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介孔球状纳米羟基磷灰石的多级组装合成

2009年第67卷化学学报V ol. 67, 2009第23期, 2697~2702 ACTA CHIMICA SINICA No. 23, 2697~2702

* E-mail: sundongmei@https://www.wendangku.net/doc/356770270.html,; Tel: +021-********

Received April 10, 2009; revised July 8, 2009; accepted August 10, 2009.

国家自然科学基金项目(No. 50802063)、教育部科学技术研究重点项目(No. 109058).

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维状和球状等产物[2~5], 它们在很大程度上改变了普通HA的脆性大、抗拉强度低、对负荷承载差的弱点. 但是由于HA复杂的组分和晶体结构, 材料性能对产物相纯度、同质性、非化学当量以及形貌结构非常敏感[6], 不同结构不同形貌的HA必然会导致性能上的差异[9]. 介孔材料多具有大的比表面积, 其发展不仅将分子筛由微孔范围扩展至介孔范围, 而且使得大分子吸附、催化反应、药物存储等在医药应用方面得以实现. 但是目前还未见到介孔特殊形貌超结构HA的纳米组装合成. 而且从合成方法上来说, 文献报道纳米超结构材料的制备一般而言对条件要求都很高, 不利于将来产业化[7,8].

液膜是一类通过流动载体在隔离的两相溶液中实现离子传输的技术, 孙冬梅课题组曾创新性地利用支撑液膜在无机碱土金属的纳米材料制备方面取得了一些进展[10,11], 由于液膜思想本身和生物体内的细胞膜有异曲同工之处, 如果将该方法用于生物材料的制备, 很可能会在生物相容性上获得一些突破, 解决生物纳米材料在人体内的应用缺陷.

本文将支撑液膜(SLM)技术与材料自组装和分子构建相结合, 利用液膜离子传输控制反应速率, 添加有机小分子协同界面模板, 设计出一种较为简易的实验方法, 诱导纳米晶体进行嵌段组合团聚成非致密型超结构, 得到一种类似毛球状的新型介孔球状纳米HA材料. 不仅大大提高了与细胞伪足的接触几率和接触面积, 而且还能利用其介孔特性进行相关功能性的设计. 本文还对这种新型HA进行了生物学效应的分析, 在细胞水平上探讨其生物相容性. 为介孔材料在酶、蛋白的固定和分离, 大分子吸附、催化反应、药物存储等方面应用于人体提供了可能.

1 实验方法

1.1 实验仪器和试剂

1.1.1 实验仪器

昆山市超声仪器有限公司KQ218超声波清洗器; 800型离心沉淀器; 标准模具厂6511型电动搅拌机; 荷兰飞利浦XL-31 ESEM扫描电镜; Thermo Nicolet Nexus 傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR); Philips Pw 1700型X射线衍射仪(XRD)测定, 分别采用KBr压片法与CuKα射线, 波长1.54056 ?; Hitachi H-800型或JEOL 2010透射电子显微镜(TEM), 加速电压分别为200与160 kV; 干燥箱; pH计; 安捷伦紫外可见分光光度计; 全自动比表面积和孔隙度分析仪.

1.1.2 试剂

CaCl2, Na2HPO4, 氨三乙酸, 邻菲罗啉(Phen), EDTA, 乙二胺, 柠檬酸, 三氯甲烷, 丙酮, 无水乙醇, 所有试剂均为AR级, 水为去离子水, 混合纤维素酯微孔滤膜(孔径0.22 μm, 上海兴亚净化材料厂).

1.2 材料制备

将0.2 g邻菲罗啉溶解于80 mL氯仿中, 以3000 r/min的转速剧烈搅拌约15 min, 制成含载体的液膜, 将清洗处理过的膜干燥后放入上述液膜体系中浸泡20 h 后取出, 用滤纸将表面处理干净, 装入反应装置, 形成中间为SLM, 左右为溶液相的隔离体系.

将0.2 mol/L CaCl2溶液, 0.05 mol/L Na2HPO4溶液分别加入到SLM左右两侧, 控制Ca/P为 1.67. 在Na2HPO4溶液一侧加入2.5%的修饰剂氨三乙酸, 用HCl 和NaOH调节pH至8.3, 反应一定时间后, 将Na2HPO4溶液一侧的产物离心分离后, 先后用水、丙酮、无水乙醇各清洗两次, 最后将产物保存在无水乙醇中.

反应方程式:

CaCl2+Na2HPO4+H2O→Ca10(PO4)6(OH)2+NaCl+HCl 1.3 材料结构和形貌检测

用透射电镜(TEM)观察产物的形貌及尺寸, X射线晶体衍射(XRD)进行物相分析, 用N2吸附法(BET)测定粉体比表面积及孔径分布情况. 通过MTT法检测细胞存活率来判定HA的生物相容性. 并用红外及紫外光谱分析产物的组成和载药性.

2 结果与讨论

2.1 材料性能分析

2.1.1 电镜分析

图1和图2分别为不同条件下合成的HA电镜照片. 结果显示, 在缺乏SLM下, 修饰剂对晶体发育影响不大, HA只能结晶成为普通的针状, 但是利用液膜法并加入晶体修饰剂以后, 形貌和微观结构组成都发生了变化. 首先形成小晶粒, 进一步形成纳米片状或带状结构, 加入的氨三乙酸和支撑液膜在膜界面处形成了协同模板, 诱导纳米晶体具有相同的结晶取向, 纳米片状亚结构发生有序的、定向的组装. 而且由于球状结构具有能量最低的特点, 随着反应时间的增加, 低级的纳米亚结构逐步团聚形成球状结构.

2.1.2 X射线衍射分析

40 ℃真空干燥48 h的HA的XRD图谱如图3.

图3为普通合成产物和球形产物的X射线粉末衍射图谱. 可以看出, a, b产物的衍射峰基本相同, 只是在峰的宽化程度上稍有差别,都为羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2, 属于六方晶系, 晶格常数为a=9.58

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图1 SLM 法合成的HA 透射电镜照片

a —为反应6 h,

b —为反应12 h,

c —为反应24 h,

d —为反应36 h,

e —为反应48 h,

f —为整体的照片

Figure 1 TEM photograph of HA obtained by SLM method

Reaction time: a —6 h, b —12 h, c —24 h, d —36 h, e —48 h, f —

photograph as a whole

图2 缺乏SLM, 其他条件相同得到的HA 透射电镜照片 Figure 2 TEM photograph of HA obtained under the same conditions except the absence of SLM

?, c =7.00 ?, 衍射峰对应的晶面符合标准衍射卡片(JCPDS Card No: 15-876).

SLM 制备的产物衍射峰发生宽化可能是由于晶格畸变引起的宽化和由晶粒细化引起的宽化[12]. 相对于普通条件下制备的HA 的衍射峰, 介孔超结构HA 结晶过程中出现了晶格缺陷[13], 致使粉体中有晶格畸变与

图3 HA 的XRD 图谱

(a) SLM 法合成的HA; (b) 缺乏SLM, 其他条件相同得到的HA

Figure 3 XRD diagram of HA

(a) HA obtained by SLM method; (b) HA obtained under the same conditions except the absence of SLM

晶粒细化, 这两种效应均将造成X 射线衍射峰的宽化. 2.1.3 材料的微观形态和粒度分布

用N 2吸附法(BET)测定粉体比表面积. 从图4可以看出, 液膜法合成的HA 孔径分布在1.7~100 nm, 平均孔径为17.5 nm, 在介孔范围.

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图4SLM法合成的HA比表面积吸附脱附曲线及孔径分布曲线

Figure 4 BET and BJH of HA obtained by SLM method

参照细胞的伪足结构特点, 非致密态的介孔纳米组装HA势必会大大增加比表面积, 为细胞的细小伪足提供大量的附着位点, 表现出良好的接触引导作用, 而大量纳米级伪足的附着必将对细胞活性产生较大的影响, 而且相互贯通的非致密结构还可以形成纤维组织和新生骨组织交叉结合, 有利于成骨细胞的爬行行为.

2.1.4 组装机理分析

SLM反应体系通过离子传输、溶液过饱和度控制晶体生长速率, 水油界面的特殊环境影响晶体生长的取向性[10,11], 孙冬梅等[16]在利用SLM制备碱土族碳酸盐纳米材料时证实了该反应体系的控制作用, Yu等[17]也认为有机物具有分子识别作用. 具体来说, 最初, Ca2+按图所示传输至膜的另一侧, 利用SLM控制钙离子的传输速度, 从而降低羟基磷灰石的结晶速度, 提高溶液的过饱和度, 由于羧酸根离子能与钙离子以离子键形式结合, 形成以钙离子桥连的离子键大分子体系的交织网络结构, 增强了结构的密实性. 氨三乙酸在主链上出现一个N原子, 所连的三个底边都为CH2COOH, 所以它的底部为一个等边三角形, 如果从底部看上去的话, 形似一个比较规则的漏斗锥, 当羧酸根和钙离子发生络合或静电作用时, 周围的单链为了寻求能量最低, 会发生键的转动, 导致空间匹配时限域性的不同[18], 加入的氨三乙酸和支撑液膜在膜界面处可能形成了协同模板, 共同影响了晶体的生长.

在修饰剂和SLM的影响下成核结晶, 由于能量的关系, 结晶总是发生在膜界面处. 所以扣除界面处其它因素, 膜界面处的过饱和环境以及有机/无机相的表面张力可能会对晶体的取向性有轻微的影响, 晶体生长方向对结晶形貌会产生一定影响, 使之趋于相同的结晶取向, 逐步合成材料结构. 2.1.5 生物相容性实验

文献报道的普通HA对生物体一般没有毒性, 但是结构的改变有可能影响材料的生物相容性. 为验证介孔超结构HA的生物效应是否受到影响, 采用MTT[14]比色法对其细胞毒性进行检测. 使用正常细胞株293T, 以2×104个/mL的浓度接种于96孔板上, 每孔体积100 μL, 于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养. 以细胞培养液为阴性对照组, 液膜法合成的HA为实验组, 将材料用培养液配制成不同浓度的悬浊液, 依照MTT法实验检测其对细胞的毒性.

倒置显微镜观察细胞形态发现, 液膜法合成的介孔超结构HA表现出较高的细胞增殖率, 细胞贴壁状态良好, 胞膜完整, 胞核明显, 胞浆丰富, 具有正常的细胞形态. 几乎未见核固缩, 核碎裂及核溶解等细胞变性坏死征象. 由图5可以看出悬浊液浓度越低细胞存活率越高, 随着悬浊液浓度的增高, 细胞的存活率趋于稳定. 以阴性对照组的OD值作为100%细胞增殖率, 计算细胞的平均存活率在80%以上, 细胞毒性为1级[15], 可认为SLM法制备的介孔HA具有良好的细胞相容性

.

图5离子传输与沉淀过程示意图

Figure5

Process of ion transfer and precipitation

图6SLM法合成的HA在293T细胞中的毒性测试图Figure6MTT of HA obtained by SLM method in cell 293T

2.2 材料载药性能分析

羟基磷灰石作为药物载体系统能提高药物在生物

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膜中的透过性, 有利于药物透皮吸收并发挥在细胞内的

药效. 纳米羟基磷灰石作为药物载体十分安全, 因其与

人或动物的骨骼、牙齿成分相同, 且不为胃肠溶液所溶

解, 在释放药物后可降解吸收或全部随粪便排出. 实验

合成的球状纳米羟基磷灰石由于其适度的孔径及大的

内部空间, 如果能将药物包裹其中, 在引入放射性元素

等方面可用于癌细胞灭活.

因为鬼臼毒素对大部分肿瘤细胞有明显的抑制作

用, 且其极易溶于丙酮、乙醇等有机溶剂, 有明显的红

外及紫外吸收, 可利用这些特性判定材料是否能够载入

药物. 反应前, 在内相Na2HPO4溶液一侧加入相当于

HA理论产量的10%的鬼臼毒素, 使材料在形成过程中

慢慢将鬼臼毒素包裹其中. 合成完毕后依次使用丙酮和

无水乙醇溶液洗去材料外部附着鬼臼毒素, 通过红外和

紫外光谱分析判定药物是否包裹入材料中.

2.2.1 光谱分析

鬼臼毒素的有机结构在红外光谱中有明显的吸收,

因此利用红外光谱分析是表征HA中是否载入药物的一

个很有效的手段, 液膜法合成的HA[图7(a)]结果和

XRD吻合, 具有HA的几个特征吸收峰1644, 1043, 574

cm-1. 而载药后的HA[图7(b)]除了有以上吸收峰外

,

图7未载药与载药的SLM法合成的HA的红外光谱检测图

(a)未载药的HA; (b)载药HA

Figure7FT-IR spectrums of different HA prepared by SLM

(a) pure HA, (b) HA wrapped podophyllotoxin 数据分析结果也清晰给出了鬼臼的特征吸收峰1126, 1026, 917, 868, 605 cm-1, 说明利用介孔超结构HA进行有毒药物的包覆载药是可行的.

因鬼臼毒素在285 nm有特征吸收, 对载药和未载药的材料的紫外吸光光度值进行测定可以更进一步确定药物是否载入. 如图8所示, 材料载药后(b)在285 nm 有吸收峰而未载药(a)时没有, 证实药物确实包裹在材料中, 且载药后发生了红移, 推测为有机物对材料结构产生了影响, 紫外光谱的结果和红外表征是一致的

.

图8载药与未载药的SLM法合成的HA的紫外光谱检测图

(a)未载药的HA; (b)载药HA

Figure8UV spectrums of different HA prepared by SLM

(a) pure HA, (b) HA wrapped podophyllotoxin

2.2.2 载药量和载药效率

确定HA可以载入鬼臼毒素后, 进一步计算材料的载药量和包封率. 反应前, 在内相Na2HPO4溶液一侧加入相当于HA理论产量的10%的鬼臼毒素, 使材料在形成过程中慢慢将鬼臼毒素包裹其中. 反应完成后, 用丙酮和无水乙醇将剩余鬼臼毒素洗脱出来, 分别用紫外及HPLC两种方法对HA负载的鬼臼毒素进行定量分析. 二者结果基本一致, 平均载药量为12.9%, 包封率为65.5%.

3 结语

本文的实验结论不仅为设计和制备新的介孔纳米结构HA生物功能材料提供了一种简单有效的思路, 赋予了材料新的性能与特点, 而且在形貌控制方面, 为以

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后研究有相似特性的物质提供了一种参考. 在后续的实验研究中, 将根据合成出材料的特点研究材料的溶解性, 通过体外实验测定材料的缓释性, 并继续细胞实验, 使材料能很好地应用于生物医药等方面. 同时也可推及类似无机晶体的纳米结构及形貌控制, 其生物学效应的分析结果为纳米超结构HA的临床应用以及进一步仿生工程材料的研究提供理论及实践上的依据. 随着研究的深入, 其介孔分子筛的特性在大分子吸附、催化反应、药物存储、运输等方面会有更大的发展. 可以预见, 随着介孔材料研究的深入, 它的应用范围将更加广泛, 随着纳米技术的发展, 介孔纳米材料将成为今后一种极具应用潜力的新材料.

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