必须定期更换水位计云母 应每半年更换一次以防止发生泄漏 即更换云母组件。
2 主要技术参数 监视方式：就地正前方目视或彩色工业电视远程监视
3安全措施 （1）严格执行《电业安全工作规程》办理热力机械工作票， 解列双色水位计，关闭双色水位计来水、来汽一次门,关闭双色水位计快关阀,开启双色水位计排污阀,确认双色水位计内部无压力时方可开始工作。 （2）云母水位计停止运行。 （3）关闭汽侧一二三次门和水侧一二三次门，打开放水门泄压。（4）清点所有专用工具齐全，检查合适，试验可靠。 （5）现场工具，零部件放置有序，拆下来的零部件必须妥善保管好并做好记号以便回装。 （6）所带的常用工具，量具应认真清点，绝不容许遗落在设备内。（7）开工前召开专题会，对各检修参加人员进行分工，并且进行安全，技术交底。
关于细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精
确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发
生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
双色水位计和水位电视调试方法
无盲区双色水位计使用说明 一、光源调试方法 1、调试前准备工作: 首先,检查安装及连线无误后，送电，这时水位计应有显示，即全红。 其次,确定水位计内水位是否波动，如能看到水位波动，可按下面的调试方法进行调试；如看不到水位波动，说明水位计没有投上，水汽没有进去，需重新将水位计投入运行，具体投运方法详见说明. 最后,将水位计阀门微开1/5圈即可进行调试，在调试中阀门不得完全 打开，以免出现事故。 2、调试光源时，首先，旋松光源罩上部的锁紧螺钉，分别旋转中间的两只调整盘得到理想的绿光后（见下图左侧顺时针转8—12°，右侧逆时针转8—12°），锁紧螺钉；再轻微旋转外侧的调整盘得到理想的红光（见下图调整范围±4°），锁紧螺钉。（为保证调试效果，应在水位处于观测范围内时，进行以上操作） 3.当配水位电视监视系统时，其调整方法为：面对水位计正前方，距离为2~5m之间均可，摄像机轴线与水位计标尺的零位线应处于同一平面内，且垂直于观测面来观察水位计的液面位置。此时如果监视器的显示效果不理想，可按第2条的方法重新调试，直至监视器显示液面清晰，即汽红、水绿。 4.水位计明亮程度不同,可通过调整电源器上的红灯和绿灯亮度来进行,以红绿显示
4、调试完毕后，水位计正常运行时，阀门必须全开，全开方法必须严格按照说明书6.4操作。 二、水位计投运方法和排污方法 无盲区系列双色水位计初次安装或解裂后重新投运时，需要充分预热。预热之后需要对水位计进行复紧。 预热方法： 首先开启水位计排污阀，然后微开启汽侧一次阀，再将水位计的汽阀缓慢开启1/5圈，让微弱汽流通过大约20～30分钟左右，使水位计本体温度相对稳定。然后顺序关闭一次阀、二次阀、排污阀。切记此时应按说明书7.3.7的方法对所有螺母进行复紧（扭力扳手的使用方法见附页1）。再按投运方法操作投运水位计。当水位计投入正常运行24小时后，最好再一次对角紧固螺母，注意最高扭矩不能超过极限值，以免损坏密封组件、双头螺柱及表体螺纹孔（紧固前一定要先关闭所有阀门）。 投运方法： 无盲区系列双色水位计阀门内设有保险子，即钢球保护装置（见图7及明细表），投运前此阀门处于关闭状态。投运时先开启一次阀，然后将水位计的汽阀缓慢开启1/5圈，再将水阀缓慢开启1/5圈，即将关闭状态阀门的手轮逆时针旋转1/5圈，待水位正常后，汽阀、水阀交替开启，直至全开。否则如水位计阀门一次全开，保险子会将通道堵死，出现假水位而造成严重事故。如果因错误操作引起保险子堵死通道时，应立即处理，处理方法是：立即关闭阀门，不得延误时间，然后按上述开启阀门方法重新操作一次。锅炉正常运行时要全开水位计的汽、水阀门，否则保险子起不到保护作用。 排污方法： 无盲区系列双色水位计在排污时，应先关闭汽、水阀门，然后开启排污阀门排污，排污后关闭排污阀，然后再按投运方法正确投运水位计。 三、密封组件更换方法： 1、水位计更换组件前的冷却方法： 水位计解裂后，严禁采用（与水位计温差＞20℃）喷淋、充水等方式将水位计快速冷却，以免发生危险，应该采取自然冷却的方式使水位计缓慢冷
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。
流式测凋亡原理步骤和结果判断
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断 一、原理： 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。 二、步骤： 1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。 2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。 3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，
B49X-25锅炉透反射双色水位计使用说明讲课讲稿
B49X-25透反射锅炉双色水位计使用说明一、概述 B49X－25型透反射式双色水位计是专用于各类承压容器及工业蒸汽锅炉和蒸汽机车锅炉的水位显示，有汽红水绿来指示液位高度。是新乡市中博仪表有限公司的一个拳头产品。 该水位计有上下阀门与中间的水位显示仪三部分组成，排污阀与下阀相连，上下法兰与锅炉炉壁法兰连接，根据光的性质，红光和绿光的波长不同，在同种介质中的折射角不同，水对光的透射感光能力不同，构成了双色水位一、概述 B49X－25型透反射式双色水位计是专用于各类承压容器及工业蒸汽锅炉和蒸汽机车锅炉的水位显示，有汽红水绿来指示液位高度。经过新乡市中博仪表有限公司技术科的公关改造后。该水位计有上下阀门与中间的水位显示仪三部分组成，排污阀与下阀相连，上下法兰与锅炉炉壁法兰连接，根据光的性质，红光和绿光的波长不同，在同种介质中的折射角不同，水对光的透射感光能力不同，构成了双色水位计的特殊结构，光源发出的光线经光学系统成像，形成汽红水绿双色显示，工作时把汽水阀打开，排污阀门关闭，这样水位计与炉水构成一个连通回路，根据连通器原理，则双色水位计水位高度就是锅炉内部的水位高度，这样由红绿即可判断锅炉里水位高度。 二、主要技术指标： 1.安装中心距L（mm）：250 300 330 350 400 440
2.可视高度（mm）：145 165 165 195 195 3.公称压力：2.5Mpa 实验压力：1.5倍公称压力 4.工作温度：≤225℃ 5.连接法兰标准：JB/T9245-1999 DN25 6.材质：铸铁铸钢不锈钢 7.工作介质：水、蒸汽 8.光源：AC36V/6W 三、安装 1、双色水位计属于精密仪表，出厂时已经调好，不能随意拆卸，不得敲击碰撞，防止玻璃破碎。 2、安装前应详细检查，并消除在运输过程中造成的缺陷，清理污垢。 3、安装时先将双色水位计的上下阀门法兰与锅炉炉壁法兰连接好，然后对水位计玻璃预热后方可运转。 4、电源感应器应放在清洁通风处，严禁与炉壁接触。 5、水位计前不要有很强的亮光，以免降低观察效果，观察水位计时，视水员要站在水位计的正面。 6、锅炉初上水或升压时，可能液汽显示不清，这好似因为锅炉水质不清洁、水流不稳所致，只是暂时的属于正常现象，当锅炉内水位水压正常后，即能清晰的显示液位。
(完整word版)细胞凋亡过程
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。