脐带间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮免疫系统的影响

中国组织工程研究与临床康复
第 15 卷 第 19 期 2011–05–07 出版
May 7, 2011 Vol.15, No.19
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research
脐带间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮免疫系统的影响★
肖玉翠1，王吉波1，董 静 ，高 宏2，梁宏达1，王 丽2，辛苗苗1
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Umbilical cord mesenehymal stem cells transplantation for the immune system following systemic lupus erythematosus
Xiao Yu-cui1, Wang Ji-bo1, Dong Jing1, Gao Hong2, Liang Hong-da1, Wang Li2, Xin Miao-miao1
Abstract
BACKGROUND: Recently, many studies indicate that umbilical cord mesenehymal stem cells (UC-MSCs) have therapeutic effects on systemic lupus erythematosus (SLE). There are few reports, however, regarding the immunosuppressive effect and the organs of UC-MSCs on SLE . OBJECTIVE: To investigate the efficacy and influence of UC-MSCs transplantation on immune systems and different organs in the treatment of SLE. METHODS: MRL/lpr female mice were divided into 4 groups: control group, cyclophosphamide (CTX) group, CTX+UC-MSCs group, and UC-MSCs group. 24-hour proteinuria was assessed using Bradford method．Enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the levels of serum anti-dsDNA antibodies and interleukin-10 (IL-10), IL-17, interferon gamma (IFN-γ), PDGF. The histopathology changes of the kidney were observed using hematoxylin-eosin staining, and the UC-MSCs surface marks CD105 and CD44 in the kidney, lung and spleen were observed. RESULTS AND CONCLUSION: ①The levels of IL-10, IL-17 and IFN-γ in the CTX+UC-MSCs group was lower than those in the control group (P < 0.05). ②At 2 weeks, the 24-hour proteinuria in the CTX+UC-MSCs and UC-MSCs groups was lower than that in the CTX and control groups (P < 0.01). ③The serum level of anti ds-DNA antibodies in the CTX+UC-MSCs group was significantly decreased as compared with that in the control group. ④After UN-MSCs transplantation, glomerulosclerosis and inflammatory cells infiltrating degree relieved. ⑤At 32 weeks, the expression of CD105 and CD44 in the kidney, lung and spleen was negative. The results indicated that MSCs transplantation can reduce lupus activity of MRL/lpr mice significantly and have marked therapeutic effect for lupus nephritis. It can also inhibit immune system by reducing the levels of inflammatory factors. Xiao YC, Wang JB, Dong J, Gao H, Liang HD, Wang L, Xin MM. Umbilical cord mesenehymal stem cells transplantation for the immune system following systemic lupus erythematosus.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(19): 3489-3493. [https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,]
Department of Rheumatology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, 2 China; Stem Cell Research Center, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China Xiao Yu-cui★, Studying for master’s degree, Department of Rheumatology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China xiaoyucui1105@163. com Correspondence to: Wang Ji-bo, Doctor, Chief physician, Department of Rheumatology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China wangjibo2005@ https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, Correspondence to: Dong Jing, Doctor, Associate chief physician, Department of Rheumatology, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China dongjing218@yahoo. https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, Received: 2010-12-31 Accepted: 2011-02-19
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摘要
背景：目前有关脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮的免疫抑制作用及对各个脏器的影响报道较少。 目的：探讨脐带间充质干细胞治疗 MRL/lpr 狼疮鼠的疗效及对免疫系统和各个脏器的影响。 方法：MRL/lpr 狼疮小鼠随机分为对照组、环磷酰胺组、环磷酰胺+脐带间充质干细胞组、脐带间充质干细胞组。对照组给 以生理盐水， 其他各组分别给予相应的治疗。 采用考马斯亮蓝法检测 24 h 尿蛋白定量； 酶联免疫吸附法检测白细胞介素 10、 白细胞介素 17、干扰素 γ、PDGF、 抗 ds-DNA 抗体；间接免疫荧光法检测抗核抗体水平；常规病理苏木精-伊红染色观 察小鼠的肾脏病理改变肾脏病理改变；免疫组织化学法检测间充质干细胞表面标志 CD44、CD105 在肾脏、肺脏、脾脏中 的表达。 结果与结论：①环磷酰胺+脐带间充质干细胞组干扰素 γ、白细胞介素 17、白细胞介素 10 水平与对照组相比明显降低(P < 0.05)。②32 周时环磷酰胺+脐带间充质干细胞组和脐带间充质干细胞组尿蛋白定量低于环磷酰胺组和对照组(P < 0.01)。③ 32 周时环磷酰胺+脐带间充质干细胞组抗 ds-DNA 抗体水平与对照组相比明显降低。④脐带间充质干细胞组肾小球硬化及 炎性细胞浸润程度均较对照组为轻。⑤32 周时肾脏、肺脏、脾脏中间充质干细胞表面标志 CD44、CD105 表达为阴性。提 示，应用脐带间充质干细胞移植治疗 MRL/lpr 狼疮鼠可以显著降低狼疮活动指标，对狼疮肾炎具有治疗作用，同时可以通 过降低促炎因子的水平发挥免疫抑制作用。 关键词：脐带；间充质干细胞；细胞移植；红斑狼疮，系统性；小鼠，近交 MRL/lpr doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.19.016 肖玉翠，王吉波，董静，高宏，梁宏达，王丽，辛苗苗. 脐带间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮免疫系统的影响[J].中国 组织工程研究与临床康复，2011，15(19):3489-3493. [https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,]
经系统、肌肉骨骼及皮肤等[1]。尽管SLE的发病 0 引言 系 统 性 红 斑 狼 疮 (systemic lupus 机制尚未完全明确， 目前普遍认为狼疮患者的T、 B淋巴细胞的异常，从而导致各种细胞因子分泌 异常以及自身抗体的产生[2]。国内外研究表明细 胞因子干扰素γ、 白细胞介素10的异常在狼疮肾 炎的发病中起到重要作用 [3]，白细胞介素 17、 PDGF等促炎因子也是今年来的研究热点，而 白细胞介素 17、血小板源性生长因子 (platelet erythematosus ， SLE) 是一种复杂的自身免疫 性疾病，其发病机制通常认为由于自身抗体的 产生和免疫复合物的沉积从而导致全身多个靶 器官的破坏，常见肾脏、肺脏、血液系统、神
ISSN 1673-8225
CN 21-1539/R
CODEN: ZLKHAH
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肖玉翠，等. 脐带间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮免疫系统的影响
青岛大学医学院 附属医院，1 风湿 免疫科，2 干细胞 研究中心， 山东省 青岛市 266003 肖玉翠★，女， 1983 年生，山东 省日照市人，汉 族， 青岛大学医学 院在读硕士， 主要 从事脐带间充质 干细胞治疗系统 性红斑狼疮的研 究。 xiaoyucui1105@ https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, 通讯作者：王吉 波，博士，主任医 师， 青岛大学医学 院附属医院风湿 免疫科， 山东省青 岛市 266003 wangjibo2005@ https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, 并列通讯作者， 董 静女，博士，副主 任医师， 青岛大学 医学院附属医院 风湿免疫科， 山东 省青岛市 266003 dongjing218@ https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,
中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)19-03489-05 收稿日期： 2010-12-31 修回日期： 2011-02-19 (20101231005/W · W)
derived growth factor，PDGF)在狼疮发病中的 作用报道较少，因此研究以上细胞因子对于了 解狼疮的发病机制具有重要意义。 脐 带 间 充 质 干 细 胞 (mesenehymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能、造血支持、 免疫调节的特性， 目前有关MSCs治疗SLE逐渐 成为热点
[4-6]
时收获细胞；病毒检测、需氧菌、真菌、支原 体检测全部为阴性，细胞活力大于90%；应用 流式细胞仪对细胞进行鉴定，检测细胞表面标 记包括： CD34 、CD45 、HLA-DR 、CD44 、 CD90、CD105。CD34、CD45、HLA-DR表达 百分率小于2%，CD44、CD90、CD105阳性表 达率大于95%。
实验分组：32只MRL/lpr狼疮小鼠，随机分
。关于MSCs治疗SLE的疗效有待
于进一步验证， 实验将利用MRL/lpr狼疮小鼠研 究脐带间充质干细胞对SLE的治疗作用以及如 何影响干扰素γ、 白细胞介素17、 白细胞介素10、 PDGF等细胞因子的变化。此外，MSCs移植后 在不同脏器如何表达目前国内外尚未见报道。 实验将利用免疫组织化学法检测间充质干细胞 表面标志CD44、 CD105在肾脏， 肺脏及脾脏中 的表达。 1 材料和方法 设计：随机对照动物实验。 时间及地点： 于2009-12/2010-07 在青岛 大学医学院附属医院动物饲养中心和中心实验 室完成。 材料：16周龄雌性MRL/lpr狼疮小鼠32只， 体质量25~40 g， 购买自上海斯莱克实验动物中 心，许可证编号：SCXK(沪)2007-0005，饲养 于青岛大学医学院附属医院实验动物中心清洁 级环境中，实验过程中对动物的处置符合动物 伦理学标准。
试剂与仪器：
试剂及仪器 抗核抗体检测试剂盒 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG (FITC goat anti-mouse IgG) 光学显微镜 荧光显微镜(IX71-141，倒置) ELISA 试剂盒(白细胞介素 10、 白细胞介素 17、IFN-γ、 PDGF) CD44-PE 流式细胞仪 脐带 MSCs 环磷酰胺 CD105-FITC 美国 GBD 公司 美国 BD FACS Calibur 由山东省人类脐带间 充质干细胞库提供 江苏恒瑞医药股份 有限公司 LeicaDFC300FX OLYPUS 上海晶旷实验公司 来源 欧蒙公司 Jackson 公司
为 4 组，分别为对照组、环磷酰胺组、环磷酰 胺+脐带MSCs组、脐带MSCs组。每组8只。
脐带MSC移植过程[7-8]：环磷酰胺组、环磷酰
胺 + 脐 带 MSCs 组 于 第 16 周 予 以 环 磷 酰 胺 100 mg/kg×2 d 腹腔内注射，环磷酰胺 + 脐带 MSCs组、脐带MSCs组于腹腔注射完毕后1 d 给予1×106/kg P3代脐带MSCs尾静脉注射；对 照组予以0.5 mL生理盐水尾静脉注射。于第32 周处死所有动物，留取动物血清，进行抗双链 DNA(ds-DNA)抗体，白细胞介素10、白细胞介 素17、干扰素γ、PDGF等细胞因子检测。将部 分肾脏立即放人液氮留存，部分肾脏、肺、脾 脏放入体积分数10%甲醛固定。
体质量、尿蛋白浓度的检测：每三四周测定动
物体质量及尿蛋白定量(24 h)。 采用代谢笼留取 小鼠24 h尿量。尿蛋白浓度测定采用Bradford 法以小牛血清蛋白作为标准品，于分光光度计 595 nm下测吸光度(A)值， 绘制蛋白定量标准曲 线，计算实验组和对照组小鼠24 h尿蛋白浓度 值。
抗核抗体的检测：按照试剂盒操作说明，将
1 ∶ 100 稀释的血清加至加样板的每一反应 区，室温孵育30 min；用PBS冲洗载片，并将 载片浸泡在 PBS 溶液中至少 5 min ；将 20 μL 1∶80稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG 加至加 样板的反应区上，室温温育30 min；洗片，浸 泡5 min ；在加样板的反应区滴加封固介质封 固，荧光显微镜下观察结果。
抗ds-DNA抗体、 白细胞介素10、 白细胞介素17、 干扰素γ、PDGF的测定：按照试剂盒操作说明，
在标准品孔中加入标准品50 μL； 待测样本孔中 先加入待测样本10 μL， 再加样本稀释液40 μL； 37 ℃恒温箱温育30 min；重复洗板4次；每孔加 入酶标工作液50 μL；37 ℃恒温箱温育30 min； 重复洗板 4 次；每孔依次加入显色剂 A 、 B 液 50 μL，平板混匀器混匀30 s，37 ℃避光显色 15 min；取出酶标板，每孔加终止液50 μL，终 止反应；用450 nm波长测量各孔的吸光度值(A 值)；计算出标准曲线的直线回归方程。
P.O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,
实验方法：
脐带MSCs培养及鉴定： 遵照本干细胞研究中
心标准化操作规程，选择 5 代以内的人脐带 MSCs ，细胞生长状态良好，细胞融合度 90%
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小鼠肾脏病理学检查：每组取小鼠的肾脏组织于体积
分数10%中性甲醛液固定24 h，乙醇脱水，石蜡包埋， 切片，厚4 μm，苏木精-伊红染色，显微镜下观察小鼠 肾脏细胞数、肾小球硬化、新月体的性质和数目、肾小 球毛细血管袢坏死及肾小球毛细血管袢内血栓形成等。
免疫组织化学检测： 免疫组织化学检测采用SABC法，
24 h proteinuria (mg) 12 10 8 6 4 2 0 12 16
Control CTX CTX+UC-MSC UC-MSC
石蜡切片脱蜡水化后经体积分数3%H2O2室温避光孵育 封闭内源性过氧化物酶,小牛血清白蛋白封闭后依次加 入相应的一抗、二抗及ABC复合物，显色，苏木精轻度 复染后脱水，透明，中性树胶封固。每次染色均用1% BSA代替一抗作为阴性对照，在荧光显微镜下(×400)观 察, 以胞膜出现荧光为阳性信号。 主要观察指标：各组MRL/lpr小鼠24 h尿蛋白，抗 ds-DNA抗体水平、ANA抗体水平，干扰素γ、白细胞介 素17、白细胞介素10、PDGF水平，MRL/lpr小鼠肾脏 病理变化，脐带间充质干细胞表面标志CD44、CD105 在肾脏、肺脏、脾脏中的表达。 2 2.1 结果 脐带MSCs移植对MRL/lpr鼠体质量的影响 各组 2.3
20
24
28
32
36
Time (wk) CTX: cyclophosphamide
Figure 2
The effect of umbilical cord mesenehymal stem cells (UC-MSCs) transplantation on 24-h proteinuria of MRL/lpr mice 图 2 脐带间充质干细胞移植对 MRL/lpr 鼠尿蛋白定量(24 h) 的影响
脐带 MSCs 移植对 MRL/lpr 狼疮鼠抗 ds-DNA 抗体 环磷酰胺 + 脐带 MSCs 组 (2.6±0.9) 抗
和 ANA 的影响
ds-DNA抗体水平明显降低，与对照组(4.8±0.7)相比差 异有显著性意义，而抗ANA抗体的水平在各组间差异无 显著性意义，见表1。 在实验早期体质量均呈上升趋势，但对照组上升趋势减 缓， 治疗组仍有上升较快， 32周时环磷酰胺+脐带MSCs 组和脐带MSCs组与对照组相比差异有显著性意义，见 图1 。
Control CTX CTX+UC-MSC UC-MSC
表 1 脐带 MSCs 移植后血清抗体的变化 Table 1 Serum antibody changes after umbilical cord mesenehymal stem cells (UC-MSCs) transplantation _ (x±s, A)
Group Control CTX UC-MSCs+CTX UC-MSCs
a
ds-DNA(ln-1) 4.8±0.7 3.6±1.1 2.6±0.9a 3.2±1.3
ANA(ln-1) 7.8±1.3 7.0±1.5 6.8±0.6 6.7±1.4
50 Body weight (g) 40 30 20 10 0 16 20
P < 0.05, vs. control group; CTX: cyclophosphamide
2.4 影响
脐带MSCs移植对MRL/lpr狼疮鼠血清细胞因子的 32 周时 CTX+ 脐带 MSCs 组 IFN-γ 、白细胞介素
17、白细胞介素10较其他组降低，与对照组相比差异有
24 28 32
显著性意义(P < 0.05)。见表2。
表 2 脐带 MSCs 移植后血清细胞因子的变化 Table 2 Serum cytokine changes after umbilical cord mesenehymal stem cells (UC-MSCs) transplantation _ (x±s, A)
Group Control CTX CTX+UC-MSCs UC-MSC
a
Time (wk) CTX: cyclophosphamide
Figure 1 图1
The effect of umbilical cord mesenehymal stem cells (UC-MSCs) transplantation on MRL/lpr mouse body weight UC-MSC 移植对 MRL/LPR 鼠体质量的影响
Interferon-γ 920.71±26.8 770.2±29.0 493.0±25.6a 718.3±42.7
Interleukin-17 9.2±0.2 8.1±0.2 6.0±0.3a 7.4±0.4
Interleukin-10 166.6±5.3 126.1±17.9 76.9±7.2a 108.8±6.6
PDGF 8.7±0.2 7.6±0.5 6.3±0.2 7.0±0.3
2.2
脐带MSCs移植对MRL/lpr鼠尿蛋白定量(24 h)的
影响对照组小鼠从16周龄始，尿蛋白逐渐升高。各治疗 组小鼠在治疗的初期，尿蛋白也逐渐上升，但上升趋势 较对照组明显减慢。 32 周时环磷酰胺 + 脐带 MSCS 组 (4.2± 1.5) mg和脐带MSCS组(5.8±1.2) mg水平低于对 照组(9.8±2.3) mg (P < 0.01)和环磷酰胺组(9.6±1.9) mg (P < 0.01)。
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
P < 0.05, vs. control group; CTX: cyclophosphamide
2.5 影响
脐带MSCs移植对MRL/lpr小鼠肾组织病理变化的 见图3。 对照组小鼠肾脏病理显示显著的病理改变，表现为
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肾小球硬化、肾小球系膜细胞增殖、基质增宽，并可见 新月体形成，肾间质内大量淋巴细胞浸润。 CTX组肾脏病变较对照组明显减轻。 脐带MSCs组表现为系膜细胞，系膜基质轻至中度 增生，局灶性硬化，偶尔可见的肾间质的炎症细胞的浸 润。 环磷酰胺+脐带MSCs组表现为系膜细胞， 系膜基质 轻增生，局灶性硬化，偶尔可见的肾间质的炎症细胞的 浸润。
触发挥效应[15]， 还可能通过改变细胞因子分泌网络间接 影响免疫细胞，但确切机制仍不清楚。 近年来对肾损伤疾病的研究也显示 MSCs 输注可 促进肾损伤的结构修复和功能恢复， MSCs可迁移至受 损的肾脏并分化为肾小管上皮细胞，加快肾小管细胞 大量研究结果表明健康人骨髓MSCs移植 增殖速度[16]。 治疗 MRI/lpr 狼疮鼠能显著降低尿蛋白和血抗 ds-DNA 抗体水平，减少肾小球补体C3沉积，狼疮鼠肾病理显 著改善[17-18]。结果发现，MSCs移植后，MRL/lpr狼疮 鼠体质量增加、24 h尿蛋白定量降低、抗dsDNA抗体水 平下降、肾脏病理改变明显好转，表明MSCs移植对狼 疮肾炎具有治疗作用，这与国内外的研究报道相一致。 同时，结果发现MSCs移植后，在肾脏、肺脏和脾脏中 未找到MSCs的表面标志 CD44、CD105的表达，推测 MSCs不是直接分化为某些组织细胞来发挥免疫抑制作 用的，而是通过调节炎症因子的表达，诱导免疫耐受来
a: Control group
b: Cyclophosphamide (CTX) group
发挥治疗作用，这也是与国内外对MSCs特性的研究报 道相一致的。 干扰素γ是一种典型的Th1型细胞因子， 它可以提高 细胞免疫，增强B淋巴细胞活化[19]。狼疮肾炎患者在活 动期外周血干扰素γ表达明显升高，提示干扰素γ在狼疮 肾炎中可能起到加剧病情恶化的作用[20]。 白细胞介素10 是由T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等多种细胞分泌 的，是体内重要的免疫调节性细胞因子，在体液免疫介 导的系统性自身免疫病中， 白细胞介素10参与刺激自身 抗体的产生、抑制细胞免疫应答。目前国内外研究表明 细胞因子干扰素γ、白细胞介素10异常在狼疮肾炎的发 病中起到重要作用[3]。 自身免疫小鼠模型实验发现在多形核中性粒细胞 及外周血单核细胞中Th1/Th2 细胞因子如白细胞介素 2 和白细胞介素4、干扰素γ和白细胞介素10 mRNA表达 的比例与疾病的严重程度互相关联[21]。 狼疮肾炎体内高 水平的白细胞介素10与抗ds-DNA抗体的产生及狼疮肾 炎的病情活动度密切相关[22-23]。 白细胞介素17是主要由 活化的 CD4+CD45RO+ 记忆 T 淋巴细胞 (Thl7 细胞 ) 产生 的一种前炎症细胞因子， 是T淋巴细胞诱导的炎症反应早 期启动因素[24]。 白细胞介素17具有促炎作用， 在T细胞触 发的炎症反应中起到上游调控作用，可刺激上皮细胞、 内皮细胞、成纤维细胞产生多种促炎症递质，如白细胞 介素1，白细胞介素6，肿瘤坏死因子α[25]。Kolls等[25]也 发现白细胞介素17能促进T细胞启动，可诱导白细胞介 素6 、 白细胞介素8、 粒细胞集落刺激因子、 前列腺素E2、 肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β产生，引起炎症细胞浸 润和组织破坏。研究发现SLE患者中血浆白细胞介素17 水平与SLEDAI评分密切相关[26]。 PDGF是间叶组织来源细胞(成纤维细胞、 平滑肌细 胞、血管内皮细胞等)的特异性促分裂因子和趋化因子,
P.O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,
c: UC-MSCs group
d: CTX+UC-MSCs group
Figure 3 图3
The effect of umbilical cord mesenehymal stem cells (UC-MSCs) transplantation on kidney pathology of MRL/lpr mice (Hematoxylin-eosin staining, ×400) 脐带间充质干细胞移植对 MRL/lpr 鼠的肾脏病理的影响 (苏木精-伊红染色，×400)
2.6 MSCs表面标志CD44、CD105在各脏器中的表达 未在肺泡细胞膜，肾脏系膜细胞膜及脾脏细胞膜上找到 CD44、CD105的表达。 3 讨论 人脐带MSCs是一类具有自我更新、增殖和多向分 化潜能的干细胞，具有来源丰富、易于采集、保存和运 输、移植前无需清髓处理、避免伦理争议等诸多优 点[8-12] 。由于MSCs没有MHC限制性，在异体MSCs移 植时无排斥反应发生，而且MSCs在分化成其他细胞类 型时仍保留其特性,临床上已将MSCs应用于组织工程、 大剂量化疗后造血支持、治疗移植物抗宿主病等
[4-6]
。
大量研究表明可通过多种途径调节炎症因子的释 放， 在体内外均可发挥免疫抑制作用[13-14]， 此外， MSCs 还可诱导免疫耐受、抑制自身免疫反应，从而发挥治疗 作用。目前认为MSCs的作用机制可能主要通过与免疫 细胞(如T淋巴细胞，树突状细胞，B淋巴细胞等)直接接
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肖玉翠，等. 脐带间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮免疫系统的影响
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它能刺激间叶来源的细胞分裂、 生长[27]。 研究显示PDGF 在组织修复、胚胎发育、免疫应答、恶性肿瘤发展中， 对细胞生长、发育和分化都起着重要的调节作用。 Kameda 等 [28] 发现在系统性硬化症患者血液中检测到 PDGF受体抗体。Yamaza等
[29]
研究发现人脱落乳牙来
源的干细胞用于治疗MRL/lpr狼疮小鼠，可激活多种信 号途径， 包括PDGF； 但是关于脐带MSCs移植治疗SLE 过程中如何影响PDGF未见报道。实验发现，MSCs移 植后环磷酰胺+脐带MSCs组干扰素γ、白细胞介素17、 白细胞介素10水平降低， 与对照组相比差异有显著性意 义意义(P < 0.05),如前所述，因以上细胞因子均在狼疮 的发病中起着重要促发作用。 实验结果提示MSCs移植可以通过抑制促炎因子的 作用而发挥免疫抑制作用；同时，尿蛋白定量(24 h)降 低、抗ds-DNA抗体水平下降，肾小球硬化、间质纤维 化程度及间质炎症细胞浸润程度较对照组减轻，这些结 果均表明 MSCs 对MRL/lpr 狼疮鼠肾脏病变具有修复作 用。但PDGF在各组间无统计学差异，推测其原因可能 有：①PDGF在SLE的发病中可能不作为一种促炎因子 发挥作用。②PDGF具有独特的调节机制。③检测方法 的差别，有报道表明PDGF可能主要在肾脏组织中而非 外周血中表达，作者将在以后的实验中进一步检测其在 不同组织包括肾脏中的表达肾脏组织中的表达。 综上所述，MSCs移植后临床指标以及肾脏病理均 明显好转，表明MSCs移植对狼疮肾炎有治疗作用；同 时，细胞因子干扰素γ、白细胞介素17、白细胞介素10 在环磷酰胺+脐带MSCs组水平降低，表明MSCs移植可 以通过抑制促炎因子的分泌而发挥免疫抑制作用的。有 关MSCs移植对SLE疗效以及免疫抑制作用的具体机制 有待进一步研究。 4 参考文献
[18] [19] [20] [21] [22]
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作者贡献： 实验设计、 评估主要由通讯作者完成； 实施、
资料收集主要由第一作者完成，在实验实施过程中得到第 三、五的帮助。文章主要由第一作者撰写，第二作者负责审 校，并对文章负责。 由于王吉波与肖玉翠对文章及实验贡 献相同，为并列第一作者。
[4] [5] [6] [7]
利益冲突： 本课题不涉及任何厂家及相关雇主或其他经
济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理批准： 本实验过程中对动物的处置均符合动物伦理
学标准。
本文创新性：目前国内外研究主要通过检测体质量、
24 h 尿蛋白、各种细胞因子以及抗核抗体、抗 ds-DNA 抗体 的变化和肾脏病理的变化来观察脐带间充质干细胞对系统性 红斑狼疮的免疫抑制作用。实验着重研究了细胞因子 PDGF 在 SLE 发病中的作用， 以及通过免疫组织化学法检测脐带间 充质干细胞的表面标志在肾脏、肺脏、脾脏中的表达。
[8] [9]
ISSN 1673-8225
CN 21-1539/R
CODEN: ZLKHAH
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修改的ACR系统性红斑狼疮分类标准

2009 SLICC修改的ACR系统性红斑狼疮分类标准 SLICC Revision of the ACR Classification Criteria for SLE Petri, Michelle, Systemic Lupus International Collaborating Clinic (SLICC) 参考网址：1. 2. Purpose: The ACR Classification Criteria for SLE date from 1982 with a 1997 revision that was not validated. Because of new knowledge of autoantibodies, neuropsychiatric lupus, the importance of low complement and the need for lupus nephritis to be a "stand alone" criterion, the SLICC group undertook a revision. Method: An initial set of relevant variables was determined. Real patient scenarios (n=716) of SLE and non-SLE controls were submitted by SLICC centers. A consensus diagnosis was arrived at for each scenario. The consensus diagnoses were used to identify the variables that were most predictive of SLE. Recursive partitioning was employed to derive a classification rule based on multiple candidates predictor variables. This preliminary classification rule was discussed at three SLICC meetings, independently validated by a SLICC steering comittee and further refined. Results: Classify a patient as having SLE if: The patient has biopsy-proven lupus nephritis with ANA or anti-dsDNA OR the patient satisfies four of the criteria, including at least one clinical and one immunologic criterion. Clinical Criteria 1. Acute or subacute cutaneous lupus 2. Chronic cutaneous lupus 3. Oral/Nasal ulcers 4. Nonscarring alopecia 5. Inflammatory synovitis with physician-observed swelling of two or more joints OR tender joints with morning stiffness 6. Serositis 7. Renal: Urine protein/creatinine (or 24 hr urine protein) representing at least 500 mg of protein/24 hr or red blood cell casts 8. Neurologic: seizures, psychosis, mononeuritis multiplex, myelitis, peripheral or cranial neuropathy, cerebritis (acute confusional state) 9. Hemolytic anemia 10. Leukopenia (<4000/mm3 at least once) OR Lymphopenia (<1000/mm3 at least once) 11. Thrombocytopenia (<100,000/mm3) at least once

脐带间充质干细胞综述(转)

脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图

2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明

脐带干细胞综述

脐带间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层 的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的 治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在 于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获 得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可 达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成 为重要来源。 一．概述 人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。 脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其 形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介 于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;

系统性红斑狼疮的诊断标准是什么

系统性红斑狼疮的诊断标准是什么 红斑狼疮被称为世界三大疑难病症之一，具有病因未明，病程长，多系统、多脏器受累，易复发，死亡率高等特点。据统计显示，红斑狼疮人群患病率70/10万，其中女性患者为113/10万，我国现约有100万红斑狼疮患者，为全球之最。患者被确诊红斑狼疮后往往面临巨大的心理压力，更由于长期服药、疾病多次复发或者继发感染，而长期笼罩在病魔的阴影中。 系统性红斑狼疮的诊断标准： 系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多系统，多器官的自身免疫性疾病，若肾脏受累即为狼疮性肾炎。根据一般病理检查肾脏受累者约占90％，从发病机理来看，遗传因素只是一种易感倾向，环境因素在本病的促发中起重要作用，如病毒感染，药物因素，以及日光（紫外线）照射等。本病90％以上见于女性，凡青，中年女性患者有肾脏疾病表现，伴有多系统病变，特别是发烧，关节炎，皮疹，血沉显著增高者，均应怀疑本病，并应做常规检查和与本病有关的免疫血清学化验，以明确诊断。 1、面部蝶形红斑：弥漫红斑，扁平或高起于颧骨或鼻梁，可以是单侧。 2、盘状红斑伴有粘着性鳞屑和毛囊口角栓：有些损害可出现萎缩疤，这些损害除面部外亦可见于其他部位。 3、雷诺氏现象：需要观察到两种颜色。 4、脱发：病史和医院观察到大量迅速脱发。 5、光敏感：病史或医生观察到患者皮肤暴露区对阳光反应。 6、盘状红斑：片状高超皮肤的红斑，黏附有角质脱屑和毛囊栓；陈旧性病变可发生萎缩性瘢痕。 7、颊部红斑：扁平或高起，在两颧突出部位固定红斑。 8、口腔溃疡：经医生观察到的口腔或鼻咽部溃疡，一般为无痛性。 9、光过敏：对日光有明显的反应，引起皮疹，从病史中得知或医生观察到。 10、浆膜炎：胸膜炎或心包炎。 11、关节炎：非侵蚀性关节炎，累及2了个或更多的外周关节，有压痛，肿胀或积液。 12、神经病变：癫痫发作或精神病，除外药物或已知的代谢紊乱。 13、肾脏病变：尿蛋白》0．5g/24h或管型（红细胞，血红蛋白，颗粒管型或混合管型）。

脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验

脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应

脐带间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的护理

脐带间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的护理 发表时间：2015-02-02T16:09:14.103Z 来源：《医药界》2014年11月第11期供稿作者：黄颉[导读] 。患者的病情能够有一定程度的改善，表现为输血间隔时间延长，出血症状明显好转，感染有所减轻等. 黄颉（上海市交通大学附属第一人民医院南院８Ｂ血液科上海２０００００）【中图分类号】Ｒ５５６．５【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１１【摘要】再生障碍性贫血（ａｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ，ＡＡ）是由于物理、化学、生物或不明因素作用使骨髓造血干细胞和骨髓微环境严重受损，造成骨髓造血功能低下或衰竭，以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。间充质细胞（ＭＳＣ）是属于中胚层的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还有多种免疫调节作用，尤其是脐带ＭＳＣ（ＵＣ－ＭＳＣ）具有独特的优势成为干细胞治疗ＡＡ的 新热点。本文是为了探讨此项新治疗方法的护理。 【关键词】脐带；间充质干细胞；再生障碍性贫血；护理１．概述目前普遍认为，ＡＡ是一种主要由于Ｔ淋巴细胞免疫紊乱介导的获得性骨髓造血功能衰竭症，其发生、发展与Ｔ细胞功能亢进引起的造血微环境与造血干细胞的免疫损伤密切相关［２］基于此，目前免疫抑制治疗和造血干细胞移植已成为ＡＡ的主要治疗方法，大大改善了本病的预后。但免疫抑制治疗疗程较长，复发率高，副作用较大，有的抑制剂价格昂贵；异基因造血干细胞移植可望彻底治愈ＡＡ，但同样费用高、移植相关风险高，干细胞来源有限。目前免疫抑制治疗无效、不适合移植或不能耐受相关副作用的ＡＡ患者的治疗仍然是个棘手的问题。 ＭＳＣ是一类起源于中胚层的成体干细胞，除具备自我更新及多向分化潜能外，还有很强的免疫调节及支持造血双重作用。众多实验研究证实，ＭＳＣ可以通过多种途径发挥免疫调节及支持造血作用，应用于异基因造血干细胞移植，能有效治疗移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）和促进造血重建，这些均提示，ＭＳＣ在ＡＡ患者的细胞治疗中可能发挥重要作用。 ２．案例本例患者为男性，１４岁，于２０１２年１２月在无明显诱因下出现头晕乏力，牙龈出血，全身散在瘀点瘀斑，当地医院行骨髓穿刺后确诊为再生障碍性贫血。 予以输血、止血治疗后予以环孢素（ＣＳＡ）１５０ｍｇ／ｄ治疗，治疗中血常规ＷＢＣ（２－３）×１０９／Ｌ，ＨＢ５０－８８ｇ／Ｌ，ＰＬＴ（１０－７０）×１０９／Ｌ。２０１３年３月因症状反复加重予以强的松６０ｍｇ／ｄ治疗效果不佳，ＰＬＴ长期＜１０×１０９／Ｌ，期间平均每周输少浆血４００ｍｌ，单采血小板１个单位。由于无合适的异基因造血干细胞移植配对故考虑进行脐带间充质细胞治疗。患者分别于２０１３年５月和２０１３年６月两次输注脐带间充质共计８０ｍｌ。输注２个月后复查血象均有所上升ＷＢＣ５．１×１０９／Ｌ，ＨＢ８６ｇ／Ｌ，ＰＬＴ３０×１０９／Ｌ。２０１３年８月至今输血频率大大下降，患者目前仍予随访中，病情稳定。 ３．护理３．１输注中的护理３．１．１病情观察输注过程中密切监测生命体征和一般情况特别是血压及心率的变化。输注过程予以心电监护２小时，该患者输注时出现血压骤升，立即予以速尿２０ｍｇ静脉推注，甘露醇１００ｍｌ静脉快滴后症状有所缓解。输注过程中，患者若出现寒战、发热、恶心、呕吐、气促、心悸等不适，立即停止输注，按输血反应处理。 ３．１．２输注的技巧间充质细胞在送至病房后应立即输予患者，注意控制输入速度，应快速输注一般在２０—３０ｍｉｎ输完。由于间充质干细胞体外易贴壁生长的特性，输注前摇晃细胞悬液．输注中需每３ｍｉｎ摇晃细胞悬液及轻弹输血器管路，防止干细胞贴壁。输注前后生理盐水冲洗输液管道。输注时应暂停所有补液，不得与其他药物一同输注。 ３．２心理护理由于目前ＵＣ－ＭＳＣ在临床应用较少，患者对ＵＣ－ＭＳＣ知识也了解甚少，加上其在对治疗有效的强烈期盼和实施过程的过分担心使之产生了异常的复杂心理。因此，我们在护理上应充分讲解ＵＣ－ＭＳＣ的特性、来源、培养、传代、冻存和目前临床应用效果，在使用前充分预防可能发生的不良反应，通过以上心理护理，患者依从性好，积极配合治疗。 ３．３并发症的预防及处理３．３．１感染向患者做好宣教，严格注意感染的预防，如：定时使用漱口水防止口腔溃疡的发生，晚上睡觉前使用金霉素眼膏涂鼻腔保护鼻腔黏膜，使用信立妥眼药水滴眼防止眼睛干涩及感染。告知患者勤洗手，注意保持大便通畅，便后睡前使用痔疾洗液坐浴预防肛周感染，食物应选择干净、清淡饮食，防止腹泻的发生。同时要做好患者静脉穿刺点（如ＰＩＣＣ、深静脉穿刺、ＰＯＲＴ等）消毒护理，严格执行无菌操作防止穿刺点的感染。保持病室环境整洁，定时通风。限制探视人数及次数，避免到人多的地方，避免与有呼吸道感染的人接触，必要时戴口罩。 ３．３．２出血密切观察患者皮肤黏膜情况，观察有无瘀点瘀斑。观察患者呕吐物、尿液及粪便的色、质、量，如有立即异常留取标本送检。密切观察患者有无头痛、喷射性呕吐、视物模糊等颅内出血症状。做好患者相关宣教，如嘱患者要剪去指甲，不得用手挖鼻防止鼻出血，不要用力排便，血小板底下时要卧床休息，下床时要有人搀扶。如有头痛、视物模糊时立即告诉医护人员采取相应措施。 ４．小结ＵＣ－ＭＡＣ可促进造血重建，使造血功能得到有效、稳定的恢复，暂无明显不良反应。患者的病情能够有一定程度的改善，表现为输血间隔时间延长，出血症状明显好转，感染有所减轻等。其费用比骨髓移植少是再障患者较经济、理想的治疗方法之一。但该方法目前仍处于起步阶段，并没有大量开展于临床，相信在不久的将来便会用于造福广大患者，护理在其中起到了关键的作用，护士应做好观察及护理来提高该病种治疗的成功率。 参考文献［１］叶红高，陆再英．内科学［Ｍ］．第６版．北京：人民卫生出版社，２００４：７８７［２］ＹｏｕｎｇＮＳ，ＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇＰ，ＣａｌａｄｏＲＴ．Ａｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ［Ｊ］．ＣｕｒｔＯｐｉｎＨｅｍａｔｏｌ，２００８，１５（３）：１６２－１６８

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进_李艳琪

中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点： 在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢 弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次 贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能， 可成为临床研究和应用的细胞来源。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁 主题词： 干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术 摘要 背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到 关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将 传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行 生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。 将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。 传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导 分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性， 而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。 李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法 的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts

【CN110050780A】冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910216830.0 (22)申请日 2019.03.21 (71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市开发区广州国 际生物岛螺旋四路一号生产区第五层 502单元 (72)发明人 陈海佳　葛啸虎　王小燕　杨祖婷　 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿　赵青朵 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的 应用 (57)摘要 本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存 液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质 干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细 胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜 能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用， 从而起到治疗骨关节炎的效果。权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 110050780 A 2019.07.26 C N 110050780 A

1.一种冻存液， 其由如下体积份的液体组成： 2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于， 由如下体积份的液体组成； 3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于， 所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20％； 所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％； 所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。 4.权利要求1～3任一项所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 5.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至细胞密度为5×107cells/mL。 7.权利要求1～3任一项所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。 8.一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的冻存液。 9.根据权利要求8所述的干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为5×107cells/mL。 10.权利要求7～9任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。 权　利　要　求　书1/1页2CN 110050780 A

脐带间充质干细胞知识问答

脐带间充质干细胞26问 1. 什么是干细胞? 干细胞是指那些具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。 2. 什么是成体干细胞？ 成体干细胞是指存在于成体不同组织中的干细胞，当机体需要时可以被激活分化成具有特定功能的细胞，如造血干细胞可分化形成各种血细胞等。 3. 什么是胚胎干细胞？ 胚胎干细胞是指来源于早期胚胎的干细胞，它们可以产生构成机体所有组织器官的细胞。 4. 干细胞如何分类? 有几种分类方法。根据发育阶段不同，分为胚胎干细胞、胎体和成体干细胞。根据来源不同，可分为骨髓、骨膜、脂肪、滑膜、骨骼肌、肝、乳牙、脐带、脐带血干细胞等，根据功能不同，可分为造血、神经、心肌、血管、皮肤干细胞等。 5. 什么是多向分化？ 在特定的生理或体外诱导条件下，可以分化成具有不同功能的成熟细胞，如心肌细胞，神经细胞，血细胞等。 6. 什么是自我复制？ 通过细胞分裂的方式复制自身，完成数量上的飞跃。 7. 间充质干细胞只存在于脐带吗? 不是，间充质干细胞广泛分布于胎儿、成体骨髓、骨膜、松质骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中。 8. 什么是间充质干细胞（MSC）？ 间充质干细胞是干细胞的一种，因能在体内外特定环境下，分化成为骨、软骨、肌肉、脂肪等间叶组织而得名。 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即具有自我更新和多向分化潜能的生物学特性；此外，间充质干细胞还具有体外扩增的特性。 9. 什么是脐带间充质干细胞？ 我们所说的脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带中的间充质干细胞。

脐带间充质干细胞培养方法

(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.wendangku.net/doc/308469699.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.wendangku.net/doc/308469699.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化