毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒
用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白
综述：
基本特征：
作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：
许多技术可以通用：
互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：
毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：
毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：
AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。
AOX1突变表型：
缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。
蛋白胞内及分泌表达：
外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
泌信号序列，利用酿酒酵母α因子前原肽信号序列也获得许多成功。
分泌表达外源蛋白的最大优点是：毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成份，也可算作蛋白纯化的第一步。注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）,则这些位点可能发生糖基化。
翻译后修饰：
与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过糖基化。酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链8-14个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露糖残基）短得多。
另外，酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒酵母中糖基化蛋白的α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。虽然未经证明，但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题，因为毕赤酵母表达蛋白与高级真核生物糖蛋白结构相似。
选择载体用于基因多拷贝整合：
在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该试剂盒中的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。pPIC3.5K, pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
多拷贝插入频率：
毕赤酵母His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为1－10%，体内方法可筛选可能插入多拷贝外源基因的His+转化子，体外方法可通过连接构建多拷贝子。当选择His+转化子时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。
体内多拷贝插入的产生：
Ppic3.5k及Ppic9k含有细菌kan基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意Kan并不赋予毕赤酵母卡那霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kan基因的数目。单拷贝Ppic3.5k或Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉素抗性水平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml（1-2拷贝）到4mg/ml（7-12拷贝）。由于kan基因与表达盒（pAOX1及目的基因）之间有遗传连锁，可从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。由于基因的剂量效益，蛋白的表达可能会增加。因此，kan基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。下图显示多拷贝插入及kan基因与表达盒的连锁。
遗传霉素直接选择：
在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效，因为新转化的细胞需要时间表达足够量的抗性因子。由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵母在积累足够多的抗性因子以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了。最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
虽然可以用电泳进行直接筛选，但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选，获得含高拷贝克隆的机会更大，大约可获得5-9拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为1-3拷贝的克隆。原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。
体外多拷贝插入的产生：
下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。目的基因插入独个EcoRI位点后，产生的表达盒（pAOX1及目的基因）上下游侧翼分别为独个的BglII及BamHI位点。
含目的基因的pAOX815用BglII及BamHI消化以分离表达盒，表达盒再插入BamHI 位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个HIS4基因及逐渐增加数目表达盒的载体。
用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率，可设计包含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。
转化及整合：
可产生两个不同表型的His+重组菌株：质粒DNA线性化位置不同，转化GS115后可产生两种转化子His+Mut+及His+Muts。KM71只产生His+Muts，因为该菌株为Muts表型。两种重组子Mut＋及Muts都是有用的，因为一个表型可能比另一个表型更有利于蛋白表达。理想条件下，每一个表型应该检测6-10个重组子。没有办法预测哪个结构或克隆更利于蛋白表达。强烈推荐用PCR分析重组子来证实整合情况。
成功将基因构建至AOX1启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。下图显示用不同酶消化时产生何种重组子。
限制酶插入事件GS115表型KM71表型
SalI或StuI 插入his4 His+Mut+ His+Muts
SacI 插入5’AOX1 His+Mut+ His+Muts
BglII 取代AOX1 His+Muts His+Muts（不推荐）
表达及扩大培养：
用PCR证实毕赤酵母重组后，可检测His+Mut+及His+Muts的表达。小规模培养每个重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用SDS-PAGE分析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯亮蓝染色又用western blot分析SDS-PAGE凝胶。如果可以,建议检测蛋白活性。因为并不是所有蛋白都能达到g/l的水平，所以建议进行western blot或活性分析，不要仅做SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色分析。
如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见P49-50。如表达已达最优，大规模表达以产生更多蛋白。
方法
毕赤菌株表型：
毕赤酵母菌GS115及KM71在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115及KM71自发回复突变到His＋原养生物机率小于1/108。
KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因破坏AOX1基因后，产生KM71 MutsArg+His-菌株。
GS115及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。转化之前，GS115及KM71都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
KM71结构：
ARG4基因（约2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点。ARG4取代了AOX1基因16－227密码子。此结构转化至KM71亲本菌（arg4his4）中,分离Arg+转化子并分析Muts表型。Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代。
重点：
用KM71的优点是，不需要在甲醇最小培养基中筛选Mut表型。所有转化子都是Muts 表型。第二，AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。不幸的是，仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在KM71中通过取代aox1::ARG4结构来获得His ＋转化子。
菌株表达对照：
GS115/His+Muts白蛋白：该菌株为筛选毕赤酵母分泌表达转化子与Muts表型时的对照。血清白蛋白基因及其自身分泌信号被整合进毕赤酵母AOX1位点。该菌株可分泌白蛋白（67kDa）到培养基中，分泌水平＞1g/l。
GS115/His+Mut+β－半乳糖苷酶：该菌株为筛选毕赤酵母转化子胞内表达与Mut+表型时的对照。β－半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合进毕赤酵母his4位点，该菌株表达β－半乳糖苷酶（117 kDa），达到通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色或ONPG分析可测水平。
毕赤酵母菌株生长：
毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。在32度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
另外注意点有：
1在YPD中，处于对数期的Mut+、Muts毕赤酵母倍增时间为2小时
2除了在甲醇中生长速度不同外，Mut+、Muts生长速度没有差别
3甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Mut+倍增时间为4-6小时
4甲醇培养基（MM）中，处于对数期的Muts倍增时间为18小时
51OD600=5×107细胞/ml
注意：生长特性依重组菌株不同而不同
在甲醇中生长：
当使用甲醇平板或培养基培养时，建议每天添加甲醇以补偿甲醇挥发及消耗。
1平板培养时，在倒置平板盖中加入100ul 100%甲醇
2液体培养时，加入100%甲醇至终浓度为0.5%
3部分研究者在进行液体培养时，对Muts菌株每天加甲醇至浓度为1%，对Mut+菌株每天加甲醇至浓度为3%时，对液体培养没有不良影响。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD琼脂斜面
1挑取所需菌株单克隆在YPD平板上划线生长
2挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30度2天
3细胞在4度可放几周
几月或几年，存于－80度
1挑取所需菌株单克隆在YPD中过夜培养
2收集细胞，在含15%甘油的YPD中悬浮至终OD600为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）
3细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80度。
注意：在4度或－80度长期保存后，用之前建议在MM、MD或MGY平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
大肠杆菌菌株：
大肠杆菌菌株表型：提供E.coli Top10F’以防没有合适的E.coli菌株。其它合适的菌株为DH5αF’，JM109或其它重组缺失菌株（recA），最好是endA，及带有选择性的F’附加体。Top10F’适用于重组及单链拯救。
如果不需进行单链DNA拯救，也可用不含F’附加体的大肠杆菌菌株。
建议：建议冻存Top10F’
1在5ml含50－100mg/ml四环素的LB中培养Top10F’过夜
2取0.85ml培养液加0.15ml灭菌甘油完全混匀
3转入冻存瓶中，冻在液氮或干冰/酒精浴中
4存于－80度
选择毕赤酵母表达载体：
选择载体：如果目的蛋白是细胞溶质型且是无糖基化蛋白，可选择胞内表达蛋白。如果目的蛋白是正常分泌、糖基化蛋白或直接分泌至胞内细胞器内，可尝试分泌表达目的蛋白。
建议用体内及体外方法产生并分离外源基因多拷贝插入子。无法预测哪种方法适用于你的蛋白，每种方法的优缺点如下：
体外方法pAO815
优点缺点
可构建特定数目的多拷贝子克隆特定数目多拷贝子需要更多工作
大多数His＋转化子含有正确的特定数目插入
载体可能会很大，与基因大小及插入拷贝数有关
筛选多插入子很容易，因为大部分His
＋转化子含有多拷贝目的基因
在E.coli中可能会发生重排
体外构建可以分析拷贝数对蛋白表达的
影响
多拷贝插入位于单一位点
载体上无需另外的药物抗性标记
体外方法Ppic3.5k或Ppic9k
优点缺点
开始实验比较容易，转化毕赤酵母前载体中只需克隆单拷贝基因
定量筛选－遗传霉素抗性并不一定与基因拷贝数相关
1-10%的His＋转化子有自发的多拷贝插入
筛选His＋转化子需要做很多工作，因为要从成千上万个His＋转化子中才能筛选到足够多的遗传霉素抗性克隆进行检测
载体平均大小与其它毕赤酵母表达系统相似
多拷贝插入的数目不知（尽管可用southern 或dot blot分析方法进行检测）
多拷贝插入位于单一位点遗传霉素筛选对细胞密度敏感，可能会
分离到假阳性
特点：下表显示毕赤酵母多拷贝表达载体的一般特点及优点：
特点描述优点
5‘AOX1 含AOX1启动子的约1000bp片
段
毕赤酵母中可实现甲醇诱导的高水平表达
α-factor 信号序列
编码α因子信号序列的269bp，
用于毕赤酵母分泌表达（只能用于
Ppic9k）
分泌所需蛋白至培养基中
MCS 多克隆位点在表达载体中插入目的基因
TT AOX1基因自带的转录终止及polyA信号（约260bp）
mRNA有效的转录终止及多聚腺苷酸化
HIS4 毕赤酵母野生型基因编码组氨酸脱氢酶（约2.4kb），用于与毕赤酵
母his4菌株进行互补
为选择毕赤酵母重组菌株提供选择标记
3‘AOX1 AOX1基因序列，在TT3‘远端
序列（约650bp）
质粒靶向整合进AOX1基因
Amp
pBR322复制起点Amp抗性基因
E.coli复制起始
用于选择、复制及维护E.coli
BamHI BglII NotI SacI SalI StuI
单一酶切位点
（StuI在Ppic3.5k或Ppic9k中不
是唯一的）
可线性化载体，使有效插入毕赤
酵母基因组产生Mut+或Muts重组子
Kan 来自Tn903的卡那抗性基因，赋予E.coli卡那基因抗性，赋予毕赤酵
母遗传霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k）
通过增加的抗遗传霉素抗性，可在体内筛选多拷贝插入子
在大肠杆菌中筛选Kan抗性菌株
在该试剂盒中，任何毕赤酵母表达载体都没有酵母复制起始位点。只有当质粒与毕赤酵母基因组发生重组时，才能分离到HIS＋转化子。
Ppic9k：含卡那基因，体内筛选多拷贝子插入，分泌重组蛋白至培养基中。在GS115及KM71中有功能。
19276bp融合载体
2在α-factor分泌信号阅读框中含有用于克隆的4个单限制酶位点。SnaBI、EcoRI、AvrII、NotI
3α-factor分泌信号分泌表达目的蛋白。表达时，目的基因必须克隆进信号序列起始密码的读码框中
毕赤酵母HIS4筛选
GS115或KM71，在AOX1基因处插入，用SacI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts）
在HIS4位点插入，用SalI线性化（对于GS115产生His+Mut+，对于KM71产生His+Muts）在GS115菌株中，替换AOX1基因，用BglII线性化（产生His+Muts）
克隆进毕赤酵母多拷贝表达载体：
介绍：下面列出用这些载体进行克隆策略时应考虑的方针。考虑位点，如用Ppic9k载体，应考虑将目的基因克隆进α-factor信号序列读码框中。
建议将3个超螺旋毕赤酵母表达载体转化E.coli，以便长期保存。
1用灭菌水或TE缓冲液稀释1ul质粒（1ug/ul）至10-100pg/ul
2取1-2ul稀释质粒转化感受态E.coli，在含50-100 ug/mlAmp的LB平板上选择
一般考虑：下面是应用pAO815、Ppic3.5k或Ppic9k时的一般考虑
1毕赤酵母的密码偏爱与酿酒酵母相同，已证明许多酿酒酵母中基因在毕赤酵母中有交叉功能
2应在含recA, endA突变的E.coli菌株如Top10F’中构建质粒
3AOX1mRNA的5‘末端在各多克隆位点都已标注出。如需分析RNA，可计算插入基因mRNA的大小
4插入基因的终止密码子或3‘AOX1序列可使翻译有效终止，3‘AOX1序列终止密码已标注出
5在毕赤酵母及其它真核系统中均发现了“AT富含区”导致的转录提前终止。如果表达蛋白时出现问题，应检查是否是提前终止及A T富含区。如要表达基因则需改变基因序列。
6Ppic9k中预测的蛋白酶裂解位点如图（p28）所示
7插入成熟基因的开放阅读框，应克隆进α-factor信号序列读码框的下游
一般克隆策略：
1连接适合的限制性片段
A直接插入MCS上两个不同位点
B利用相同的限制性末端，将片段连入单个合适位点
2PCR扩增插入基因以产生合适的用于连入合适载体的限制性末端
3扩增含目的基因片段通过TA克隆盒进行直接克隆，再将合适的片段亚克隆进所选择载体
克隆程序：
注意：如果你要插入pAO815上EcoRI位点，而基因中也含有EcoRI位点，我们建议：1BsaI可识别以下的限制性识别位点：
5‘GGTCTCN/
3‘CCAGAGNNNNN/
2将EcoRI位点改造成BsaI可识别位点
5‘GGTCTCG/AA TTC……
3‘CCAGAGCTTAA/G……
3将该序列通过PCR整合进DNA片段中，或在体外制造其它限制性位点的适配子接头4用BsaI消化PCR产物或适配连接产物，这样不用EcoRI消化就可产生EcoRI的限制性末端。
信号序列加工：Ppic9k中α-factor成熟信号序列加工分两步：
1KEX2基因产物初步切割信号序列，在Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala中星号位置即arg及glu之间出现Kex2断裂
2STE13基因产物接着切割Glu-Ala重复序列
优化信号切割：酿酒酵母中，Glu-Ala重复序列并不是Kex2切割时的必需序列，但Glu-Ala重复序列可使该切割更有效。
Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X位置上有许多氨基酸都可替代Glu，如芳香族氨基酸，小氨基酸及组氨酸。但脯氨酸会抑制Kex2的切割。
许多情况下，Stel13切割Glu-Ala重复片段效率不高，Glu-Ala重复序列就留在了表达的目的蛋白的N端，这一般与目的蛋白本身性质有关。
细菌转化：一旦确定克隆策略，在进行连接反应前应制备好E.coli感受态，可参考电感受态或化学感受态E.coli方法或使用本实验室实验程序。
Ppic9k的pAOX1及MCS:
特殊考虑：
1目的片段必须克隆进分泌信号序列开放阅读框中
2信号序列中含ATG，翻译从离mRNA5‘端最近的一个A TG开始
3如果插入片段中有BglII位点，毕赤酵母转化时，可选取其它限制性位点来线性化质粒(P30)
转化E.coli：
介绍：连接反应之后，要通过化学或电转的方法转化E.coli感受态细胞(Top10F’或相似菌株)
转化分析：
1转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul Amp的LB平板上，选择Amp抗性克隆2挑取10个Amp抗性转化子，接种含50-100ug/ul Amp的培养基，37度振荡培养过夜3小量制备分离质粒DNA用于分析及测序。pAO815或pPIC3.5k测序时，用5‘AOX1及3‘AOX1测序引物；pPIC9k测序时，用α-factor引物及3’AOX1测序引物。将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul溶液。
4在0.85ml过夜培养菌液中加入0.15ml灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70度保存。
5测序证实结构正确后，可准备转化DNA
重组克隆测序：强烈建议转化毕赤酵母前进行测序
1正确读码框(分泌表达)
2真核翻译起始所需的ATG正确的上下文
克隆基因后：克隆进pAO815后，需在体外构建多插入子
如果克隆进Ppic3.5k或Ppic9k，可准备将质粒DNA转入毕赤酵母。转p28
准备转化DNA：你应该已经获得正确插入目的基因的毕赤酵母表达载体质粒，以用于表达。下表列出下阶段应做的实验。
步骤实验页数
1 准备转化用DNA 28-30
2 GS115或KM71用于制备去壁细胞31-34
3 DNA转化GS115或KM71 35-36
4 选择His+转化子35
37-40
5 如果将基因克隆进Ppic3.5k或Ppic9k，筛选His+转
化子的遗传霉素抗性
6 证实重组菌的Mut+Muts表型41-43
7 PCR鉴定基因是否存在70-71
8 检测基因表达44-48
建议同时分离His+Mut+及His+Muts毕赤酵母转化子，因为很难预测哪种结构更利于蛋白表达。通过线性化DNA5‘AOX1区或HIS4基因及使用GS115（Mut+）或KM71（Muts）菌株，可方便地分离到Mut+及Muts重组子。每次转化时使用约10ug线性化DNA。
质粒DNA准备：用于毕赤酵母转化的质粒DNA起码纯到可以做酶切，DNA越纯，转化效率越高。建议用S.N.A.P MiniPrep Kit来准备质粒DNA用于常规毕赤酵母转化，质粒DNA也可通过碱裂解、酚：氯仿抽提及乙醇沉淀来获得。
线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。如果只想得到Muts重组子，使用KM71菌株。单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入AOX1或his4而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位点，见p29-30以替换位点。
1如果克隆进Ppic3.5k，线性化时，
插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)
插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)
2如果克隆进pAO815，线性化时，
插入HIS4用SalI或StuI（GS115, Mut+ 或KM71, Muts）
注意如果用pAO815载体，插入2个或更多拷贝子会产生SacI酶切位点
3如果克隆进Ppic9k，线性化时，
插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)
插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)
程序：
1酶切新构建载体及亲本载体。将亲本载体转入GS115或KM71用作表达的背景对照2凝胶分析酶切产物以确定是否酶切完全。如酶切不完全，转化数及靶向效率都会降低3用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提酶切产物，乙醇沉淀DNA，用10-20ulTE缓冲液重悬。不需要将目的基因片段从线性化质粒中分离纯化出来。
4贮存于-20度直至转化
替换酶切位点：下表列出线性化载体转化毕赤酵母时的可替换酶切位点。
注意Ppic9k中Kan基因中含StuI位点，而HIS4上的StuI位点则被去除。
对照：建议转化毕赤酵母时用以下对照：
1亲代载体与重组载体以相同方式进行酶切，可在用PCR证实整合时作对照，还有表达分析及定量dot blot或southern分析时作为背景对照。
2含有单拷贝目的表达盒的pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k。以与多拷贝子同样方式线性化pAO815载体。
大多数通过转化重组Ppic3.5k或Ppic9k而得到的His+重组子只含有单拷贝插入。确保你挑取的转化子只能抗0.25mg/ml遗传霉素。pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k单拷贝对照应与正检测的假定多拷贝重组子具有相同的Mut表型。这些单拷贝重组子可作为与多拷贝子进行表达比较的参照，也可作为定量dot blot及southern分析时的参照。这是非常重要的参数，因为目的基因拷贝数的增加并不一定会增加重组蛋白的表达量。
培养毕赤酵母用于制作原生质细胞：
介绍：一般，对大多数的研究者来说，原生质细胞及电转是效率最高的转化方法（103-104转化子/ugDNA）。毕赤酵母同样可用PEG1000（P68）或LiCl（P69）进行转化。这两种方法，特别是LiCl方法不如原生质法及电转化方法。如果没有电转化装置，建议使用原生质细胞法或PEG1000法。毕赤酵母的转化效率不如酿酒酵母的转化效率高。
原生质细胞的解释：毕赤酵母细胞壁阻止摄入DNA，有必要去除部分细胞壁以吸收DNA。藤黄节杆菌酶是一种葡聚糖酶，可在细胞壁水解葡聚糖的β－1,3接头，还可部分地消化细胞壁。该方法的关键在于不能过度消化细胞壁，否则会导致细胞死亡。藤黄节杆菌酶消化能力受细胞对SDS敏感性的影响。等量细胞加入SDS，以产生原生质细胞，该步的结果是溶液变澄清，其澄清度可由800nm处的吸光值获得。
一般经验，获得70%原生质细胞时，消化程度较好。用等渗溶液清洗细胞除去酶并与DNA共孵育。将细胞重悬于山梨醇溶液中，细胞壁再生后再铺板。
准备：制备下列溶液，存于4度。
YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose）培养基1L
YPD平板1L
RDB（Regeneration Dextrose Base）平板1L
RDHB（Regeneration Dextrose Histidine Base）平板1L
转化当天，配制下列试剂：存于4度
5%SDS溶液
RD（Regeneration Dextrose）融化琼脂100ml
溶液：细胞去壁及转化试剂
1M山梨醇
SE: 1M山梨醇, 25mM EDTA pH8.0
DTT: 用水配制成1M浓度
SCE：1M山梨醇,1mM EDTA , 10mM 柠檬酸钠缓冲液pH5.8
CaS: 1M山梨醇, 10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCl2
藤黄节杆菌酶：用水配制成3mg/ml的浓度
40%PEG：用水配制40%（w/v）PEG3350(试剂纯)
CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2
SOS: 1M山梨醇,0.3×YPD, 10mM CaCl2
每次转化时配制：
SED：19mlSE加1ml1M DTT
PEG/CaT: 1:1混合40%PEG及CaT
程序：
1在YPD平板上划线培养GS115或KM71,28－30度培养2天，以得到分散的单克隆。
2在50ml离心管或100ml摇瓶中，从GS115或KM71平板上挑取单个克隆接种10ml YPD，28－30度剧烈振荡（250-300rpm）过夜。该培养基可在4度保存数天。
3在3个500ml培养瓶中加入200mlYPD，分别取5、10及20ul第2步中的细胞，于28-30度剧烈振荡（250-300rpm）过夜
4第二天早上，将试剂盒中的转化溶液（SE，SCE，灭菌水，SOS，PEG，CaS,1M山梨醇），RDB平板（用于转化）、RDHB平板（活力对照），放置于室温下。
5测每个培养瓶中的OD600值
6收集OD600值为0.2-0.3瓶中的细胞，室温，1500g离心5-10min。去除上清，接下去准备细胞去壁
注意：如果培养基都超过0.3，选择一个培养基，用新鲜培养基以1：4稀释，28-30度孵育直至OD600值至0.2-0.3（2-4小时）。收集细胞如第6步
准备细胞去壁：取得上述第6步细胞
1取100ml融化的RD琼脂糖，存于45度
2解冻1管1M DTT
3为该次去壁细胞试验准备新鲜的SED
无菌条件下，将19mlSE转入合适的灭菌容器中（如50ml离心管），加1ml1M DTT 混合均匀，为得到最好的效果，SED现配现用
注意：DTT的质量及新鲜度是成功制备去壁细胞的关键，1M DTT分析纯，-20度保存。
洗涤细胞：
1用20ml灭菌水悬浮洗涤细胞，转入灭菌的50ml的离心管中
2室温1500g 离心5min，收集细胞
3将细胞重悬于20ml新鲜的SED中洗涤，如2离心
4用20ml1M 山梨醇洗涤，离心如2
5用20ml SCE缓冲液重悬细胞，将悬液分至两个50 ml离心管中(10ml/管)
6取1管藤黄节杆菌酶置于冰上，轻弹管壁以混匀，藤黄节杆菌酶以浆液的形式存在，无需配成溶液，将它混匀以确保每次的量是相等的。
加入藤黄节杆菌酶：可先取一管细胞来确定用藤黄节杆菌酶消化细胞的最佳时间，一旦确定时间，取另一管细胞进行裂解。藤黄节杆菌酶消化细胞壁，使细胞变脆，拿样品时要轻柔些，加入藤黄节杆菌酶后，即开始消化细胞壁。
*准备至少20ml 5%SDS溶液
*将分光光度计调至800nm处，用800ul 5%SDS及200ul SCE作空白
*准备10个灭菌离心管，编号0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50
1取5步中一管细胞，取出200ul加入标0的管中，置于冰上，此即0点
2加7.5ul藤黄节杆菌酶到该管剩余细胞中，轻轻颠倒混匀，30度孵育，不要晃动样品。该样品可用于建立细胞去壁最佳时间表。将另一管细胞置于室温，用于第六步。将剩余藤黄节杆菌酶放于冰上。
3监测去壁细胞的形成：2min时，取200ul步骤2中的悬浮细胞，加入标2的管中。在t=4,5,6,,,50min时，重复上述操作，读样品OD800值
4用公式确定每个时间点时去壁细胞的形成比例：
%去壁率=100-［(时间t时OD800值/时间0时OD800值)×100］
如t=0时，OD800=0.256，t=15时，OD800=0.032
计算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5% 5确定去壁率为70%时的时间，藤黄节杆菌酶的用量不同，最佳时间也各不相同。Invitrogen 实验室的最佳去壁时间为15-40min。
注意：确定获得所需量去壁细胞的最小时间很重要，藤黄节杆菌酶消化时间过长，对细胞有害，效率会降低。
6在另一管中加入7.5ul藤黄节杆菌酶(如步骤1)，将管放于30度，时间为步骤5中建立的最佳时间，以获得最佳比例70%的去壁细胞。
7室温750g离心10min，收集去壁细胞，去除悬浮液
8用1M山梨醇洗去壁细胞1次(轻叩管壁以分散去壁细胞团，不要涡旋)。如上离心9用10ml CaS洗涤去壁细胞，如7中离心，用0.6mlCaS重悬细胞。去壁细胞必须立即(至多30min)用于转化。不能放更长时间，这些细胞共可作6次转化
转化毕赤酵母：
开始前：将RDB平板放于室温，准备好融化的RD上层琼脂，取出线性化DNA置于冰上
GS115中，用SalI,StuI或SacI线性化的DNA可分离His+Mut+重组子
KM71中，用SalI,StuI或SacI线性化的DNA可分离His+Muts重组子
亲代载体用相同酶线性化
对照包括无DNA，线性化PBR322DNA及质粒(无细胞)涂板来检测是否有污染
程序：
1取上述9中100ul去壁细胞到1.5 ml灭菌的有盖管中
2取10ugDNA，室温孵育10min
3同时配制PEG/CaT溶液，计算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)
4加1ml新鲜的PEG/CaT溶液至细胞与DNA混合物中，轻轻混匀，室温孵育10min
5室温750g离心10min，小心抽吸PEG/CaT溶液，颠倒管，轻叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。
6用150ulSOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育20min
7加入850ul1M山梨醇，接下来涂板
涂板：毕赤酵母去壁细胞需要铺在顶层琼脂糖或琼脂上，以防止在选择前被裂解
1接第7步，取100-300ul去壁细胞-DNA，与10ml融化的RD琼脂糖混匀倒于RDB平板上，直至上层琼脂变硬。注意，确保有足够的去壁细胞-DNA铺第二板，第三板2倒置平板，28-30度孵育，转化子会在4-6天内出现
3细胞活性：用100ul去壁细胞加入900ul 1M山梨醇
4取稀释样本100ul，加入10ml融化的RDH，铺在RDHB平板上，等上层琼脂凝固5倒置平板，28-30度孵育，4-6天出现克隆，表明去壁细胞可再生成分裂细胞
His+转化子分析：如用Ppic3.5k及Ppic9k构建载体转化毕赤酵母，接着做体内筛选多插入子
如用pAO815构建载体转化毕赤酵母，筛选Mut+及Muts转化子
评价转化试验：使用去壁细胞，一般转化效率为103-104His+转化/ugDNA，在无DNA、线性化PBR322及只有质粒(无细胞)平板上应均无克隆。
功能分析筛选：有些研究者通过功能分析直接检测高表达毕赤酵母重组克隆，而不进行Mut+及Muts表型筛选。检测完高表达后，最好也检测Mut表型，这可帮助你优化重组克隆的表达。
体内筛选多插入子：
介绍：His+转化子越多越好，因为只有1-10%His+转化子可能含有多拷贝插入。这意味着，如果多拷贝插入概率为1%，你必须筛选1000个克隆，才能得到10个高遗传霉素抗性克隆，这需要1-5个含His+转化子的平板。筛选数以千计的克隆并不罕见。如果有抗高遗传霉素抗性的克隆，可检测重组蛋白的表达(P44)，或者检测Mut表型(P41)。
筛选遗传霉素抗性转化子方法：
一、技术上简单，可筛选大量克隆，但不那么可信。筛选HIS+转化子后，将它们集中起来，铺在遗传霉素浓度逐渐升高的YPD平板上，可应用于去壁细胞及电转化方法。
二、技术上较难，只可筛选少量克隆，但更可信。每个克隆在微量测定板上生长至浓度一致，将培养基点到YPD-遗传霉素平板上计算抗遗传霉素抗性。
注意：用遗传霉素筛选可能会有假阳性。划线挑取假定的抗遗传霉素单克隆，然后在YPD-遗传霉素平板上进行证实很重要。如果你真的选择复制平板，一定要证实遗传霉素抗性。
开始前：准备10个YPD平板，每个的遗传霉素浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml。
(去壁细胞)方法1：从含HIS+转化子的平板开始
1用灭菌刮片将含有HIS+转化子的顶层琼脂最上层刮下，放入无菌的50ml离心管中。
2加入10-20ml灭菌水，量应为琼脂的两倍，剧烈振荡1-2min
3将离心管置于管架上，让琼脂沉淀(1min)
4用血球计数计确定上清中细胞浓度。至少要5×105细胞/ml，那样在200ul或更少溶液中可含105个细胞。(如果太稀，可将液体转入另一管中，离心细胞，再用适量灭菌水重悬至5×105细胞/ml)
5每块含遗传霉素的YPD平板涂105细胞。每个浓度用四块板。
(需要证实在没有遗传霉素的YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul)
6在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5天出现，不含遗传霉素的YPD 平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。P39
(电转化)方法1：电转化毕赤酵母时用以下程序。转化子不需要铺在上层琼脂。从含HIS+转化子平板开始。
1吸取1-2ml灭菌水于所有HIS+转化子平板上
2用灭菌刮子重悬HIS+转化子，不要划破琼脂
3将细胞悬液集中转移至灭菌的50ml离心管中，稍涡旋(5-10S)
4用分光光度计测定浓度(1OD600=5×107细胞/ml)
注意：混有琼脂会干扰读数
5在每块含有遗传霉素的YPD平板上涂105细胞。
(需要证实在没有遗传霉素的YPD板上细胞的滴度，计算每个遗传霉素抗性平板上抗遗传霉素克隆的比例，以确定你所得到的多拷贝子是否占平板上转化子的1-10%，将收集的转化子稀释到10-5，10-6，10-7浓度，每板加100-200ul)
6在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5天出现，不含遗传霉素的YPD 平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。P39
注意：如果在以上方法里你将所有细胞都悬浮，加15%灭菌甘油，存于-80度，可在以后时间里做遗传霉素抗性筛选。
方法2：需要三组各两块微量测定板(共6块)来筛选180个HIS+重组子。通过持续接种，得到相同浓度的克隆子，以确保遗传霉素平板上细胞数相等。如将转化子铺于顶层琼脂中，有必要从琼脂上收集细胞，重新涂最小组氨酸平板(P42)以收集克隆。记住要有菌株背景对照及单拷贝基因对照。每180个克隆，可选择出1-10个抗遗传霉素克隆。
1无菌条件下，在每个微量测定板上加入200ul YPD
2用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个HIS+转化子，轻轻搅动以悬浮细胞
3盖住微量测定板在30度孵育2天(不需摇动)
4 2天后，取新的微量测定板，加入190ulYPD
5用多道移液器吸取10ul培养液于第二组测定板中，确保第二组板标记好并放置好，这样可指示细胞所在孔。
6盖住第二组板，30度孵育过夜
7第二天，在第三组测定板上重复第5,6步
注意：持续生长及传代可使克隆达到相同细胞浓度
8孵育后，取第三组板，用100ul多道移液器上下吹打重新悬浮细胞
9取10ul每孔中液体点在含遗传霉素浓度为0，0.25，0.5……4.0mg/ml的YPD平板上。用多道移液器或在平板底下划线，确保以规则方式排列。
10待液体吸收，将板放于30度，2，3，4，5天后检测抗遗传霉素克隆，接着分析结果。
结果分析：可能只有少数的抗遗传霉素克隆，大小可能也不一样，但克隆形态上应一致。挑取抗遗传霉素克隆，划线培养纯化，挑取单克隆，确保记录抗遗传霉素的水平。
可能在2.0，3.0，4.0mg/ml遗传霉素平板上找不到克隆，因为抗如此高遗传霉素的“头彩”克隆很少见。需要筛选数以千计的HIS+转化子以分离抗2-4mg/ml遗传霉素的克隆。
因为不能保证多拷贝克隆会确实增加蛋白表达量，许多人选择直接表达来看是否有克隆
可大量表达蛋白。确保有单拷贝插入作为对照，检测所有抗遗传霉素抗性克隆的Mut表型(P41)，以期进行正确诱导表达。
确保划线纯化单克隆，并加入甘油冰冻保存遗传霉素抗性克隆，每次从冻存样本中挑菌开始表达研究而不是从老的平板上挑菌。
确定拷贝数目：如果发现抗遗传霉素HIS+重组子明显大量表达蛋白，你可能想要知道基因拷贝数。可用southern blot 或dot blot 分析拷贝数(P74)。转化空载体或含单拷贝基因载体的毕赤酵母重组菌基因组DNA也非常重要，可作为实验的对照。
解决问题：因为有可能挑取假阳性(看起来可抗高浓度遗传霉素，其实并不是)，纯化假定的遗传霉素抗性克隆，并证实其所抗遗传霉素的水平非常重要。
体内方法另一个普遍的问题是，只能分离少数遗传霉素抗性克隆，这意味着需要筛选更多的HIS+转化子。记住你正分离的多拷贝插入事件，它发生的概率为1-10%，这意味着需筛选数以千计的克隆而不是区区几百个。另外，为分离含较多拷贝插入基因的重组子，需要筛选更多的HIS+转化子。连续的多拷贝插入更是少见。
如果你的转化效率很低，尝试用电转化替代去壁细胞方法。这样可增加转化效率，帮助你分离更多HIS+转化子。
筛选Mut+及Muts 转化子
介绍：此处，你可分析HIS+转化子的Mut+及Muts表型。试剂盒中有两个菌株可提供Mut+及Muts表型对照。GS115 Albumin是Muts表型，GS115 β-gal是Mut+表型。HIS+ KM71重组子不需要筛选重组子表型，因为它们都是Muts表型。
记住要用两个对照菌株作为毕赤酵母蛋白表达的背景：一个对照即亲本质粒线性化产生HIS+ Muts转化子，另一个对照是亲本质粒线性化产生HIS+ Mut+转化子。
在GS115中筛选HIS+ Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在HIS4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生HIS+ Muts转化子(P66)。在MD及MM平板上检测可证实HIS+ Mut+转化子。
在KM71中筛选HIS+ Muts转化子:转化KM71的HIS+转化子都是Muts，因为AOX1基因被破坏(aox::ARG4)。不需要检测重组子Mut表型，所有都是Muts。SalI或StuI线性化质粒转化KM71在HIS4位点重组，SacI线性化质粒在AOX1基因5’区重组。HIS+重组子需在不含组氨酸的平板上纯化后再进行表达。
准备：下列培养基可提前准备存于+4度
最小葡萄糖(MD)琼脂板1L
最小甲醇(MM)琼脂板1L
灭菌牙签及筛选平板(P43)
在MD，MGY平板上划线培养GS115 Ablumin(HIS+ Muts)及GS115β-gal HIS+ Mut+，作为Mut+或Muts在MD或MM平板上生长的对照。
筛选GS115/HIS+ Mut+ 或HIS+ Muts：筛选HIS+转化子的Mut+或Muts表型
1用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD平板上以一定的方式划线或点HIS+转化子，确保先在MM平板上点
2每个克隆换一次牙签，点100个转化子后再继续向下做(约2-3板)
3为分离Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各点上对照(GS115/HIS+ Muts Ablumin 及GS115/ HIS+ Mut+β-gal)
4 30度孵育2天
5两天后，计数平板，寻找在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长的菌株。
注意：建议纯化HIS+转化子，确保分离的是单克隆，这可在检测Mut表型前后进行。
复制平板程序：该程序错误分离的概率较小，但分离的程序要增加2天，需要仪器复制平板。
1用灭菌牙签，在MD平板上(2-3板) 点100个HIS+转化子，点GS115/HIS+ Muts Ablumin 及GS115/ HIS+ Mut+β-gal在MD上作对照。
2在28-30度孵育2天
3两天后，复制平板至新鲜的MM、MD平板，筛选Muts
4 28-30度孵育复制平板2天
5在28-30度孵育两天后，计数复制平板，查找在MD平板上正常生长而在MM平板上长得小或不长的菌落。每块板上的HIS+Mut s及HIS+Mut+对照菌落，可作为Muts及Mut+表型的参照。
转化子更简单的选择方法：由于铺在上层琼脂，导致转化子中有些在上层有些则包埋在琼脂里，无法挑取克隆。下列程序可进行转化子选择，直接将它们铺于板上，而无需用上层琼脂。
1用灭菌刮子刮取含HIS+转化子的琼脂置于灭菌的50ml离心管中，加入20ml灭菌去离子水，剧烈涡旋重悬细胞
2用4层干酪包布过滤上清，室温1000g离心5min。细胞在底部，残留的琼脂在细胞上方
3仔细去除琼脂，轻轻晃动管子，使琼脂颗粒分散于水中，弃去含琼脂的上清。
4用5ml灭菌去离子水重悬细胞，用小超声头，20-30%输出功率下超声细胞10秒，只将细胞超声分散而不是裂解细胞。
5将细胞稀释至104，在MD平板上铺50-100ul。30度孵育过夜。选择方法进行Mut表型筛选。
重组酵母菌表达：
介绍：确定目的基因表达的最优方法及条件，下面为毕赤酵母表达因素及指导，因为对于任何表达系统，最优化条件因表达蛋白的特征而不同。
培养基：需要BMGY/BMMY(缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养基)BMG/BMM(缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培养基)进行表达(P60)。BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表达，特别是当PH对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基，这与MGY、MM不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲，PH值在一个较大的范围内，可用于蛋白优化表达。BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可稳定分泌蛋白，阻止或减少分泌蛋白的分解。酵母浸出物及蛋白胨作为“混合饲料”，使生长更好并可积累大量表达产物。
蛋白酶：有些蛋白特别易受在中性PH值时有很好活性的蛋白酶的影响。在这种情况下，建议用MGY，MM培养基，因为当毕赤酵母在无缓冲培养基如MM中表达时，PH降至3或更低，许多中性PH蛋白酶都将失活。毕赤酵母对低PH值有抗性，因此低PH值不会影响生长。与此相对的是，有报道称加入1%酪蛋白氨基酸(Difco)并将培养基PH值缓冲至6.0，胞外蛋白酶受抑制，增加了小鼠表皮生长因子的表达。
如果你的目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(MM)中表达。如果没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY。如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。
如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。
换气：毕赤酵母高效表达的重要因素是在甲醇诱导时充分换气。基本上在诱导时，培养基不要超过摇瓶体积的10-30%。建议使用隔板摇瓶，用2-3层干酪包布或松散合适的盖子盖住摇瓶，不要用很紧的盖子。(换气在诱导前大量培养时并不那么重要)
生长动力学：当Mut+及Muts在YPD或甘油培养基中生长接近相同速度时，加入甲醇，由于AOX1基因产物的产生，Mut+将比Muts生长快。
温度及振荡：所有表达需在30度的摇床中进行。温度不能超过30度很重要，如果摇床温度不稳，设置在28度。使用落地式摇床，速度为225-250rpm，如果为台式摇床，速度调至250-300rpm。
开始前：先证实重组子及对照重组子(无插入，1拷贝插入)在GS115或KM71中的表达情况。进行表达时，选择合适的对照很重要，可以更好地解释你的表达结果。表达对照如下：GS115/HIS+ Muts Ablumin Muts分泌表达对照
GS115/ HIS+ Mut+ β-gal Mut+胞内表达对照
GS115或KM71/载体(无插入) 背景对照
GS115或KM71/载体(1拷贝插入) 单拷贝基因表达水平对照
不同的重组形式均会影响表达，建议挑取6-10个克隆进行表达水平筛选。从最新的平板上挑取克隆。克隆子活力随时间而下降，如果有任何怀疑，最好划线纯化菌株。(也可以从冻存的甘油菌中取部分进行培养)
表达指导：下面信息有关如何开始表达，可能需要改变条件来表达不同蛋白，如可能使用底隔板或边隔板摇瓶。如果分析许多重组子，可用50ml离心管。为确保有效换气，可增加摇瓶速度或将离心管以一定角度置于摇床中。
Mut+胞内或分泌表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115β-gal (Mut+)(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115或KM71作为胞内表达背景对照。
1挑取单克隆，接种至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm 摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18小时)
2室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)
3在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。
4每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。
5在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。
6分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻
胞内表达时，去除上清将细胞沉淀存于-80度，直至开始检测。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷冻
7用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGEp47)。
Muts胞内或分泌表达:可培养GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115或KM71作为胞内表达的背景对照。
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
毕赤酵母表达实验手册
xx酵母表达实验手册 （作参考） 部分试剂中英文名称： 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制： 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：
配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注： 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。 完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）： 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）
酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
毕赤酵母表达系统研究进展
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
酵母表达系统使用心得
精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会 这个 是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由
于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以 的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微
镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等 有 的 余的 （起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
2020年毕赤酵母表达系统资料整理
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换
Pichia酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System
产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因
毕赤酵母发酵罐发酵
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母） 灭菌前： 室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）； 室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定 灭菌： 1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至 80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在 0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。 2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。 （注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。） 灭菌后: A.消耗甘油阶段 1.灭菌后冷却30℃时： 2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐； 3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。 4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。 【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。】 5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生。 B.甘油补料阶段 1.将12ml/L PTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。 2.甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞，但是不会有重组蛋白质的产生。 【4％甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。】 重要:如果溶氧低于20％，应该停止甘油或甲醇的补料并且不做任何提高溶氧的
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确