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生物技术制药复习题

第一章绪论

第一节生物技术的发展史

1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。基因工程是生物技术的核心。P1

2、蛋白质工程----第二代基因工程；海洋生物技术-----第三代生物技术P1

3、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P3

1974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术

1975年，Koher 和Milstein 建立了单克隆抗体技术

1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市

1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市

2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。

第二节生物技术药物

1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。P4

2、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。

3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。

4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊断药物。

5、生物技术药物的特征：

（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。

第三节生物技术制药

1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。P5

2、生物技术在制药中的应用有哪些？P7

（1）基因工程制药：① 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体④基因诊断与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物⑦改进药物生产工艺⑧利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。

（2）细胞工程制药①单克隆抗体技术②动物细胞培养③植物细胞培养生产次级代谢产物。（3）酶工程制药：酶与细胞的固定化及酶转化制药

（4）发酵工程制药：发酵工艺改进、新药研制、菌种改造。

第二章基因工程制药

第一节概述（略）

第二节基因工程药物的生产过程P15

1、基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

2、基因工程药物制造的主要程序（过程）（重点和后面几节联系起来）

（1）目的基因的克隆（分离目的基因）：通过逆转录、反转录-聚合酶链式反应、化学合成方法来制备cDNA，再通过核酸探针杂交或免疫反应来筛选目的基因（2）目的基因与载体连接构建DNA重组体：通过限制性内切酶DNA连接酶等核酸酶，把目的基因组入载体的相关克隆位点，常用的载体有质粒载体和噬菌体载体（3）将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌：常用的宿主菌有大肠杆菌、酵母菌等，先使宿主菌处于感受态，再通过转化、转导等方式把重组DNA导入宿主菌，以构建工程菌（4）工程菌发酵：提供适当的培养基、反应器、控制好发酵过程中的各种参数，如温度、PH、溶氧等，并通过升温来诱导产物表达（5）目的基因表达产物的分离纯化：通过固液分离、初步纯化、高度纯化、成品加工来制备产品；若是胞内产物需要细胞破碎，若是包涵体则需要变性和复性（6）产品的检验：检测产品的质量和性能。

第三节目的基因的获得

1、利用基因工程生产蛋白质或多肽需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？P16（1）逆转录法

以mRNA为模板，经逆转录的到cDNA，构建cDNA文库，从cDNA文库中筛选目的基因。由于RNA 转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文库中无内含子，适于在原核系统中表达。但是，cDNA只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列，因此在原核系统中表达，还需要根据表达载体的结构，配以相应的调控序列。

（2）利用反转录-聚合酶链式反应制备基因

（3）化学合成法：只适用于克隆小分子肽的基因

2、利用逆转录法获得目的基因的基本过程P16

（1）mRNA的纯化：从表达目的基因的细胞中提取总RNA，用寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从总RNA中提取纯化mRNA。

（2）cDNA的合成：以mRNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA第一链，再用DNA聚合酶合成cDNA 的双链。

（3）cDNA克隆：利用合适的连接方法，将产生的双链cDNA片段插入到合适的载体中。

（4）构建cDNA文库：将cDNA与载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为cDNA 文库。

（5）从cDNA文库中筛选目的基因：得到cDNA文库后，通常采用核酸探针杂交法和免疫反应鉴定法从数以万计的DNA片段中筛选出目的基因。

3、载体分为：表达型载体和非表达型载体。P17

第四节基因表达

1、基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。P20

2、基因高效表达研究：指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。P20

3、基因表达的微生物宿主细胞分为两大类：P21

第一类为原核细胞（常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）；

⑴大肠杆菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系）：表达基因产物形式多样，大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N 端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。

⑵枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。

⑶链霉菌：作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。第二类为真核细胞（常用的真核微生物有酵母、丝状真菌等）

⑴酵母：酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达

⑵丝状真菌：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。

4、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。P22

5、大肠杆菌基因表达载体P23

（1）pBV220系统

pBV220系统国内使用最多的载体,其组成：①来源于pUC8多克隆位点；②核糖体rrnB基因终止信号；③pBR322第4225～3735位；④pUC18第2066～680位；⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子；⑥pRC23的PL启动子及SD序列

（2）pET系统

6、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素P22

外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：

（1）外源基因的剂量：一般来说细菌内基因拷贝数增加，基因的表达产物也增加。

（2）外源基因的表达效率

① 启动子的强弱：启动子是在转录水平上影响基因表达的因素。需要寻找强的启动子。

② 核糖体结合位点的有效性：大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达是十分重要的。

③ SD 序列和起始密码ATG的间距：表达非融合蛋白的关键是原核SD序列和真核起始密码ATG 之间的距离，距离过长过短都影响真核基因的表达。

④ 密码子组成：应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。

（3）表达产物的稳定性：

（4）细胞的代谢负荷：必须使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达出外源基因产物。（5）工程菌的培养条件

外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须进行优化。

7、真核基因在大肠杆菌中的表达形式P26

⑴以融合蛋白的形式表达药物基因

以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。

优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；

缺点：只能作抗原用。

⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因

非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。

优点：保持原有蛋白活性；

缺点：易被蛋白酶破坏。

⑶分泌型表达药物基因（外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游）

优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；

缺点：产量不高，信号肽不被切割。

8、载体相关定义

载体：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。

克隆载体：从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为载体，在其上插入合适大小的外源DNA片段，将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。

表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，是目的基

因能够表达的载体。

穿梭载体：指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体（例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体）。

9、载体的复制系列可分四类：P27

（1）Yep类（酵母附加体质粒）（2）YRp类（酵母复制型质粒）

（3）YCp类（酵母着丝粒质粒）（4）YIp类（酵母整合型质粒）

10、影响目的基因在酵母菌中表达的因素

⑴外源基因的拷贝数

⑵外源基因的表达效率：①启动子②分泌信号的效率③终止序列的影响

⑶外源蛋白的糖基化

⑷宿主菌株的影响：①菌体生长力强②菌体内源蛋白酶要较弱③菌体性能稳定④分泌能力强

11、精确表达载体P28

酵母载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。

精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸的克隆载体。

第五节基因工程菌生长代谢的特点

1、碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用；P31

第六节基因工程菌的不稳定性

1、质粒不稳定分为那两类？P32

工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌在分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象。与含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌比数率差异的大小有关

质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

基

2、提高质粒稳定性的方法P33

（1）选择合适的宿主菌：遗传稳定（2）选择合适的载体：高拷贝数；（3）选择压力：如加抗生素提高稳定性；（4）分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达（5）控制培养条件（6）固定化

第八节重组工程菌的培养

1、基因工程菌的培养方式P36

（1）分批培养

（2）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。

（3）连续培养

（4）透析培养

（5）固定化培养

2、基因工程菌的培养工艺P37

（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶氧量的影响（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序的影响：一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。

（7） pH的影响：生长pH在6.8～7.4左右，后期外源蛋白的表达其最佳pH为6.0～6.5。

第九节高密度发酵

1、什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法实现高密度发酵？P41 （1）高密度发酵：一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。

（2）影响高密度发酵的因素：培养基；溶氧浓度；pH；温度；代谢副产物

（3）实现高密度发酵的方法P43

①发酵条件的改进

a.培养基的选择（普遍采用6g/L的甘油为碳源）；

b.建立流加式培养的方式；

c.提高供氧能力

②构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌

a.阻断乙酸产生的主要途径；

b.对碳代谢流进行分流；

c.限制进入糖酵解途径的碳代谢流；

d.引入血红蛋白基因

③构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

第十节基因工程药物的分离纯化

1、表达的产物都是多肽或蛋白质，它的制得具有以下特点：P46

（1）表达产物在初始料中含量较低；（2）含有大量细胞及代谢产物；（3）表达产物稳定性差，易失活变性；（4）表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；（5）对其质量要求纯度高、无菌、无热原。

2、分离纯化的基本过程

若是论述题最好对过程进行一定的介绍

3、建立分离纯化工艺的根据P46

（1）含目的产物的起始料的特点

基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养基的来源及其质量。③生产工艺及条件。

（2）物料中杂质的种类和性质。

（3）目的产物特性。

（4）产品质量的要求

4、细胞破碎与固液分离

⑴细胞收集：离心法、膜分离法。

⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法；物理法、化学法、生物法

⑶固液分离：离心、膜过滤、双水相萃取

5、细胞破碎的方法；P47

（1）物理方法：匀浆法、珠磨法、超声波法

（2）化学法：渗透冲击法（高渗+低渗）、增溶法（表面活性剂等）

（3）生物法：酶溶法

6、分离纯化常用的色谱分离方法有那些？P50

分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。

（1）离子交换层析P51

离子交换介质由三部分构成：（1）不溶性高分子聚合物—载体；（2）共价键结合于载体上---活性基团或功能集团（3）与活性基团带相反电荷---平衡离子或反离子（决定是阴离子交换树脂还是阳离子交换树脂）如：酸性阳离子交换树脂R-SO3H

蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响离子交换的性能。

它由平衡、上样、洗脱（分为梯度洗脱和阶段洗脱2种）、再生4个主要步骤构成。

（2）疏水层析P54

利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。流动相为pH6～8盐水溶液。常用的介质是多聚糖（如琼脂糖）和硅胶。

（3）亲和层析P4756

亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。洗脱时分为特异性洗脱和非特异性洗脱。

（4）凝胶过滤层析P59

凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，大分子量物质先流出，小分子物质后流出。利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。

7、用于分离纯化的技术应满足那些要求？P62

(1)技术条件温和，能保持目的产物的生物活性。

(2)选择性好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数。

(3)收率要高。

(4)两个技术之间不需要对物料加以处理或调整，这样可以减少工艺步骤。

(5)整个分离纯化过程要快速，能够满足高生产率的要求。

第十一节变性蛋白的复性

1、外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成P63

2、包涵体：指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

3、包涵体的分离和溶解P63

（1）包涵体的分离：重组菌破碎后，离心得沉淀部分，再用低浓度变性剂（脲或盐酸胍）、去垢剂（Triton X-100）、脱氧胆酸钠洗涤。

（2）包涵体溶解：般用强的变性剂如脲（6-8M）、盐酸胍（6M），或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，溶解涵体蛋白质。

（3）包涵体复性：稀释复性和透析复性；含二硫键的蛋白的复性；封闭蛋白的疏水蔟促进复性；凝胶过滤层析复性；小分子添加剂促进的复性；分子伴侣或折叠酶促进的复性；人工分子伴侣的复性

第十二节基因工程药物的质量控制

1、由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时，常作那些项目分析？P68

（1）肽图分析

肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质后，对生成的肽段进行的分离分析。它是一种可检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，该技术灵敏高效的特点使其成为对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。

（2）氨基酸成分分析

在氨基酸成分分析中，一般含50个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析是接近理论值的，即与序列分析结果一致。

（3）部分氨基酸序列分析

部分氨基酸序列分析（N端15个氨基酸）可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。

（4）重组蛋白质的浓度测定和分子量测定

蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白质分子量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS-PAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质分子量，而SDS-PAGE法测定的是蛋白质亚基的分子量。

（5）蛋白质二硫键分析

二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，基因工程药物产品的硫-硫键是否正确配对是一个重要问题。

第三章动物细胞制药

第一节概述

细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。P79

第二节动物细胞的形态和生理特点（重点）

1、离体培养的动物细胞分为那些类型？P81

动物细胞适应功能,形态各异。离体培养细胞分两类：贴壁细胞；悬浮细胞

（1）贴壁细胞

生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型和上皮细胞型

（2）悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。

（3）兼性贴壁细胞：生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。

2、什么是接触抑制现象？P84

当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，

细胞就停止增殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再

增加，所以该现象又称之谓接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现

象随之消失，细胞可多层生长。细胞密度也就可大大增加。

3、动物细胞的生理特点P83

（1）细胞的分裂周期长

动物细胞分裂所需的时间一般为12～48h，它不仅随细胞种属的不同而不同，就是同一种属的，不同部位的细胞其所需的时间也不同。周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）

（2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象

(3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的

(4)动物细胞对周围环境十分敏感。动物细胞对各种物理化学因素，如渗透压，pH，离子浓度，剪切力，微量元素等的变化耐受力很弱。

(5)动物细胞对培养基的要求高

氨基酸、维生素，多种无机盐和微量元素，细胞生长因子、贴壁因子。

(6)动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同

动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖

体上进行。（游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。）

3、动物细胞作为宿主细胞生产药物的特点；P85

（1）优点：产品多分泌在胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此与天然产品更一致，适于临床

（2）缺点：培养条件要求高，成本贵，产量低

第三节生产用动物细胞的要求和获得

1、生产用动物细胞的种类及其特点P86

用于生产的动物细胞有三类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、以及可无限期传代

的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。

(1)原代细胞

原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过分碎，消化而获得的细胞悬液。用得最多的是鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，以及血液的淋巴细胞。

(2)二倍体细胞系

原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选，并纯化出某种具有一定特征的细胞株。该细胞株仍具备“正常”细胞的特点，一般均从动物的胚胎组织中获取。

(3)转化细胞

这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了“正常”细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要。

(4)其他：融合细胞系（物理法如高压电场和化学法如仙台病毒、聚乙二醇）和重组工程细胞系2、真核细胞基因表达载体的构建，使用的载体有两类：（1）病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒；（2）质粒载体：穿梭质粒载体P88

3、重组DNA导入动物细胞的常用方法：融合法、化学法、物理法、病毒法，最常用磷酸钙沉淀法、电穿孔法P89

4、生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（MCB）、生产用细胞库（MWCB）或工作细胞库（WCB）P91

第四节动物细胞的培养条件和培养基

1、动物细胞的培养条件P92

(1)器材的清洗和消毒

①器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、冲洗②器材的消毒灭菌: 物理消毒/化学消毒

(2)水质 :电阻值大于18MΩ,去热原。

(3) pH:7.2～7.4

(4)渗透压:290～300mOsm/kg

(5)温度:哺乳动物37±0.5 C；

(6)空气:氧的饱和质60%,氧分压 4～0.7kPa

2、培养动物细胞的培养基的种类和组成P95

动物细胞培养基大致可以分成三类：天然培养基，合成培养基和无血清培养基。

（1）天然培养基：血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定

（2）合成培养基：成分明确、大量供应，DME、MEM、DMEM等（第一个合成培养基是199培养基；

①氨基酸：12种必需氨基酸+谷氨酰胺②维生素：形成辅基和辅酶③糖类：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺④无机盐：维持渗透压⑤其它成分：核酸前体和氧化还原剂如谷胱甘肽⑥添加5%～10%小牛血清：作用是提供生长因子和激素；提供贴附因子和伸展因子；提供结合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素

（3）无血清培养基：

无血清培基的优点如下：① 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批间差异的影响。② 减少了由血清带来病毒、霉菌和支原体等微生物污染的危险。③ 供应充足，稳定。④ 细胞产品易于纯化。⑤ 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。⑥ 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。（简答题时候可以不写优点）

无血清培养基加入添加剂：生长因子和激素（胰岛素）；结合蛋白（鉄传递蛋白和白蛋白）；贴附因子和伸展因子（胶原等）；有利细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽）

第五节动物细胞培养的基本方法

1、细胞传代；P101

原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。

传代方法：

（1）悬浮细胞：加生长液，然后分种

（2）贴壁生长细胞传代：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

第六节动物细胞大量培养方法和操作方式

1、动物细胞大规模培养的方法P103

（1）悬浮培养

悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，不但细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。

（目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。）2．贴壁培养

贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上，细胞才能生长繁殖的培养方法。较容易采用灌流

培养的方式使细胞达到高密度。但操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。

3．贴壁—悬浮培养

① 微载体培养：可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内。

② 包埋和微囊培养：包埋和微囊培养培养细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；可采用多种生物反应器进行大规模培养。

（目前最普遍的是琼脂糖和海藻酸钙凝胶）

③ 结团培养：结团培养的实质是用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养，所以它也是一种贴附—悬浮培养。该培养方法操作简便，节省了微载体的成本。

2、动物细胞培养的操作方式；P106

动物细胞培养的操作方式一般可分为分批式、加料—分批或流加式、半连续式、连续式和灌流式。

（1）分批式操作（一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累。最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，往反应器

内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。）

（2）半连续式操作

（该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一

段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数

量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被

广泛采用。）

（3）灌流式操作

（该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将

部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操作不同处，在于取出部分

条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出部分细胞。）括号部分的内容重在理解

第七节动物细胞生物反应器

1、动物细胞生物反应器必需具备的基本要求；P107

（1）一切材料，对细胞必须无毒性。（2）具有良好的传质、传热和混合的性能。（3）密封性能良好（4）对多种物理化学参数能自动检测、调节和高精度控制（5）可长期连续运转（6）容器内面光滑，无死角（7）拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。设备成本尽可能低。

2、动物细胞生物反应器的类型及特点；P108

（1）搅拌罐式生物反应器（目前最广泛应用的动物细胞反应器）：靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性

（2）气升式生物反应器：其特点是结构简单，操作方便。

（3）固定床式生物反应器：结构简单、装填材料无毒且利于细胞贴壁，剪切力小的特点

（4）流化床式生物反应器：可连续操作

（5）袋式或膜式生物反应器：可取出某些有害代谢物

（6）中空纤维生物反应器：用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度高，如果控制系统不受污染，能长期运转。

3、反应器及检测；P114

（1）温度检测元件：电阻温度计；（2）PH：复合式参比电极

（3）溶氧：极普电极或电流式覆膜电极

第十节动物细胞制药的前景与展望

1、动物细胞制药有哪些新进展？P135

（1）改进表达载体，提高表达水平和产量：①采用更强的启动子和增强子②更好的利用扩增系统或寻找高表达位点③采用和改造更好的宿主细胞

（2）利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本：①采用代谢工程改造工程细胞②改进培养工艺，降低生产成本

（3）抑制细胞凋亡，延长培养周期

（4）采用糖基化工程，提高产品质量

（5）转基因动物的研究

（6）组织工程的研究

2、代谢工程：采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需求，减少某些代谢产物的产生和无害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。P137

第四章抗体制药

第一节概述P143

1、抗体：即Ig，指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。

2、1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（McAb）。

3、单克隆抗体：将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的特异性完全相同的高纯度抗体。

单克隆抗体有缺陷：分子量过大；鼠源性抗体；所以要改造：降低单克隆抗体的免疫源性和降低其相对分子量。P144

第二节单克隆抗体及其制备（重点）

1、克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。P148

2、什么是单克隆抗体？它是如何制备的？P144

（1）抗原与动物免疫

①制备高纯度抗原：抗原可以用化学合成，如精制地高辛。多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。

②用抗原免疫脾细胞的制备：有体内免疫法和体外免疫法。体内免疫就是将抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠产生免疫反应，B细胞迅速增殖；体外免疫小鼠脾细胞的悬浮液与抗原一起培养后，再分离脾细胞。

（2）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

①骨髓瘤细胞：和免疫动物同源，目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠（最常用）和 LOU 大鼠。

②脾细胞和骨髓瘤细胞融合：脾细胞（1×108）和骨髓瘤细胞（2×107）混合，在聚乙二醇诱导下融合2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。（常用PEG相对分子量4000，浓度为40-50%，二甲基亚砜增加融合率）

③选择性培养:选择培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾—瘤融合细胞可以生长，脾—脾、、瘤—瘤融合细胞死亡。（培养基中需要加入饲养细胞才能繁殖，常用饲养细胞是小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞等）

（3）筛选阳性克隆与克隆化

①筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。

②克隆化：有限稀释法（将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。）和软琼脂法（将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的）（4）杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定

杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。另外还检测抗体特异性、纯度、分子量等。

（5）单克隆抗体的大量制备

①体外培养法和体内诱生法，多采用后者

②体内诱生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接种杂交瘤细胞，取腹水，离心，取上清。

（6）单克隆抗体的纯化

依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。

体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：

①离心取上清，超滤，盐析。

②分离：凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化；阴离子交换层析IgG单抗纯化；亲和层析 IgG单抗纯化。

3、ELISA法：酶联免疫吸附试验，基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体( 聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。原理：酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也

不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。P147

第三节基因工程抗体及其制备

（即鼠源性单克隆抗体的改造）

1、基因工程抗体：过 PCR 技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床临床诊断、预防、治疗及基础理论研究等领域。P150

2、Ig分子结构P150

（1）由2条重链(简称H链)和2条轻链（简

称L链）组成"Y"字型结构分子，链与链之间

由一对或一对以上的二硫键互相连接

（2）Ig分子氨基酸端L链的1/2与H链的

1/4的氨基酸组成及顺序多变，构成可变区(简

称V区)，V区中某些特定位置构建抗体和抗

原特异结合的关键部位，称为互补决定区

（CDR）它赋于抗体以特异性。

（3）羧基端L链的1/2与H链的134的氨基

酸组成及顺序较恒定，构成恒定区(简称C区)，

它决定Ig分子的异种抗原性。

（4）L链有V L和C L连个功能区，H链有V H、

C H1、C H2、C H3四个功能区，V L和V H的CDR区共同构成一个抗原结合部位。

3、基因工程抗体及其特性和制备方法（P152图4-4）

（1）人鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区（V区）基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。人IgC-小鼠IgV

（2）改形抗体（CDR移植抗体）：用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。小鼠CDR替代人CDR

（3）Fab抗体：重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。（Fd：重链V区及C H1功能区）完整L链+重链V 区+C H1功能区

（4）Fv抗体：由V H和V L组成的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段；V H+V L

（5）单链抗体：即scFv，由V H和V L通过连接肽（接头）重组并表达而成的一种小分子抗体，其分子量为整个Ig分子的1/6具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。V H-多肽-V L

（6）单域抗体：只有V H或V L一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。其分子量仅为整个Ig分子的1/12。V H或V L

（7）最小识别单位：即MRU，只含有一个CDR多肽的抗体，也为超变区多肽。

第四节多功能抗体及其制备

1、双功能抗体：bisFvs，即双特异性单链抗体，（天然Ig是由两个完全相同的V H和V L区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位）经人工设计构建的双特异性抗体由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体。P155

2、多功能抗体：在scFv的基础上，可以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由此可制备成

多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。P157

3、抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。P158

第五节抗体工程

1、抗体工程：指利用重组DNA和蛋白质工程技术，对

抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体

细胞后，表达抗体分子，或用细胞融合、化学修饰等方

法改造抗体分子的工程。P159

现在普遍使用噬菌体作为抗体库技术的载体。

6．噬菌体抗体库技术基本方法（过程）P159

噬菌体抗体库技术：它是将体外克隆的抗体基因片段插

入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛

选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。

基本过程：噬菌体抗体库技术基本路线为用RT-PCR方

法扩增抗体全套可变区基因（V H+ V L），重组到噬菌体

载体中，并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，

把Fab段或ScFv表达到噬菌体表面。通过“吸附－洗脱

－扩增”的富集过程，从中筛选出特异性抗体的可变区基

因。（右图）

第六节抗体诊断试剂

一、三大类抗体诊断药物：血清学鉴定用抗体制剂、免

疫标记技术用抗体制剂、体内导向诊断药物。P161

二、抗体诊断药物有哪些类型？P161

1. 血清学鉴定用的抗体类试剂

（1）鉴定病原菌用的抗体试剂

（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂

（3）妊娠诊断试剂

（4）抗ABO血型系统血清

2、免疫标记技术用的抗体类试剂P164

给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。

（1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。（2）免疫酶抗体诊断试剂：酶标诊断试剂

a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂

b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂

c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂

d、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂

e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂

f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂

（3）放射免疫用抗体诊断试剂

把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。

常用的标记抗体试剂：

a、 HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度0.1 ng/ml

b、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度0.1 ng/ml

c、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记

d、 AFP放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度1~5 ng/ml

e、 CEA放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度1 ng/ml

3、导向诊断药物

由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未爱临床广泛应用。

三、CD单克隆抗体系列P169

应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一种白细胞分化抗原归称为CD（cluster of differentiation）。人CD的编号已从CD1命名至CD247，大致分为13组。

第七节抗体治疗药物

1、抗体治疗药物有哪些？P173

以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。

（1）放射性核素标记的抗体治疗药物

抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。

（2）抗癌药物偶联的抗体药物

①常用的抗癌药物

氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。

②抗体类药物逆转耐药性

（3）毒素偶联的抗体药物

在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。

① 第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。

② 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。

③第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。

（3）免疫毒素的临床应用

治疗肿瘤、自身免疫病，并能克复组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。

第五章植物细胞制药

第一节基本概念

1、植物细胞的全能性。P177

植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。

第二节植物细胞工程发展简史（略）

第三节植物细胞的形态及生理特性

1、植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成P181

2、细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有

3、植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的积累主要在稳定期（植物细胞培养时期：延迟期、加速期、对数期、稳定期四个时期）

4、植物培养细胞的生理特性;P183

（1）生长阶段特征

延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快

加速期：最大生长期，最大细胞浓度

对数期：细胞数呈对数增加

稳定期：细胞高液泡化，非常脆弱

（2）植物细胞与动物细胞、微生物细胞比较

第四节植物细胞培养的基本技术

1、植物材料的准备；P185

植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂是次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞。

2、植物细胞培养的培养基组成P186

（1）无机盐：

①大量元素：N, S, P, K, Mg, Ca, Cl, Na

②微量元素：Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni等

（2）碳源：糖类，肌醇等；也可直接通过光合作用吸收CO2

（3）植物生长调节物质P189

①生长素类:吲哚乙酸（IAA）、

②分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）

植物组织和细胞培养物的生长主要取决于生长素和分裂素的比例。高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂，而低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞生长。

（植物激素：指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（<1M）时即能调节植

物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素是目前已发现植物组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。）

（4）氮源：蛋白质水解产物或各种氨基酸。

（5）维生素：B族维生素、生物素、肌醇。

3、植物细胞大规模培养的方法及特点；P191

（1）大规模植物细胞悬浮培养

①成批培养法（分批）：最适于植物细胞培养的反应器是气升式反应器

将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式

②半连续培养：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养基进行家换。

③连续培养：利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜配演技以使细胞生长环境维持稳定。

（2）固定化培养

将细胞固定在固定化反应器上（内），放入新鲜培养基中进行培养，或连续流入新鲜培养基，进行连续培养及收集产物，因将细胞固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，易于细胞组织化，易于控制条件和获得较高含量次级代谢产物。

第五节影响植物次级代谢产物激积累的因素

1、影响植物次级代谢产物积累的因素有哪些？P192

（1）生物条件：外植体、季节、休眠、分化等

（2）物理条件：温度、光（强度、时间、光质）、通气、PH和渗透压

（3）化学条件：无机盐、碳源、生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等

（4）工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌、培养方法等

2、重要影响因素P193

（一）外植体选择：不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。（二）培养条件的影响

（1）内在因素

① 接种和诱导：次级代谢产物的产率与外肢体的大小、细胞密度与营养成分相关

② 培养基的基本组成：培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮培养细胞的物质基础，尤其是稳定期的次级代谢产物的积累。（磷、氮；铜是次级代谢产物积累的必要元素）

③ 碳源：糖是使用最广、作用最强的碳源，对次级代谢产物影响主要取决于使用的糖种类、糖浓度及其次级代谢产物的生物合成过程。

④ 植物生长调节剂：不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响次级代谢产物的产生。

⑤ O2和PH：植物细胞正常呼吸需要氧气，所以需要供氧；一般最利于培养植物细胞的PH在5~6

⑥ 渗出物：其它代谢产物也会影响产物产量

（2）外在因素

①温度:代谢产物产生最佳温度是20~28℃；② 搅拌频率：适宜③ 培养容器④光：光照时间、光质、强度都有影响

（三）两步法培养：第一步使用适合细胞生长的培养基（生长培养基），第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基（生产培养基）。P197

第六节植物细胞培养的生物反应器

1、植物细胞反应器的选择取决于：生产细胞的密度、通气量、提供的营养成分的分散程度。P199

2、植物细胞大规模培养的生物反应器P201

（1）机械搅拌式生物反应器：反应器内温度、PH、溶氧及营养物物浓度易控制。

（2）鼓泡塔生物反应器：没有运动部件，操作不易染菌，有较高的热量和质量传递，容易放大，但是流动形式难以确定，混合不均。

（3）气升式生物反应器：低剪切力，混合与氧传递效果好，运动部件不易染菌，操作费用低，但是高密度培养时候混合不够均匀。

（4）转鼓式生物反应器：比较适合高密度培养，但是难于大规模操作，放大困难。

（5）固定化细胞生物反应器：细胞可长时间重复使用，保护细胞免受剪切力，以实现高密度培养，有利于次级代谢产物合成，易于连续化操作。

第七节进展与展望

1、植物细胞培养有哪些新进展？P204

（1）诱导子在植物细胞工程中的应用：利用诱导子进行有目的次级代谢产物调控及生物合成。（诱导子：植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。诱导子有两种分类，一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子；另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。）（2）前提饲喂

（3）两相法培养：水相培养的基础上，加入固相或疏水相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌物的目的。

（4）转基因技术

（5）植物生物转化技术与生物制药：生物转化既可以生产新的化合物，又可以改造已有化合物、增加目标产物产量。

（生物转化：利用离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应）

第六章酶工程制药

第一节概述

1、酶工程：从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。P216

2、酶工程主要研究内容是什么？P216

（1）酶的分离、提纯、大批量生产及新酶的应用开发。（2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。（3）酶生产中基因工程的应用及遗传修饰酶的研究。（4）酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究（5）有机相中酶反应的研究。（6）酶的抑制剂、激活剂的开发和应用研究。（7）抗体酶、核酸酶的研究。（8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。

3、目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。P217

4、应用最广泛的产酶菌：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、曲霉（黑曲霉和黄曲霉）。P218

5、酶法检测可分为：单酶反应、多酶偶联反应、酶标免疫反应。P218

第二节酶和细胞固定化

1、固定化酶的特点和优点各是什么？P219

（1）固定化酶：限制或固定于特定空间位置的酶。

（2）固定化酶的特点：既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂特性。

（3）优点：①可多次使用；②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高；③反应条件易控制；④酶的利用效率高；⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。

缺点：①酶活力有损失②成本增加③只适应可溶性第五，且小分子底物④胞内酶需分离纯化⑤与完整菌相比不适宜多酶反应。

2、固定化细胞的特点和优缺点各是什么？P225

（1）固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法。

（2）特点：有细胞特性，既有生物催化剂功能，又有固相催化剂特点。

（3）优点：①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高；③比固定化酶稳定性高；④细胞内酶附助因子可再生；⑤细胞本身含多酶体系；⑥抗污染能力强

缺点：①副产物多②细胞的壁、膜和载体都存在扩散限制作用③载体的空隙大小影响高分子底物的通透性

3、酶和细胞的固定化方法P220

（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法

①物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体（如活性炭等）上的固定化方法。

②离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。

③共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。

（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。

常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。

（3）包埋法：

①网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。

②微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。（4）无载体法（选择性热变性法）：在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性，但酶不变性使酶固定于细胞内。此法只适用于细胞固定化。

4、固定化酶的性质（变化）P228

（1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。

（2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。

（3）酶学特性的变化

①底物专一性：对底物的专一性下降。②最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；③最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。④米氏常数(Km)：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。⑤最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。

6、固定化酶活力测定方法：分批测定法和连续测定法。P231

第三节固定化酶和固定化细胞的反应器

1、反应器的类型和特点P232

（1）间歇式搅拌罐反应器：用于游离酶反应后随即放料。

（2）连续流动搅拌罐反应器：连续进料、连续出料

（3）填充床反应器：固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。底物以恒定流速通过反应床。

（4）流化床反应器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。

（5）循环反应器：部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。

（6）连续流动搅拌罐-超滤膜反应器

（7）其它反应器

第四节酶的人工模拟

1、人工模拟酶：根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的均有酶性质的催化剂。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上相对天然酶简单。P235

2、主-客体化学和超分子化学是酶人工模拟的重要理论基础。P236

3、模拟酶的分类P236

（1）根据Kirby分类法：单纯酶模型、机理酶模型、单纯合成的酶样化合物

（2）主-客体酶模型：主-客体酶（环糊精CD）、胶束酶模型、肽酶、、分子印迹酶模型、半合成酶

4、何谓分子印迹？分子印迹的应用范围有哪些？P238

分子印迹：指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子称为印迹分子或模板。分子印迹的应用范围有：① 分子印迹聚合物可作为裁剪分离物质的材料，如手性药物的分离，也可以分离大分子物质。② 在酶技术和有机合成中，分子印迹聚合物可作为模拟抗体，模拟酶或具有催化活性的聚合物。③ 分子印迹聚合物还可在生物传感器的构建中作为传感器，这种聚合物可作为通常使用的生物材料的替代物。

第五节酶的化学修饰

1、为什么要对酶进行化学修饰? P242

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。但是，酶是蛋白质，存在其异体蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和抑制剂作用、在体内半衰期短等缺点，严重影响使用效果。工业用酶常常由于酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物和抑制剂的抑制，工业反应要求的pH和温度不总在酶反应的最适pH和最适温度范围内，底物不溶于水或酶的Km值过高等弱点，限制了酶制剂的应用范围。酶的化学修饰就是对酶在分子水平上用化学方法进行改造，从而提高酶的稳定性、解除酶的抗原性、改变酶学性质、扩大酶的应用范围。

2、酶化学修饰：通过化学方法对酶分子的主链进行切割、剪接和侧链基团的化学修饰改造，以改变其理化性质和生物活性。P242

3、化学修饰的目的：人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。①提高生物活性②增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性③针对异体反应，降低生物识别能力。

4、酶化学修饰的方法P243

（1）酶的表面化学修饰

①大分子修饰：可溶性大分子，如PEG、葡聚糖等通过共价键连接（其中分子量500-20000的PEG 使用最广）；②小分子修饰：小分子对其活性部位或侧链基团修饰，如氨基葡萄糖等；③交联修饰：双功能试剂如戊二醛等将酶分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部位进行共价交联；④固定化修饰：酶共价连接惰性载体

（2）酶分子内部修饰

①非催化活性基团修饰：改变酶对特殊底物的束缚能力；②蛋白主链修饰；③催化活性基团修饰；

④与辅助因子有关的修饰⑤肽链延伸后修饰

（3）结合定点突变的化学修饰：得到新的酶制剂

5、修饰酶的特性；P244

⑴热稳定性提高；⑵抗各类失活因子能力提高；⑶抗原性消除；⑷体内半衰期延长；⑸最适改变；

⑹酶学性质变化：Km会增大，专一性改变等；⑺对组织分布能力改变

第六节酶工程研究的进展

（有机相酶反应、核酶和脱氧核酶、抗体酶）

1、有机相酶反应的定义及其优点是什么？P247

（1）有机相酶反应是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。

（2）有机相酶反应的优点：① 增加疏水性底物或产物的溶解度；② 热力学平衡向合成方向移

动，如酯合成、肽合成等；③ 可抑制有水参与的副反应；④ 酶不溶于有机介质，易于回收再利用；⑤ 容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；⑥ 酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大；⑦ 无微生物污染；⑧ 能测定某些在水介质中不能测定的常数；⑨ 固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。

2、有机相酶反应的溶剂体系各是什么？如何选择溶剂体系和有机溶剂的种类？P248

按照溶剂体系的组成和特点，目前有机相酶反应主要有4种溶剂体系。

（1）水—水溶性溶剂均相体系：由水和水溶性有机溶剂相互溶解而形成的均一体系。

（2）水—水不溶性溶剂两相体系：有机溶剂在水中的溶解度尽可能小。在该体系中，要求底物在水和有机溶剂中的溶解度尽可能大，而产物在水中的溶解度要小。

（3）反相胶团体系：由两性化合物在占优势的有机相中形成的一系列包围水滴的体系。

（4）单相有机溶剂体系：在该体系中，不存在单独的水相，只含极微量的水，即在酶分子周围存在着一层水分子膜，以维持催化反应所必需的构象。

选择溶剂体系和有机溶剂的种类要根据酶的性质、底物和产物的溶解度及反应器的型式

等具体情况而定。

3、核酶：（1）剪切性核酶：锤头型核酶、发夹型、丁型肝炎病毒（HDV）核酶、蛋白质-RNA复合酶（RNaseP）（2）剪接型核酶：Ⅰ内含子、Ⅱ内含子；P250

4、抗体酶：一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。P252

第七章发酵工程制药

第一节概述

1、发酵工程：微生物工程，利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术。P259

2、发酵工程发展4个阶段：发酵工程发展4个阶段：（1）20世纪前，传统发酵（酒、醋等）（2）1900-1940，揭示发酵本质-微生物引起，诞生许多新的发酵产品（甘油、丙酮等），纯培养技术；（3）发酵大发展，青霉素工业推动发酵，深层培养技术；主要标志有：抗生素、氨基酸、核酸、甾体的微生物转化（4）基因工程应用于发酵；P260

3、发酵工程内容：菌种培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。P261

4、发酵工业的生产水平取决于三要素：生产菌种、发酵工艺、发酵设备。P261

第二节优良菌种的选育

自然菌种有时不能满足生产需求，要想得到性能更优良的高产菌种，就必须选育突变株。

1、菌种选育；P261

菌种选育包括：自然选育、诱变育种、杂交育种等经验育种方法，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程等定向育种方法。

2、诱变机制；P262

诱变会使生物遗传物质DNA发生变化：

转换：嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶之间置换碱基置换（点突变）

微小损伤突变颠换：嘌呤与嘧啶之间置换，少见

突变码组移动突变（移码突变）:碱基缺失或增加非3地倍数染色体畸变:染色体遗传物质发生易位、倒位、缺失、重复

染色体组突变：染色体数目改变

生物技术制药考试题库

选择 ABC分子印迹可以应用于下列哪些方面：模拟抗体，生物传感器的构建，手性药物的分离，新药的构建 ABD酶促反应的特点包括：催化效率高，酶的催化活性不受调节和控制，专一性强，反应条件温和 ABCD体细胞基因治疗常用的靶细胞主要有：造血干细胞成纤维细胞肌细胞、肾细胞肝细胞、淋巴组织 B世界上第一个基因工程药物是：人白细胞干扰素INFa 重组人胰岛素人鼠源性单克隆抗体尿激酶 C下列不属于脂类药物的是：胆酸固醇灵芝大豆异黄酮 C下列能够产生抗体的细胞是：肝细胞，巨噬细胞，浆细胞，血红细胞 ABCD下列属于细胞代谢过程中的生理活性物质的是：维生素，植物激素，抗生素，生物碱 C下列属于细胞工程内容的是：染色体改造的理论和技术，酶改造的理论和技术，细胞融合的理论和技术，有关产物提取纯化的理论和技术 ABD工业上下列哪些是使用大肠杆菌生产的：谷氨酸脱羧酶，天门冬氨酸酶，丙酮酸脱羧酶，青霉素酰化酶 D被称为药剂学鼻祖的是：张仲景，希波克拉底，华佗，格林 AB造血生长因子的作用是：促进骨髓造血细胞分化，促进骨髓造血细胞增殖和定向成熟，动员祖细胞从骨髓移动到外周血，促进血液生产和血液循环 D下列不属于按分子大小分离的方法是：有超滤法，凝胶过滤法，超速离心法，沉淀法 ABCD下列可以作为生物药物的是：氨基酸及其衍生物，酶与辅酶，糖类，细胞生长因子 D基因工程中，载体的本质是：DNA，RNA ，蛋白质，DNA或RNA ABCD能够用作蛋白质药品冷冻干燥保护剂的是：糖类/多元醇，表面活性剂，氨基酸、盐和胺，聚合物 ABC才才下列属于酶反应器的是：鼓泡塔反应器，填充床反应器，流化床反应器，淤浆反应器

生物技术制药试题及重点

第一章绪论填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释（2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。（3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强，疗效高，不足之处是稳定性差，分离纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在以下几个方面：（1）基因工程制药，利用基因工程技术可生产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基因技术的发展，应用前景会更广阔。（2）细胞工程和酶工程制药该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满足人类健康方面的需求。（3）发酵工程制药发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。第二章基因工程制药填空题 1. 基因工程药物制造的主要步骤是：目的基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检验。 1. 生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。 3. 生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。简答题 1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。代表产品如酒、醋、乙醇，乳酸，柠檬酸等。

生物技术制药问答题.doc

三、问答题（共计50分） 1．基因工程菌的遗传不稳定性的两种主要表现形式是什么？基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？（10分）基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式： 1．结构不稳定性：重组DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失2．分配不稳定性：整个重组DNA 分子从受体细胞中逃逸。基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 1．受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA 分子的降解2．外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢3．重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因4．受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 2．在人胰岛素AB链分别表达法中，为何将AB链编码序列与b-半乳糖苷酶基因融合？小分子蛋白在大肠杆菌中表达后不稳定，容易被细胞内蛋白酶降解失活。表达融合蛋白的优点是基因操作简便；在菌体内比较稳定，不易被细菌酶类所降解，容易实现高效表达。人胰岛素AB链分别表达法中，将A、B链编码序列与b-半乳糖苷酶基因融合，分别表达出融合蛋白，使表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水解酶分解，提高其稳定性及表达率。 3．动物细胞大规模培养的方法有哪些？各自的特点是什么？（10分） 1．悬浮培养悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养（perfusion culture )，因此细胞密度一般较低。2．贴壁培养贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。3．贴壁—悬浮培养微载体培养既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足了绝大多数细胞的基本要求，又由于载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。 4. 阐述基因工程药物研制有那些主要过程（10分）基因工程药物的生产必须首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。目的基因获得后，最重要的就是使目的基因表达。基因的表达系统有原核生物系统和真核生物化的难易。将目的基因与表达载体重组，转入合适表达系统，获得稳定高效表达的基因工程菌（细胞）。建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。5．阐述鼠源性单克隆抗体改造后的小分子抗体类型（10分）（1）人－鼠嵌合抗体将鼠MAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的排斥反应。（2）改形抗体在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR替换成人的FR，保留与抗原结合的CDR部位（3）Fab抗体Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG 的1/3。（4）单链抗体单链抗体(Single chain Fv，scFv)是由一段弹性连接肽(Linker)把抗体可变区重链(VH)与轻链(VL)相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。（5）单域抗体只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12。（6）分子识别单位只含有一个CDR多肽的抗体。 6动物细胞的生理特点？答：1 细胞分裂周期长（动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。）。2 细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象。3 二倍体细胞寿命有限（异倍体细胞系寿命长）。4 对生长环境要求敏感。5 培养基要求高。6 合成的蛋白质有修饰。 7动物细胞培养时加入血清的作用机制？答：提供基本营养物质；提供激素和各种生长因子；提供贴附因子和伸展因子；对培养中的细胞起到某些保护作用；

生物技术制药复习资料

第二章生物药物概论一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。（2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。（3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。分类：按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法：冷冻法，-40℃；②有机溶剂脱水法；③防腐剂保鲜，多用于液体）。 2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数，注意温度、变性剂等因素）。 3、生物药物的分离纯化：（1）蛋白质类药物的分离纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。2、不破坏活性成分。 3、利于后续预处理。 4、对环境影响较小，有利于回收和处理。 5、对设备要求不高。 6、成本较低。 7、最好对人体无害。第三章基因工程制药一、基因工程制药的主要工艺过程。获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装二、什么是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。获取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；⑸逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到一定数量。

(完整版)生物技术制药考试题复习

一：选择题 1、酶的主要来源是( C) A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/ 植物细胞与组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指(A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素( EPO)基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：( E) A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用 B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定 C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：( D) A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达 C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达 D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和(安全性鉴定)。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A. 糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇( PEG)诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高B、PEG的浓度高，促进融合率高C、PEG 的相对分子量小，促进融合率高D、PEG的最佳相对分子量为 4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D 、表达产物为天然产物 13、人类第一个基因工程药物是：(A) A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗 14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C) A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C 、鼠源性单克隆抗体D、单域抗体 15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)

生物技术制药要点

生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记：年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：

2018年生物技术制药习题及答案

2018年生物技术制药习题及答案一、选择填空题 1. 酶的主要来源是什么? 微生物生产。 2. 第三代生物技术是什么? 基因组时代。 3. 基因治疗最常用的载体是什么? 质粒载体和λ噬菌体载体。 4. 促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么? 因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化, 人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。 5. 菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸?

菌体生长所需能量 (大于) 菌体有氧代谢所能提供的能量时, 菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 6.cDNA 第一链所合成所需的引物是什么? cDNA 第一条链合成所需引物为 PolyT 。 7. 基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么? 表达产物的功能。 8. 为了减轻工程菌代谢负荷,提高外源基因表达水平可采取什么措施? 将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。 9. 根据中国生物制品规定要求,疫苗出厂需要经过哪些检验? 理化检定、安全检定、效力检定。 10. 基因工程药物化学本质是什么? 蛋白质。

11.PEG 诱导细胞融合? PEG 可能与可能与临近膜的水分相结合, 使细胞之间只有微笑空间的水分被 PEG 取代, 从而降低了细胞表面的极性,导致双脂层的不稳定,使细胞膜发生融合。 12. 以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物,产物位置是什么? 胞内、周质、胞外。 13. 人类第一个基因工程药物是什么? 重组胰岛素。 14. 动物细胞培养的条件是什么? 温度 :哺乳类 37昆虫 25~28, ph7.2~7.4,通氧量:使 co2培养箱,不同动物比例不同。防止污染, 基本营养物质:三大营养物质维生素, 激素, 促细胞生长因子, 渗透压:大多数 260~320。 15. 不属于加工改造抗体的是什么? 单域抗体。 16. 第三代抗体是什么?

生物技术制药考试题复习

生物技术制药考试题复习 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】

一：选择题 1、酶的主要来源是（C） A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植物细胞与组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指 (A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：（E） A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用? B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定? C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒? B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：（D） A、Poly?A B、PolyC C、PolyG D、PolyT E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达? C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达? D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易? 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内

生物技术制药及名词解释

生物技术制药第一章绪论药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科 ★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类 ?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片) ?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物 ?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性 ?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 ?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 ?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 ?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 ?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 ?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 ?酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ?1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量?影响限制性内切酶反应的因素： ?DNA样品的纯度： ?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 ?酶切反应的温度 ?DNA的分子结构 ?反应缓冲液组成 ?反应时间、反应体积等

生物技术制药习题修订稿

生物技术制药习题 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

第三章基因工程—工程技术一．填空 1、基因工程操作流程主要包括（）（）（）（）（）。 2、分离目的基因常采用（）从基因组DNA中扩增含目的具有的DNA片断，或者用分子杂交等方法从构建的（）或（）中获得含目的基因的克隆子。 3、克隆载体有（）和（）等，供不同实验要求选择使用。 4、在（）的作用下，含（）的DNA片断与（）连接成为重组 DNA 分子。二．判断 1、无论用哪种转化方法均可用PBR322作载体。（） 2、cDNA是以DNA为起始材料，经过复制得到的互补DNA。（） 3、只有粘性末端才可以被连接起来。（） 4、任何细胞都可用作受体细胞。（） 5、原核生物细胞是最理想的受体细胞。（） 6、Western杂交是DNA-RNA之间的杂交。（） 7、 DNA连接酶只能催化双链DNA片断互补黏性末端之间的连接。（）第四章细胞工程技术概论一．选择 1、植物体细胞杂交要先去除细胞壁的原因是（） A. 植物体细胞的结构组成中不包括细胞壁 B. 细胞壁使原生质体失去活力 C. 细胞壁阻碍了原生质体的融合? D. 细胞壁不是原生质的组成部分 2、动物细胞融合的说法不正确的是（） A. 细胞融合首先用酶解法（胰蛋白酶）分散成单个细胞 B. 细胞融合是个细胞识别过程

C. 融合细胞能表现出两个亲本的特点 D. 原生质体自然条件下常自发融合 3、单克隆抗体的生产方法中错误的是（） A. 发酵罐中培养 B. 小鼠的腹腔繁殖 C. 培养成组织移植到动物体内 D. 牛的体腔培养 4、不能人工诱导原生质体融合的方法是（） A. 高pH B. 电刺激 C. PEG（聚乙二醇）试剂 D. 重压 5、植物细胞融合常用的诱导剂是（） A. PEP B. PEG C. ATP D. 大肠杆菌质粒 6、目前有一种蔬菜新品种“白菜—甘蓝”,只是将两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并将其培养成新的植物体。这是利用了现代生物技术中的什么？ A.细胞工程 B.基因工程 C.蛋白质工程 D.酶工程二. 填空下图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答： (1)步骤?是_______________________，最常用的方法是_______________________。 (2)步骤?一般常用的化学试剂是_______________,目的是______________________。第六章发酵工程技术概论一．选择 1、发酵工程以培养微生物为主，所以又称为（）。 A．细胞工程B．微生物工程 C．细菌工程 2、发酵工程的主要内容包括（）。 A．生产菌种的选育B．发酵条件的优化与控制反应器的设计及产物的分离 C．提取与精制 D．以上都是 3、下列哪些是目前具有生产价值的发酵类型（）。 A．微生物菌体发酵 B．微生物菌体代谢产物发酵 C．微生物的转化发酵D．以上都是 4、下列哪些是发酵技术独有的特点（）。 A．多个反应不能在发酵设备中一次完成 B．条件温和、能耗少、设备简单 C．不容易产生高分子化合物D．发酵过程中不需要防止杂菌污染 5、发酵过程中，PH值取决于（）。 A．菌种B．培养基 C．培养条件D．以上都是 6、下列生产工艺属于固体发酵的是（）。 A．酿酒B．制酱C．天培（大豆发酵食品） D．以上都是 7、下列哪些是发酵的主要操作方式（）。 A．分批发酵B．连续发酵C．补料分批发酵D．全部都是 8、气升式发酵罐与搅拌式发酵罐相比，下列不属于前者特点的是（）。 A．发酵罐内没有搅拌装置，结构简单 B．发酵罐内有搅拌装置，混合速度快 C．耗能少，利于生产二、填空 1、根据搅拌的方式不同，好氧发酵设备又可分为（）、（）。 2、根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有（）、（）、（）。 3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向（），从自然选育转向（），从诱发基因突变转向（）。

生物技术制药考试题复习修订稿

生物技术制药考试题复习内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）

7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达? C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达? D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易? 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D、表达产物为天然产物? 13、人类第一个基因工程药物是：(A)

生物技术制药知识点总结(1)(DOC)

生物技术制药知识点纲要生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。第三代生物技术是海洋生物技术我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术 ⑺现代微生物发酵技术 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面： ①基因操作技术日新月异，不断完善。 ②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。 ③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。 ④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。 ⑤转基因植物和动物取得重大突破 ⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。 ⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向， ⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。

生物技术制药考试复习资料整理版

第一章、绪论 1. 生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，称为生物技术药物。 3. 生物药物：指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 4. 现代生物药物四大类型：⑴应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂； ⑵基因药物 ⑶来自动物、植物和微生物的天然药物； ⑷合成与部分合成的生物药物。 5. 生物药物功能用途分类：⑴治疗药物，⑵预防药物⑶诊断药物。 6. 生物技术制药的特征：⑴高技术⑵高投入⑶长周期⑷高风险⑸高收益 7. 生物技术在制药中的应用：⑴基因工程制药：①基因工程药物品种的开发、②基因工程疫苗、③基因工程抗体、④基因诊断与基因治疗、⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型、⑥应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物、⑦基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用、⑧利用转基因动、⑨植物生产蛋白质类药物 ⑵细胞工程制药：①单克隆抗体技术、②动物细胞培养 ⑶酶工程制药 ⑷发酵工程制药 8. 我国生物技术制药现状和发展前景（自己阐述观点）

第二章基因工程制药 1．基因工程生产哪些药：⑴免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。⑵细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。⑶激素，如胰岛素、生长激素、心钠素⑷酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2. 利用基因工程技术生产药品的优点在于： ⑴利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。 ⑵可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。 ⑶利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。 ⑷内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程读起进行改造。 ⑸利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 3. 上游阶段：是研究开发比不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。上游阶段的工作主要咋实验室内完成。 4. 下游阶段：是从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。下游阶段是将实验室成果产业化、商品化。 5. 制备基因工程药物的基本过程：获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装 6. 宿主菌应该满足以下要求：⑴具有高浓度、高产量、高产率；⑵能利用易得廉价原料； ⑶不致病、不产生内毒素；⑷发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑸容易进行代谢调控；⑹容易进行重组DNA技术；⑺产物容易提取纯化 7. 宿主细胞分为两大类：⑴原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；⑵真核细胞：酵母、丝状真菌 8. 表达载体必须具备以下条件（特点）： ⑴载体能够独立地复制 ⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应位于启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。 ⑷应具有阻遏子，使启动子收到控制，只有当诱导时候才能进行转录。 ⑸应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有反义的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。 ⒐密码子的偏爱性：在基因组中把使用频率高的同义密码子称为主密码子或偏爱密码子。此现象被称为密码子偏爱性 ⒑融合蛋白：由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，称为融合蛋白。 ⒒酵母的复制序列的几种不同载体：⑴YEp类（酵母附加体质粒） ⑵YRp类（酵母复制型质粒） ⑶YCp类(酵母着丝粒质粒) ⑷Yip类（酵母整合型质粒） ⒓基因工程菌的不稳定性：基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。

生物技术制药试卷A-答案

生物技术制药试卷A 一、名词解释：（本题共10小题，每小题5分，共计50分） 1、生物药物：是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 2、抗生素：由微生物产生，在低浓度下能杀灭和抑制病原体，但对宿主不会产生严重的副作用的物质，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。广义的抗生素还包括一些抗肿瘤药、杀虫剂和除草剂。 3、补料分批发酵：是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。 4、限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶。 5、载体：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 6、转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。 7、微载体培养：将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。 8、毛状根：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。 9、气升式反应器：没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小，主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养。 10. 酶固定化：指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。二、简答题（本题共5小题，每小题8分，共40分） 1. 简述生物药物新药的研发流程。

生物技术制药重点

生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。、 ②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。

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