解淀粉芽胞杆菌BaX030的分离鉴定及抗菌功能

第三节 奈瑟菌属

第三节奈瑟菌属(Neisseria) 致病菌脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides) 淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae) 一、脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides) （一）生物学性状形态与染色肾形，G-双球菌，有荚膜，菌毛培养特性专性需氧，培养基：巧克力培养基，5%CO2 菌落：光滑，透明，不溶血 1．抵抗力对干燥，热力，消毒剂均敏感 （二）致病性致病物质荚膜：菌毛：内毒素：主要致病物质 1．所致疾病流脑，人是其唯一易感宿主三种临床类型：普通型，爆发型，慢性败血病型 （三）免疫性：以体液免疫为主 （四）微生物学检查法标本采集涂片染色镜检分离培养与鉴定快速诊断法 （五）防治原则流脑荚膜多糖疫苗，治疗首选青霉素G ：1云南大学药学院(昆明650091)；2云南沃森生物技术有限公司(昆明6501l8 为制备四价脑膜炎球菌疫苗的需要2005 A群脑膜炎球菌多糖结合物的免疫原性研究上海生物制品研究所朱为2002 脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides）感染是细菌性脑膜炎的常见病因，按荚膜多糖可将其分成12个血清群，其中A、B 和C 群感染占所有感染者的90%。全球由脑膜炎球菌引起的脑膜炎发病率在30-50万，病死率约10%，有相当一部分儿童因脑膜炎球菌严重感染而发生致聋等永久后遗症。在我国，A群脑膜炎球菌是主要致病菌群，95%的病例由A群引起。80 年代以来，我国进行了A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的大面积接种，有效地控制了发病率。该荚膜多糖是N-乙酰-3-O-乙酰甘露糖胺磷酸盐的线形共聚物，属T细胞非依赖性（TI）抗原，具有中等免疫原性和年龄相关的保护力，不能诱导免疫记忆。现已证实它对2岁以上儿童和成人在短期内有效，但随时间延续保护力下降，尤其在幼龄儿童中。因此有必要改进现有疫苗，提高其对各年龄组（包括婴儿）的免疫效果。近期的研究集中在开发多糖结合疫苗，即将多糖共价结合到蛋白质上，使其转化为T细胞依赖性（TD）抗原，以增强免疫原性和诱导免疫记忆。本文报道将! 群脑膜炎球菌多糖共价结合到精制破伤风类毒素(TT)上制备结合物，观察其在小鼠中的免疫原性。 A+C群脑膜炎球菌多糖一DT结合疫苗与多糖疫苗诱导的抗多糖抗体间的功能活性差异[英]2004 多糖蛋白结合疫苗对预防由一些有荚膜细菌(包括b型流感杆菌、肺炎球菌和C群脑膜炎球菌)引起的侵袭性疾病高度有效。与未结合多糖疫苗相比，多糖一蛋白结合疫苗能在婴幼儿体内诱导更高浓度的血清抗荚膜抗体。而且，结合疫苗诱导的抗体亲和力更高，补体介导的杀菌活性更强。 。在限定剂量时，多糖疫苗诱导的血清抗荚膜抗体预防C群脑膜炎球菌感染婴鼠发生菌血症的效力弱于结合疫苗。结合疫苗组的抗C群抗体的亲和力指数高于多糖疫苗组。两种疫苗在成人中诱导的抗荚膜抗体的功能活性差异，意味着各自激活了不同的B细胞群。 (兰州生物制品研究所崔萱林2001 流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，发病急，病死率高，且在各年龄组中都可发生，15岁以下儿童发病占75％以上。脑膜炎球菌根据荚膜多糖的结构可分为12个血清群，其中A、B、c群引发的流脑占90％以上。流脑的流行具有菌群漂移特点，如美国在1945年以前为A群流行，1960年以后以B群为主，1967年以后转为C群流行。我国以A群菌流行为主，B群和C群菌有少量病例，约占lO％左右。因此预防流脑的重点应是A、B、C群流脑球菌引起的疾病。由于流脑菌群的漂移现象，国外多采用多价多糖疫苗用于预防流行性脑脊髓膜炎，目前所使用的主要为A+C群二价疫苗(B群多糖对人体无效，主要研制外膜蛋白为基础的疫苗)，其次为A、C、Y及WI35四价疫苗，其它相关菌群引起的流脑病例已少见。国内目前主要使用A群流脑多糖疫苗，自80年代初使用至今效果很好；对于其它菌群的预防．目前尚未有疫苗出现，因此我们研制了A+C群流脑多糖疫苗，即在现有的A群流脑多糖疫苗中加入C群流脑多糖抗原，形成二价疫苗以预防A、C群流脑球菌引起的脑脊髓膜炎。 A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗的制造和检定均按照WHO(生物制品规程》的要求进行，C群流脑多糖原液的主要制造过程借鉴A群流脑多糖原液的生产工艺，在多糖纯化步骤另采用澄清过滤、苯酚抽提控制多糖浓度等措施，使得C群多糖原液的蛋白质和核酸含量符合要求。A群流脑多糖原液为选用的本所常规生产的原液制品。由于多糖原液在制备过程中未进行专门的除类毒素工艺，因而在原液检定中采用鲎试剂法对类毒素含量进行测定，以确保疫苗的安全性。 2岁以下年龄组儿童在接种A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗一个月后，虽然同组儿童的免前及免后的血清杀菌抗体滴度有显著差．但血清4倍阳转率较大年龄组儿童低，而且免后血清中的杀菌抗体滴度的整体水平也相对较低。提示低年龄组儿童对多糖疫苗的免疫应答水平较高年龄组儿童低，有关该疫苗人体接种后的安全性和免疫持久性的结果将另文报告。 A群脑膜炎球菌多糖疫苗自80年代在我国研制成功并广泛接种以来效果明显。我国A群带菌率和发病率大幅度下降，预防效果达90％以上。至今在我国引起流脑的脑膜炎球菌仍以A群为主，同时B群和C群的病例也开始出现。欧美国家主要流行菌群由A群转为B群和c群的事实。提示我们在A群脑膜炎被控制之后要防止B群和C群变迁。 1994年法国由法国巴斯德梅里厄血清疫苗研究所(PasteurMerreux)提供生产的A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗，申请在我国注册，中国药品生物制品检定所与河南省卫生防疫站协作，在河南省新县进行了人群安全性与免疫原性的现场考核，现将结果报告如下该疫苗较安全，免疫原性较强，且更具免疫持久性。2000 A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制2000杨丽华 (长春生物制品研究所，长春130062)李风祥(中国药品生物制品检定所， 本试验制备的A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的理化特性及免疫特性与国内外文献报道结果一致。制备的结合疫苗可诱导出高水平的保护性A群脑膜炎球菌多糖抗体和TT抗体。结合疫苗具有很好的免疫原性和安全性。制备工艺稳定，重复性好，可批量生产。本试验为进一步临床评价结合疫苗的人群免疫效果提供了实验基础。本试验选用Tr作为载体蛋白，因为这种蛋白目前已经标准化，作为载体蛋白的同时兼有预防伤风感染的作用，而用TT蛋白对于已经建立起的免疫程序和“自然”免疫并不产生干扰 A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备熊慧玲成都生物制品研究所 预防A群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎，我国目前采用A群脑膜炎球菌多糖疫苗，而疫苗接种后，小于1岁的婴儿，即使加强接种产生的抗体只能维持1年，1～1．5岁半的婴幼儿，加强后只能维持2年，1．5～2岁的幼儿，接种1针维持不到1年_l1 。wHO指出，按目前的免疫程序，婴儿在出生后5年内至少需要免疫接种4次才可提供中度抗体水平一。说明A群脑膜炎球菌多糖疫苗在婴幼儿中，尤其在2岁以下，免疫原性低，即使产生抗体，抗体水平也不能长久保持。因而提高疫苗免疫原性，使它能对各年龄组，尤其2岁以下婴幼儿提供高水平的长期保护作用，有特别重要的意义。b型流感嗜血杆菌结合疫苗的成功研制和应用给我们以深刻的启示。和流感嗜血杆菌荚膜多糖一样，A群脑膜炎球菌多糖为半抗原，为非T细胞依赖性抗原，当与蛋白结合后，可转化为T细胞依赖性抗原，可刺激机体产生高水平的保护抗体，重复接种有记忆抗体产生因此，我们进行了A群脑膜球菌多糖结合疫苗的研制，并对经中国药品生物制品检定所检定合格的连续3批 2003 流行性脑脊髓膜炎(流脑)被发现并确认已有l00多年．尽管对此病已有有效的预防和治疗措施，但它仍是一种急性传染病．而且病死率高、继续威胁着人类，尤其是儿童的身体健康。我国目前使用的预防制品是A群脑膜炎球菌多糖疫苗，该疫苗对4岁以上儿童有很好免疫效果，对幼儿免疫效果较差，保护时问较短。而脑膜炎球菌多糖与一种蛋白载体连接构成结合疫苗．可增强其对幼儿的免疫回忆反应，提高预防效果?。卫生部成都生物制品研究所已研制成功“A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗”，并由中国药品生物制品检定所、卫生部成都生物制品研究所、江苏省疾病预防控制中心联合于2002年l0月～2003年1月在江苏省射阳县进行的“A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗临床研究”已圆满结束。现将婴幼儿接种A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的安全性报告如下本次临床试验表明，3～4月婴幼儿接种A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗具有良好的安全性，但由于该疫苗首次应用于人群，在大规模推广接种前，仍需对其安全性进一步进行观察 C群脑膜炎球菌结合疫苗的质量控制与生产的科学挑战2004 世界卫生组织(WHO)生物制品标准化专家委员会于1976年通过了脑膜炎球菌多糖疫苗的建议，并于1978年和1981年进行了修订。在临床研究中，疫苗的有效率至少达9O% ，证明其在疫苗接种计划中高度有效。然而，不能在幼婴中诱生保护性应答或免疫记忆制约了其在英国婴儿免疫接种计划中的应用。随着b型流感杆菌(Hib)结合疫苗的成功引入，C群脑膜炎球菌(MenC)荚膜多糖结合疫苗的研究取得了显著的进展。临床对照试验已证实它们在所有年龄组中均可诱生针对MenC多糖的保护性水平的抗体，并且作为T细胞依赖性抗原，能诱导免疫记忆和抗荚膜抗体的亲和力成熟。英国引入MenC结合疫苗后，证实该疫苗可提供保护性免疫。WHO已经制定了有关这些新疫苗生产和检定的建议。 脑膜炎球菌是细菌性脑膜炎和败血病的重要病原。根据荚膜多糖在化学和血清学上的不同，脑膜炎球菌可分为若干群，其中A、B、C、Y、Wl35群对人致病。A群在

分离产淀粉酶的芽孢杆菌

从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 一、摘要 本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的及要求 1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。 三、实验仪器设备 主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等 主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液 四、实验方案设计 （一）实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。 2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。 3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌 5、在含有淀粉鉴定培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色

解淀粉芽孢杆菌

解淀粉芽孢杆菌 Prepared on 22 November 2020

解淀粉芽孢杆菌【作用机理】 解淀粉芽孢杆菌的作用机理主要包括分泌抗菌物质，产生拮抗作用，营养与空间的竞争，诱导寄主产生抗性和促进植物生长等。 1、分泌抗菌物质：产生低分子量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物质，抑制植物病原菌，并且可作为根围细菌促进植物生长。通过非核糖体途径合成分子量小热稳定性好、含有D-氨基酸、耐受蛋白酶水解以及有机溶剂作用的脂肽类抗生素，在生物防治应用中对植物病原细菌、真菌、病毒、线虫的抑制起到主要作用。 2、拮抗作用：微生物通过同化作用产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或发展或直接杀灭病原物。与病原菌直接作用。除了产生抗菌素等次级代谢产物外，还会产生一系列对病原菌抑制起到重要作用的胞外水解酶。 3、营养和空间的竞争：可以迅速地抢占果蔬伤口的营养空间生长存活并大量繁殖，并尽可能快地消耗掉伤口营养，使得病原菌得不到合适的营养与空间条件而不能繁殖从而抑制病害的发生。 4、诱导寄主产生抗性：植物组织在遭受机械损伤或者病原菌浸染时，体内会自发产生一系列生理生化反应来抵抗这些因素对自身的伤害。解淀粉芽孢杆菌可以诱导植物这种自然防御机能。 5、促进植物生长：解淀粉芽孢杆菌可以产生赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素等多种生理活性物质和氨基酸类物质，促进植物根系及植株生长，增强植物抗病性，从而间接地减少病害发生。 【主要功效】

1、抗病抑菌广谱高效：经试验证明，本品对番茄叶霉病菌、早疫病菌、灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、炭疽病菌、甜瓜枯萎病菌、辣椒晚疫病菌、小麦、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、大豆根腐病菌等土传病害具有显着防效。 2、抗逆防衰促进生长：解淀粉芽孢杆菌能诱导作物产生超氧化物歧化酶（SOD），加多酚氧化酶（PPO），过氧化物酶（POD）等，提高作物抗逆性；能诱导植物快速分泌内源生长素，促进作物快速生根，提高根系发育能力，促进植物健壮生长。 3、改良土壤增进肥力：解淀粉芽孢杆菌可改善作物根际微生态，活化土壤中难溶的磷、钾等潜在养分，改良土壤，疏松板结，遏制土壤退化，提高土壤肥力。 4、降低农残优质增产：解淀粉芽孢杆菌可降解土壤及果实中的残留农药，减少亚硝酸盐含量，提高果蔬维生素和糖含量，改善农产品品质，提高作物产量，易贮藏运输。提高并延长肥效、减少化学肥料的用量。

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。

乳酸菌菌种的分离筛选方法解读

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

解淀粉芽孢杆菌

生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展 吴一晶，林艺芬，林河通，等（包装与食品机械，2012，30（6）: 49-52）解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，是一种具有广谱抑菌活性的细菌，具有较强的次生代谢产物产生能力，能产生多种抑菌物质。 1 解淀粉芽孢杆菌生物学特性 解淀粉芽孢杆菌，需氧，革兰氏染色阳性，呈短杆状(0.7~0.9μm×1.8~3.0μm) ，具有运动性，中生椭圆形孢子。硝酸盐还原阳性，接触酶阳性，水解淀粉，液化明胶，吲哚试验阴性，V-P 反应阴性，甲基红反应阴性。Luria-Bertani 液体培养基中形成菌膜，在固体培养基上菌落呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则。 解淀粉芽孢杆菌抑菌物质的提取、分离方法主要有大孔树脂法、酸碱沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱法等。经研究发现，解淀粉芽孢杆菌的抑菌物质主要是抑菌蛋白、脂肽类物质和聚酮化合物等。 1抑菌蛋白 张宝俊等采用盐酸沉淀法提取解淀粉芽孢杆菌LP-5 发酵液的抗菌粗蛋白，并用DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100 凝胶层析进行纯化，得到一种等电点为6.33、分子量为20.3 kD的抗菌蛋白。刘俏等采用截留分子量为70 000的双酚A 型聚砜中空纤维膜超滤提取解淀粉芽孢杆菌活性蛋白。 2 脂肽类物质 信珊珊等利用红外吸收光谱法对解淀粉芽孢杆菌WH1 产抗菌活性物质进行了鉴定，推测其抗菌物质为Surfactin 类脂肽。Caldeira 等利用LC-ESI-MS 和抗真菌试验相结合的方法，发现解淀粉芽孢杆菌CCMI 1051 的抗菌物质为具有抗真菌活性的Iturin 和Surfactin，其分子量为1000~1100 Da。Yu 等应用FAB MS/MS CID 分析表明，具有抑制立枯丝核菌( Rhizoctonia solani) 的解淀粉芽孢杆菌B94 的有效成分为3 种Iturin A 的同分异构体。Rao 等应用HPLC 和MEKC 方法研究了解淀粉芽孢杆菌B128 的抑菌成分，结果表明其抑菌成分为Iturin A，且应用RP-HPLC能很好地分离出Iturin A 的同分异构体。 邓建良等通过PCR 技术探索脂肽抗生素合成酶的相关基因，利用酸沉淀法制备活性粗提物，最后通过HPLC-ESI-MS 和MALDI-TOF-MS 对抗菌粗体液中活性物质进行定性定量分析，发现其抑菌成分主要是C14-Fengycin A、C16-Fengycin A、C17-Fengycin A、C17-Fengycin B 和C16-Iturin A 等5 种脂肽抗生素。Chen 等利用酸沉降法得到抑菌粗提物，再通过生物活性制导分馏、真空闪蒸色谱法、半制备型高效液相色谱纯化，最后利用

大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案

鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验 实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。 1 病料采集 1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。 1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。 1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。 2 菌的分离培养及鉴定 2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。 培养基： A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1）， B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。）， C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。 2．2 样品触片镜检 涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。 2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。 2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。

实验一 淀粉酶产生菌的筛选

实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.

乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析乳杆菌作为公认的安全级微生物,具有促消化、抗菌、增强免疫力等多种益生功能,广泛应用于食品工业、医药工程和畜牧业,其中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌较为常用。在发酵工程中,噬菌体的污染可造成不可忽视的后果,严重影响产品品质,甚至导致发酵失败。 本研究通过噬菌体富集法从酸菜中分离出两株烈性乳杆菌噬菌体,分别命名为LpeD和Lpa804,并对这两株噬菌体进行了生物学特性的鉴定。通过电镜观察,噬菌体LpeD和Lpa804均具有典型的二十面体头部和非收缩性尾部,均属于尾噬菌体目、长尾噬菌体科。 根据宿主范围测定结果,噬菌体Lpa804可感染植物乳杆菌(L.plantarum PA106和L.plantarum SC),而噬菌体LpeD可感染戊糖乳杆菌(L.pentosus KLDS1.0413)和植物乳杆菌(L.plantarumKLDSl.0344)。一步生长曲线的测定结果显示,噬菌体LpeD的潜伏期为15min,裂解期为90min,裂解量为194PFU/cell;噬菌体Lpa804的潜伏期为30min,裂解期为105 min,裂解量为221 PFU/cell。 理化因素对噬菌体的影响结果表明,噬菌体LpeD和Lpa804均对热敏感,LpeD 在56℃作用2 min全部失活,Lpa804在63℃作用2 min全部失活。噬菌体LpeD 和Lpa804在pH 4-12的环境中较为稳定,显示了较强的酸碱耐受性。 紫外线照射并不能使噬菌体LpeD和Lpa804完全灭活,二者在紫外线照射20 min后均仍有部分噬菌体颗粒存活。噬菌体LpeD和Lpa804对乙醇和异丙醇较敏感,35%乙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%乙醇作用10 min可使Lpa804 全部失活。 35%异丙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%异丙醇作用10 min可使

解淀粉芽孢杆菌

解淀粉芽孢杆菌 【作用机理】 解淀粉芽孢杆菌的作用机理主要包括分泌抗菌物质，产生拮抗作用，营养与空间的竞争，诱导寄主产生抗性和促进植物生长等。 1、分泌抗菌物质：产生低分子量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物质，抑制植物病原菌，并且可作为根围细菌促进植物生长。通过非核糖体途径合成分子量小热稳定性好、含有D-氨基酸、耐受蛋白酶水解以及有机溶剂作用的脂肽类抗生素，在生物防治应用中对植物病原细菌、真菌、病毒、线虫的抑制起到主要作用。 2、拮抗作用：微生物通过同化作用产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或发展或直接杀灭病原物。与病原菌直接作用。除了产生抗菌素等次级代谢产物外，还会产生一系列对病原菌抑制起到重要作用的胞外水解酶。 3、营养和空间的竞争：可以迅速地抢占果蔬伤口的营养空间生长存活并大量繁殖，并尽可能快地消耗掉伤口营养，使得病原菌得不到合适的营养与空间条件而不能繁殖从而抑制病害的发生。 4、诱导寄主产生抗性：植物组织在遭受机械损伤或者病原菌浸染时，体内会自发产生一系列生理生化反应来抵抗这些因素对自身的伤害。解淀粉芽孢杆菌可以诱导植物这种自然防御机能。 5、促进植物生长：解淀粉芽孢杆菌可以产生赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素等多种生理活性物质和氨基酸类物质，促进植物根系及植株生长，增强植物抗病性，从而间接地减少病害发生。 【主要功效】 1、抗病抑菌广谱高效：经试验证明，本品对番茄叶霉病菌、早疫病菌、灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、炭疽病菌、甜瓜枯萎病菌、辣椒晚疫病菌、小麦、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、大豆根腐病菌等土传病害具有显着防效。 2、抗逆防衰促进生长：解淀粉芽孢杆菌能诱导作物产生超氧化物歧化酶（SOD），加多酚氧化酶（PPO），过氧化物酶（POD）等，提高作物抗逆性；能诱导植物快速分泌内源生长素，促进作物快速生根，提高根系发育能力，促进植物健壮生长。 3、改良土壤增进肥力：解淀粉芽孢杆菌可改善作物根际微生态，活化土壤中难溶的磷、钾等潜在养分，改良土壤，疏松板结，遏制土壤退化，提高土壤肥力。 4、降低农残优质增产：解淀粉芽孢杆菌可降解土壤及果实中的残留农药，减少亚硝酸盐含量，提高果蔬维生素和糖含量，改善农产品品质，提高作物产量，易贮藏运输。提高并延长肥效、减少化学肥料的用量。

大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案

大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案 实验原理： 1、大肠杆菌的性质： 大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： 沙门氏杆菌是G-直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备： （1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 （2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 （3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： （1）取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。 （2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： （1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H2S），并做穿刺实验于三糖铁上。37°C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 （2）检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁上，37°C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。

淀粉酶产生菌的筛选

实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。

淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。

乳酸菌得分离、纯化与鉴定

乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制

大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案

实验原理： 1、大肠杆菌的性质: 大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H 2S,不能利用xx酸盐。 半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： -沙门氏杆菌是G直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H 2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌 醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法

见附 1. 二、标本制备： (1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 (2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 (3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： (1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。 (2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门 氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： (1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H 2S),并做穿刺实验于三糖铁上。37 C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 (2) 检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁 上，37 C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。

土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定

土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定 摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。 关键词：土壤淀粉酶产生菌分离纯化发酵培养透明圈法生理生化试验 正文： 1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化 1.1 实验原理 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这就是纯种分离法的原理。 在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。 淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4大类。产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘变为蓝色的特性，将分离的微生物接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，

解淀粉芽孢杆菌

解淀粉芽孢杆菌【作用机理】 解淀粉芽孢杆菌的作用机理主要包括分泌抗菌物质，产生拮抗作用，营养与空间的竞争，诱导寄主产生抗性和促进植物生长等。 1、分泌抗菌物质：产生低分子量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物质，抑制植物病原菌，并且可作为根围细菌促进植物生长。通过非核糖体途径合成分子量小热稳定性好、含有D-氨基酸、耐受蛋白酶水解以及有机溶剂作用的脂肽类抗生素，在生物防治应用中对植物病原细菌、真菌、病毒、线虫的抑制起到主要作用。 2、拮抗作用：微生物通过同化作用产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或发展或直接杀灭病原物。与病原菌直接作用。除了产生抗菌素等次级代谢产物外，还会产生一系列对病原菌抑制起到重要作用的胞外水解酶。 3、营养和空间的竞争：可以迅速地抢占果蔬伤口的营养空间生长存活并大量繁殖，并尽可能快地消耗掉伤口营养，使得病原菌得不到合适的营养与空间条件而不能繁殖从而抑制病害的发生。 4、诱导寄主产生抗性：植物组织在遭受机械损伤或者病原菌浸染时，体内会自发产生一系列生理生化反应来抵抗这些因素对自身的伤害。解淀粉芽孢杆菌可以诱导植物这种自然防御机能。 5、促进植物生长：解淀粉芽孢杆菌可以产生赤霉素、吲哚乙酸、细胞分裂素等多种生理活性物质和氨基酸类物质，促进植物根系及植株生长，增强植物抗病性，从而间接地减少病害发生。

【主要功效】 1、抗病抑菌广谱高效：经试验证明，本品对番茄叶霉病菌、早疫病菌、灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、炭疽病菌、甜瓜枯萎病菌、辣椒晚疫病菌、小麦、水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、大豆根腐病菌等土传病害具有显着防效。 2、抗逆防衰促进生长：解淀粉芽孢杆菌能诱导作物产生超氧化物歧化酶（SOD），加多酚氧化酶（PPO），过氧化物酶（POD）等，提高作物抗逆性；能诱导植物快速分泌内源生长素，促进作物快速生根，提高根系发育能力，促进植物健壮生长。 3、改良土壤增进肥力：解淀粉芽孢杆菌可改善作物根际微生态，活化土壤中难溶的磷、钾等潜在养分，改良土壤，疏松板结，遏制土壤退化，提高土壤肥力。 4、降低农残优质增产：解淀粉芽孢杆菌可降解土壤及果实中的残留农药，减少亚硝酸盐含量，提高果蔬维生素和糖含量，改善农产品品质，提高作物产量，易贮藏运输。提高并延长肥效、减少化学肥料的用量。