分子标记的种类及其发展

?专题研究?分子标记的种类及其发展

Types of Molecular Markers and Their Development

黎裕　贾继增　王天宇

Li Yu　Jia Jizeng　Wang Tianyu

中国农业科学院作物品种资源研究所,北京100081

Institute of Crop G ermplasm Resources,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081

摘　要:　本文评述了分子标记的类型和最新发展,特别是对其术语进行了规范。

关键词:　分子标记;种类;术语

Abstract:　This paper reviews the types of molecular markers and their advances,and es pecially focus on the terminology.

K ey words:　Molecular marker;type;terminology

1　引言

1.1　分子标记概念的界定

广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传

的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包

括种子贮藏蛋白和同工酶(指由一个以上基因位点

编码的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因

位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式)。

狭义的分子标记概念只是指DNA标记,而这个界定

现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在

DNA标记范畴。

1.2　理想的分子标记的界定

理想的分子标记必须达到以下几个要求:(1)具

有高的多态性;(2)共显性遗传,即利用分子标记可

鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;(3)能明确辨别等

位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位点的标记

外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;(6)选择

中性(即无基因多效性);(7)检测手段简单、快速(如

实验程序易自动化);(8)开发成本和使用成本尽量

低廉;(9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数

据交换)。

但是,目前发现的任何一种分子标记均不能满

足以上所有要求。

2　分子标记的种类

2.1　限制性片段长度多态性

2.1.1　限制性片段长度多态性(restriction fragment

length polymorphism,缩写RFL P)是发展最早的分

子标记技术。RFL P技术的原理是检测DNA在限

制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变

(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织

(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等

均可导致RFL P的产生。此技术及其从中发展起来

的一些变型均包括以下基本步骤:DNA的提取、用

限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片

段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的

探针显示特定的DNA片段(通过Southern杂交)和

分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小,前三个

步骤就完全可能检测出DNA片段的差异,所以往往

不必要后面的几处步骤;对线粒体和叶绿体DNA进

行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现,

从理论上说,这种多态性也可称为RFL P。

2.1.2　一般选择单拷贝探针

但如果RFL P探针是来自拷贝数可变串联重复

(Varible number of tandem repeats,缩写VN TR),则

产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所引起

的多态性。凡是引起复单位的大小和序列不同、基

因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态

性的产生。在RFL P技术中有特殊用途(成为分子

—

9

1

—

标记)的重复序列包括:(1)小卫星(minisatellite)序列:重复单位(motif)约有碱基10～60个(也有16～100个碱基一说),在基因组中多次出现。(2)微卫星(microsatelite)或简单重复序列(simple sepuencerepeats,缩写SSR):重复单位含有1～5碱基(也有2～8个碱基一说),(microsatcllite词由Litt &Luty(1989))[11]提出。

2.2　以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记2.2.1　随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,缩写RAPD)

2.2.1.1　基本原理和特点　该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8～10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括:(1)不需DNA探针,设计引物也不需要知道序列信息;(2)用一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6～12条片段,但对某些材料可能不能产生扩增产物),总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法;(3)技术简单,RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术;

(4)不象RFL P分析,RAPD分析只需少量DNA样品;(5)成本较低,因为随机引物可在公司买到,其价格不高;(6)RAPD标记一般是显性遗传(极少数是共显性遗传的),这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”,但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子;

(8)RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高,因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩曾产物的改变;但是,如果把条件标准化,还是可以获得重复结果的[12];(9)由于存在共迁移问题,在不同个体中出现相同分子量的带后,并不能保证这些个体拥有同一条(同源)的片段;同时,在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物,因为所用的凝胶电泳类型(一般是琼脂糖凝胶电泳)只能分开不同大小的片段,而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。

2.2.1.2　RAPD技术的发展和相近的分子标记种类　下面提到的所有技术都是利用一个或两个短的富含GC碱基的随机引物:

DAF(DNA amplification fingerprinting):与RAPD技术不同的是,在DAF分析中,引物浓度更高,引物长度更短(一般5～8个碱基),只有两个温度循环(在RAPD中是三个温度循环),并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳,DAF通常会产生非常复杂的带型[5]。在DAF技术的基础上,又发展出了ASAP 技术(arbitrary signatures from amplification pro2 files)[4]。

AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction):在AP-PCR分析中,扩增分为三个部分,每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异;在第一个PCR循环中,引物浓度较高;引物长度不定,并且常常来自为其它目的而设计的引物(如M13通用测序引物)[20]。

MAAP(Multiple Arbitrary Amplicon Profiling):这是Caetano-Anolles(1994)[3]

创造的一个词,想用来统称所有这些相关技术,但迄今为止这个词很少使用。

2.2.2　特定序列位点

特定序列位点(sequence-tagged site,缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠,而不象RAPD、AFL P和利用随机探针产生的RFL P存在某种模糊性(如难以鉴别片段的来源)。这类分子标记主要包括以下几种分子标记。

2.2.2.1　STMS(Sequence-tagged microsatellites)通常又称为SSR,也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)

2.2.2.1.1　基本原理和特点　引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计,用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大,所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括:一般检测到的是一个单一的多等位基因位点;共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子;得到的结果复性很高。为了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳,它可检测出单拷贝差异。也可以在同一个反应试管中把PCR反应与不同的STMS引物结合起来(称为mul2 tiplexing),这可节省时间,但是,这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用。很显然使用STMS技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息,这一方面可以在其它种的DNA数据库中查询,否则就必须先建立含有微卫星

—

2

—

的基因组文库,再从中筛选可用的克隆,进行测序,然后设计合适的引物。

2.2.2.1.2　STMS的发展和相近的分子标记种类

(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFL P技术中的探针;

(2)把与SSR互补的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作引物或与随机引物配合使用),扩增的是基因组DNA的特定片段,即MP-PCR[7]和RAMPs[21];

(3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交,即RAMPO[15]或称为RAHM或RAMS;

(4)用5′或3′端加锚的SSR作引物(如GG [CA]7),即ISSR[23](见2.2.2.2)。

2.2.2.2　加锚微卫星寡核苷酸(Anchored mi2 crosatellite oligonucleotides)

Zietkiewicz et al.(1994)[23]对STMS技术进行了发展,他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物,对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸,这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(inter-simple sequence repeat)[23]、ASSR(anchored simple sequence re2 peats)[17]或AMP-PCR[18]。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物[17]。如果一个是5′端加锚的ASSR引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术[21]。

2.2.2.3　SCAR(Sequence-characterized amplified regions)

SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的[14]。其基本步骤是:先作RAPD分析,然后把目标RAPD片段(如与某目的基因连锁的RAPD片段)进行克隆和测序,根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物(一般比RAPD引物长,通常24个碱基),再进行PCR特异扩增,这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好,因为它有更高的可重复性(原因是使用的引物长),标记是共显性遗传的。

2.2.2.4　CAPS(Cleaved amplified polymorphic se2 quence)

CAPS技术又可称为PCR-RFL P。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是:先进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切,再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开,用EB染色,观察[10]。与RFL P技术一样,CAPS 技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测,其多态性称为AL P[6]。Neff et al.(1998)[13]在此基础上又发展出dCARS 技术(derived CAPS),这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。

2.2.2.5　SPAR(single primer amplification reac2 tion)

SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物,但SPAR分析中所用的引物不是随机的,而是在SSR的基础上设计的,例如可能的序列是(TA)10或(CG A)6。扩增的是SSR之间的DNA序列[8]。又称为MP-PCR(microsatellite-primed PCR)[19]。

2.2.2.6　DAMD(directed amplification of minisatel2 lite region DNA)

直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。2.2.2.7　Inter-Alu PCR like genomic profiling

与SPAR技术相近,也只用一个引物,但所用的引物是在Alu序列[反向重复序列]的基础上设计的,扩增的是copia序列之间的DNA序列[16]。

2.2.2.8　ISTR(inverse sequence-tagged repeat)

这种技术与SPAR技术也相近,也所用的引物是在copia序列[反向重复序列]的基础上设计的,扩增的是copia序列之间的DNA序列[16]。

2.2.2.9　IFL P(intron fragment length polymor2 phism)

检测的对象是内含子的长度差异[9]。

2.2.2.10　RAMPO(random amplified microsatellite polymorphism)

RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近,但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是:先用一个单一的随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增,用电泳将扩增片段分开,然后,把凝胶转

—

1

2

—

移到尼龙膜上,使之与一个带有放射性标记(或其它标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针(如[CA]8和[G A]8)杂交,放射自显影后可得到新的多态性类型[15]。

2.2.2.11　先找到RFL P标记后,对RFL P探针进行测序,再合成适当的PCR引物,这样可发现新的STS标记。这也可称为RFL P-PCR。

2.2.3　扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,缩写AFL P):其特点是把RFL P和PCR结合了起来。其基本步骤是:把DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”,用与接头互补的但3′端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3′端严格配对的片段才能得到扩增),再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为“选择性限制性片段扩增”[22]。Arencidia et al. (1998)[1]在AFL P的基础上发展出AFRP技术(am2 plified fragment random polymorphism),加的PCR引物中一侧为AFL P引物,一侧为随机引物。

2.2.4　单核苷酸多态性(single nucleotide polymor2 phism,缩写SNP)技术

同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异,因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。目前SNP作为一种新的分子标记,已有2000多个标记定位于人类染色体上,在植物上也在进行开发研究。可在胶上也可不在胶上就能检测出SNP,但检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。

参考文献

1　Arencibia A,et al.Mol Breed,1998,4:99～109

2　Baurens F-C,et al.Euphytica,1998,99:137～142

3　Caetano-Anolles G.Plant Mol Biol,1994,25:1011～1026

4　Caetano-Anolles G,PM Gresshoff.Biotechniques,1996,20:1044～1056

5　Caetano-Anolles G,et al.Bio/Technology,1991,9:553～557

6　Gharzeyazie B,et al.Theor Appl G enet,1995,91:218～227

7　Gupta M,et al.Theor Appl G enet,1994,998～1006

8　Gupta PK,et al.Current Sci,1996,70:45～54

9　Hongtrakul V,et al.Mol Breed,1998,4:195～203

10　K onieczny A,FM Ausubel.Plant J,1993,4:403～410

11　Litt M,AJ Luty.Amer J Human G enet,1989,44:397～401

12　Lowe AJ,et al.Plant G entic Resources Newsl,1996,107:50～54 13　Neff MM,et al.Plant J,1998,14:387～392

14　Paran I,RW Michelmore.Theor Appl G enet,1993,85:985～993 15　Richardson T,et al.Nucl Acids Res,1995,23:3798～3799

16　Rohde W J.G enet&Breed,1996,50:249～261

17　Wang G,et al.Theor Appl G enet,1998,96:1086～1096

18　Weising K,et al.J Crop Prod,1998,1:113～143

19　Weising K,et al.PCR Methods Appl,1995,4:249～225

20　Welsh J,M McClelland.Nucl Adics Res,1990,18:7213～7218 21　Wu KS,et al.Nucl.Acids Res.1994,22:3257～3258

22　Zabeau M,1993.European Patent Application.Publication No.

0534858Al

23　Z ietkiewicz E,et al.G enomics,1994,20:176～183

(上接第15页)

17　Yariv J,Lis H,Katchalski E.Precipitation of arabic acid and some seed poly saccharides by glycosylphenylazo dyes.Biochim J,1967, 105:1c～2c 18　Yariv J,Rapport MM,Graf L.The interaction of glycosides and saccharides with antibody to the corresponding phenylazo glycoside.

Biochem J,1962,85:383～388

欧洲联盟已经批准的转基因作物

以90/220为依据,截止到1998年底,已经获准在欧洲联盟种植和销售的转基因种子产品如下:

由植物遗传系统公司和艾格福公司先后研究开发的抗除草剂phosphinotricin的油菜;由孟山都公司研发的抗除草剂草甘膦的大豆;由Bejo-Zaden开发的抗除草剂phosphinotricin的雄性不育菊苣;以及由如下三家公司开发的4个转基因玉米品系:诺华公司商品名为Nature G ard和KnockOut的抗虫玉米(176品系),孟山都公司商品名为Y ieldG ard的抗虫玉米(Bt11和MON810),艾格福公司商品名为LibertyLink的抗除草剂玉米(品系T25)。

卢西安—

2

2

—

分子标记技术的种类

分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原

分子标记

分子标记 3分（内容丰富） 编辑词条 分子标记技术在搜搜百科中为本词条的同义词，已为您做自动跳转。 摘要 Molecular Markers 【分子标记的概念】 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern

DNA分子标记技术及其应用

DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；

分子标记技术综述

分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显

分子标记技术

分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝

分子标记在果树上的应用及前景展望

分子标记在果树上的应用及前景展望 分子标记指可遗传并可检测到的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记主要是指同工酶、等位酶、贮藏蛋白等等，本文主要介绍DNA标记。理想的分子标记应具有以下几个条件： ①以孟德尔方式遗传。 ②多态性好，自然条件下存在许多变异位点。③遍布整个基因组，能够检测到整个基因组的变异。 ④共显性遗传，即可以区别纯合体和杂合体。⑤表现“中性”，即不影响目标性状的表达。⑥重复性好，便于资源共享。⑦自动化程度高。近年来，关于分子标记的研究进展很快，本文仅就分子标记在果树研究中的应用及存在问题做一介绍，并对应用前景做一展望。 一、分子标记在果树研究中的应用： 1.分子标记在种质资源研究中的应用。 （1）系谱分析和分类。物种在进化过程中，其DNA是一个渐变的过程。遗传关系越近，基因组DNA的差异越小，反之，差异越大。HARADAT等用RAPD标记对两个三倍体苹果品种“乔纳金”和“陆奥”进行了分析，结果表明，作为母本的金冠提供了减数的二倍体配子。沈向等对杏进行了RAPD分析，将41个品种分为5类。 （2）种质保存和核心种质的建立。如何事理有效地管理和利用种质资源，当今世界出现了两种趋势，其中之一就是建立核心种质。目的是以最少的种质样品重复而最大地包含一个种及其野生种的遗传多样性。分子标记为人们提供了一个有效、快速的途径。目前已建立的核心种质涉及到谷物、豆类、牧草、蔬菜和果树等。AMY K SZEWC-MCFADDEN等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质，HOKANSON等也建立了苹果核心种质。 （3）构建指纹图谱和品种鉴别。高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。特别是对于无性繁殖的果树来说，同物异名、同名异物现象很严重，利用分子标忘本中高效、准确地建立指纹图谱、鉴别果树品

分子标记技术的类型原理及应用

分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术

遗传标记的发展和应用

遗传标记的发展和应用 1 遗传标记的种类 遗传标记是指在遗传分析中区分不同遗传背景的研究对象的可遗传的标记，根据研究水平的不同，可分为形态学标记、同工酶标记和DNA分子标记。Mendel 在经典的豌豆杂交实验中就使用了花色等可用肉眼识别的形态标记。虽然在早期的很长一段时间里，科学家们都在利用形态标记进行连锁分析和遗传作图（Sax, 1923），但由于形态标记数目较少,而且易受环境因素的影响，在界定过程中也易受人为因素影响，不是很准确，因此就限制了其应用和发展。同工酶是指具同一底物专一性的不同分子形态的酶。同工酶的概念虽然早就被提出，但由于技术限制，直到五十年代淀粉凝胶电泳酶谱技术的发明（Hunter and Market, 1957），同工酶技术才得以在遗传学研究中被广泛利用。同工酶标记是一种共显性标记，在不同组织、不同发育阶段和不同物种间可能具多态性，稳定而不受环境影响。但其数目和多态性对于迅猛发展的遗传学研究来说，依然是远远不够的。 随着分子生物学的快速发展，对遗传物质—DNA的认识和体外操作技术水平的不断提高，产生了新的基于DNA水平的分子标记。这类分子标记的多态性是由于DNA水平上的各种变异如：倒位、易位、缺失、插入和单个碱基突变造成的。在长期的自然选择过程中，基因组中积累了大量这种可遗传的变异，并且是均匀地分布于全基因组中的。因此DNA分子标记相对于同工酶标记和形态学标记具有数目丰富、多态性高、稳定不受环境影响等优点。根据DNA分子标记的工作原理可将其分为两类，一为以限制性酶切和分子杂交技术为基础的RFLP标记（Bastein, 1980）, RFLP标记最早是应用于人类基因组研究中，现已广泛地在动、植物的基因组研究中使用于遗传作图，基因定位等方面（Burr et al., 1988; Apuya et al., 1988; Mccouch et al., 1988; Tanksley et al., 1992）。而另一类则是以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）为基础的标记。随着PCR 技术的发明和广泛应用，一大批基于此技术的新型分子标记如RAPD（Williams et al., 1990）、AFLP（Zabeau and Vos, 1993）、SSR（Litt and Luty, 1989; Wu, 1993）等也迅速发展起来。RAPD是一种显性标记，以一段通常为10个碱基左右的随机寡核苷酸作为引物在基因组中进行扩增，由于引物的随机性，因此数量巨大，而且由于其主要是基于PCR技术，因此操作相对简便。AFLP标记是以两种限制性内切酶去酶切DNA，然后在两端分别加上两个接头，再进行两次选择性扩增，通常一次扩增可以得到相当多的带，在降低了错误扩增的几率后，AFLP是一种十分高效的标记，而且由于两种限制性内切酶可以任意组合，因此从理论上来说AFLP标记的数目几乎是无限的。AFLP标记可能为显性或共显性。SSR标记多为共显性标记，它是指在基因组中的一些有少数几个（2、3、4）核苷酸组成的简单重复序列，由于在生物的长期进化过程中这些重复序列所处的染色体位置

分子标记的发展及分子标记辅助育种

分子标记的发展及分子标记辅助育种 分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。 分子标记辅助育种示意图 DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的类型 分子标记按技术特性可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指

纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。 分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 各种分子标记的原理和优缺点 第一代分子标记：RFLP RFLP在20世纪70年代已被发现，是发现最早的一种分子标记。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。 RFLP标记的原理：植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA 所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如P32)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。 优点: RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。

分子标记技术的种类Word版

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来

分子标记技术

食安0801 02 邓凯 近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（genetic markers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。 分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点： ①多态性高； ②遍布整个基因 ③检测手段简单、迅速； ④无基因多效性； ⑤能够明确辨别等位基因； ⑥实验重复性好； ⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。 第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写 20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。目前有2种方法可进行DNA的RFLP 分析：一是根据其原理用RFLP的探针进行特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆；二是对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA 片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP标记呈孟德尔式遗传，大多数RFLP 的等位基因为共显性，在任何分离群体中能区分纯合基因型与杂合基因型。但该技术在 操作过程中涉及了DNA的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，且分析中需要的DNA量大，因此在很大程度上限制了RFLP技术的应用。 第2代分子标记（以PCR技术为核心）包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）、SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）、TRAP（Target Region Amplification Polymorphism，目标区域扩增多态性）等分子标记。利用PCR技术的忠实性、效率和特异性可以极大地简化样品的收集与处理工作，同时也降低了对样品数量和质量的要求，通常用几十纳克（ng）以内的DNA样品就可满足分析的需要。这对于分子标记辅助育种、QTL定

分子标记技术简介

分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。

分子标记的种类及其发展

1 引言 1.1 分子标记概念的界定 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。 1.2 理想的分子标记的界定 理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。 2 分子标记的种类 2.1 限制性片段长度多态性 2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段（通过Southern杂交）、分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后

分子标记技术的类型及其原理

分子标记技术的类型及其原理 08农生1班陈耀光 200830010403 所谓分子标记就是基于基因组DNA 存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接反映生物个体间DNA 水平上差异的新型的遗传标记方法。在遗传学发展过程中，先后出现了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中以分子标记最为理想、可靠，因为DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生的差异，都可以通过分子标记进行检测。DNA 分子标记较以往的形态标记其优越性表现在：(1)以核酸为研究对象，不受季节、环境限制，不存在基因表达与否的问题，也没有组织或器官特异性；(2)数量的丰富性，遍及整个基因组，标记的数量几乎是无限的； (3)多态性高，自然存在丰富的等位变异；(4)许多标记表现为共显性，能很好地鉴别纯合基因型与杂合基因型；(5)检测手段简便、快速，并且重复性好；(6)既不对目标形状的表达造成影响，也不会与不良性状之间产生必然的关联。 1 分子标记的类型及其原理 分子标记技术自诞生以来，短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展，至今被发展和利用的分子标记技术已有二十余种，为不同研究领域提供了有效的技术手段，同时也发挥着至关重要的作用。目前，根据对DNA 多态性检测手段和所应用序列范围的不同，对部分分子标记技术分类如下。 1.1 基于全基因序列的分子标记 RFLP (restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)：RFLP 作为最早发展的分子标记技术由Grozdicker 等于1974 年创建，并由Bostein 等再次提出。RFLP 技术的出现开创了直接在DNA 水平上进行遗传研究的新时代。其基本原理是：基因组DNA中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量也变化，从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的片段DNA，电泳分离后，借助Southern 杂交将DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上，将具有放射性标记的探针与膜上的片段杂交，通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性图谱。RFLP 标记的等位基因是共显性的，能区分纯合基因型和杂合基因型，结果稳定可靠，重复性好，适合于连锁图谱的建立。但是对DNA 要求较高，检测步骤多，操作复杂，耗时费资，而且需要放射性同位素等，这都在很大程度上限制了RFLP 技术的应用。

分子标记在玉米遗传育种中的应用和发展

分子标记在玉米遗传育种中的应用和发展 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如玉米抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；玉米品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高玉米育种的选择效率与育种预见性。遗传标记通常包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但玉米类许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异，它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择育种更受到人们的重视。 分子标记的类型和特点:按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸