鸡输卵管上皮细胞的分离培养与鉴定_张秋婷

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

川芎内生真菌的分离与鉴定

川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） E-mail：wangyangli27@https://www.wendangku.net/doc/4a632419.html, 摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定 川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源（见表1） 1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定 摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性?对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物?生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%?根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素?质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素? 关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定 Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic. Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物 病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性?采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素?HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素? 1材料与方法 1.1菌株 1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存? 1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)?小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)?小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)?水稻纹枯病菌(Rhizoctonia

真菌的分离培养和鉴定论文

内蒙古广播电视大学 “一村一名大学生计划”毕业作业作业题目真菌的分离培养和鉴定___ 教学点名称：包头广播电视大学_ 学员姓名：张瑞光__________ 学号：1015004452077___ 专业：畜牧兽医专科____ 入学时间：2010秋_________ 指导教师：杨瑞芳 _________

真菌的分离培养和鉴定 【摘要】：从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。 【关键词】：真菌；菌落；菌丝；孢子 1 前言 真菌一词来源于拉丁文的“蘑菇”，现在真菌这一名词的概念不仅包括蘑菇，而是代表着一个相当庞大的生物类群。什么是真菌呢？从生物学的观点来看，它们是一大类真核微生物，无根茎叶，不含叶绿素，不能利用无机物来制造食物，靠寄生或腐生生活，仅少数为单细胞，其余为多细胞，大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。 其实，真菌并不像其看起来的这般抽象，在我们的日常生活中几乎到处都有它们的存在，我们每个人都有过接触和

不同程度的感性认识。例如酿酒、制馒头用的酵母；酒曲的曲种（曲霉和根霉）；做豆腐乳的毛霉和红曲霉；发酵饲料的黑曲霉；味美可口的蘑菇、木耳、银耳、猴头；作为中药的神曲、麦角、虫草、茯苓、灵芝；此外还有食品、衣物、用具等因潮湿而发生的霉；引起农作物病害的小麦锈病等等都是真菌。 真菌与细菌的大小、形态、结构及化学组成差异很大，单细胞个体比细菌大几倍至几十倍，具有细胞壁，但不含细菌细胞壁的肽聚糖。有些真菌因环境条件的改变而改变形态，称之为真菌的两相性，如假皮疽组织胞浆菌在动物机体呈酵母菌样。而在人工培养基上呈丝状。 真菌不仅种类多，数量大，而且分布极为广泛，与人类生产与生活有着极密切的利害关系。有些菌丝可引起人与畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类健康。因此，了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。 近年来在真菌分类方面趋向于采用Anisworth&bisby 的《真菌学辞典》介绍的分类系统。该系统认为真菌不属于低等植物，而是属于单独成立的真菌界，界以下分为黏菌门和真菌门。真菌门再分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。本研究从自然界分离到几株真菌，并用真菌分类方法对其进行了鉴定。

植物体内的亚细胞组分分离

植物体内的亚细胞组分分离 步骤:准确称取植株鲜样0.5000 g,加入20 mL提取液(0.25 mmol/L蔗糖+50 m mol/L Tris HCl缓冲液(pH 7.5)),研磨匀浆,用尼龙纱布过滤,滤渣为细胞壁部分;滤液在600 r/min下离心10min,沉淀为细胞核部分;上清液在2000 r/min下离心15 min,沉淀为叶绿体部分;上清液在10000 r/min下离心20 min,沉淀为线粒体部分;上清液为含核糖体的可溶部分,每组两次离心,全部操作在4下进行。 植物亚细胞组分的分离 步骤:准确称取鲜样0.5000 g,加入20 mL提取液[0.25mol·L-1蔗糖+50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+1mmol·L-1二硫赤鲜糖醇,研磨匀浆,匀浆液在冷冻离心机300×g下离心30 s,沉淀为细胞壁组分;上清液在2000×g下离心15 min,沉淀为细胞核和叶绿体组分;上清液在10000×g下离心20 min,沉淀为线粒体组分;上清液为含核糖体的可溶组分。全部操作在4℃下进行。 Fractionation of Leaves and Roots.Leaves and roots were homogenized using a mortar and pestle in a medium containing 0.25 M sucrose,50 mM Tris-HCl(pH 7.5),and 1 mm

dithioerythritol.All steps were performed at 4 C.The resulting brei was strained through eight layers of cheesecloth,and liquid was expressed from the residue.The residue was washed twice with the grinding medium.The pooled washes,together with the first filtrate,were centrifuged at 300g for 30 s.The resulting pellet combined with the residue of the cheesecloth filtration contained mainly cell walls and cell wall debris and was designated as cell wall fraction(I).The supernatant of the first centrifugation step was then centrifuged at 20,000g for 45 min to sediment cell organelles.The pellet was taken as organelle fraction(II).The resultant supernatant solution referred to as soluble fraction(III)was employed in subsequent characterization studies as described.Fractions I and II were analyzed for their Cd content.The supernatant,fraction III,was further fractionated by gel filtration ，using Sephadex G-100,G-25,and G-10(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Sweden).An aliquot of fraction III was applied to a column(100 x 2.6 cm)of G-100 using 50 mm Tris-HCl(pH 7.5) and 0.1 mM dithioerythritol as eluting buffer.Fractions containing Cd were pooled and chromatographed on calibrated G-25(roots) or G-10(leaves)columns(70 x 2.3

分离与菌种 鉴定

《高级微生物实验指导》 一、目标微生物的分离与鉴定 在无菌条件下取样品10 g加入100 mL无菌生理盐水，用均质机将组织破碎均匀。经充分震荡做成1:10的均匀稀释液。用1 mL的灭菌吸管吸取1:10稀释液，注入9 mL灭菌生理盐水的试管内，震荡试管混匀，按上述操作依次进行10倍递增稀释，选择3个适宜的稀释度，每个稀释度做2个平行，用灭菌涂布棒均匀涂布于冷却的细菌分离培养基（NA）和真菌分离培养基（PDA）表面，分别将细菌培养基和真菌培养基于30℃和28℃下恒温培养2-4d。待菌长出后，挑取不同形态菌落，纯化，挑取单菌落于PDA斜面上，培养并保存。 二、细菌与霉菌总DNA的提取（CTAB法） 1、菌株DNA的提取通用试剂 （1）CTAB抽提液：2%CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0；（2）β-疏基乙醇 （3）PVP（聚乙烯吡咯烷酮） （4）石英砂 （5）Tris平衡酚 （6）氯仿：异戊醇（24:1） （7）异丙醇 （8）75%乙醇 （9）无水乙醇 2、菌株DNA的提取步骤 (1) 将已纯化的菌种，接种于相应的分离培养基平板上，28℃培养2d-4d。 (2) 用灭菌药勺或解剖刀从培养皿中刮取足量菌丝至1.5ml离心管中。 (3)加少量PVP、灭菌海砂和65℃水浴预热的200μl CTAB抽提液，用玻璃棒研磨至匀浆； (4)加入400ul预热CTAB抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴1h；期间轻柔颠倒混匀2-3次。 (5)冷却至室温后，12000rpm离心10min，上清液移至另一离心管中； (6)加入1/2体积（约300ul）的Tris平衡酚及1/2体积（约300ul）的氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀。 (7)12000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中； (8)重复（5）-（7）步2-3次，直到两相界面处无明显杂质； (9)加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀； (10)12000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中； (11)向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置15min； (12)12000rpm离心10min，弃去上清液，加入70%乙醇500ul以悬浮沉淀；也可250ul 70%乙醇分两次悬浮沉淀； (13)12000rpm离心5min，弃上清，室温干燥；

常见真菌的分离与鉴定

常见真菌的分离与鉴定 发表时间：2010-08-20 发表者：皮肤科 (访问人次：361) 作者：上海长征医院皮肤科徐红 2005年6月13～19日全国各地举行了第8届中国护足周，主题是“积极治疗足病，杜绝家庭传染”。 在中国,每2个人中就有1人罹患足病，其中成年人发病比例高达75%；超过60%的足病为真菌感染，其中足癣发病率为45.2%，甲真菌病(俗称甲癣)占15.5%；40%的足癣患者是被家人传染的；在真菌患者中只有23.8%寻求治疗，其中50%的患者症状稍有好转就不继续治疗。 真菌其实很常见，真菌就生活在我们身边。    病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由 孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，   称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交 织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子

原代细胞培养：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题

Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋 白与基因 实验设计 一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞 二、细胞培养分组： a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养 b)高糖72h培养 c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养 d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h f)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h 三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。 四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。 实验报告 一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养： 1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小； 2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置； 3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化； 4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2 培养箱中培养； 5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养； 二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定： 1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min； 2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min； 4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜； 5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h； 6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

基因组DNA的提取与分离鉴定课后研讨题(手写)

基因组DNA的提取与分离鉴定 课后研讨题 1、动植物DNA提取的方法主要有哪些？并说明各方法的原理。 答： (1).浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. （2）.阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以 常用阴离子去污剂提取DNA. （3）.苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 . （ 4）.水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS. 2、苯酚、氯仿和异戊醇在基因组DNA的提取中各有什么作用？ 答：苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

细胞组分分级分离实验报告

细胞组分分级分离 实验目的 分级分离细胞核和线粒体 实验原理 1.相关概念 细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速 度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。 常用分离方法：差速离?法——不同转速；密度梯度离?法——不同浓度的介质 2.分离方法 （1）差速离?法 特点：介质密度均?；离??由低向?；逐级离?（差速）。 ?途：初步分离；分离??相差悬殊的细胞组分。 细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、?尔基体→核糖体（2）密度梯度离?法 特点：介质密度不均?；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速） ?途：纯化分离细胞器等颗粒组分 待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围 常?介质及要求：蔗糖、?油、氯化銫；能产?密度梯度，且密度?时，粘度不?；PH 中性或易调为中性；浓度?时渗透压不?；对细胞?毒 3.染色方法 甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种 碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。 詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。

实验设计思路 实验结果 分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。 如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。 注意事项 1.过滤前要先将纱布湿润 2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃) 3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。 4.离心机温度应设为4℃ 5.整个分离过程不宜过长,要尽快。 6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。 7.保持细胞器的完整性和活性——线粒体进行的是活体染色要求样品制备好后尽快染色 问题思考 1.为什么要饥饿小鼠？ 使小鼠细胞中线粒体变长变少，光镜下易于观察 2.为什么使用肝细胞？ 肝细胞所含线粒体多，且肝脏柔软，易于破碎，适于快速提取，保持线粒体活性 3.细胞器沉降顺序？ 差速离心法：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、?尔基体→核糖体 4.细胞组分分级分离？ 依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采 用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。 5.核酸染色原理 甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种 碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。 6.线粒体染色原理 詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于

亚细胞核的分离和鉴定

亚细胞核的分离和鉴定 关键词：细胞试剂试剂盒甲苯胺蓝试剂标准物质北京标准物质网 1、细胞核的分离细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。 细胞核的分离目前较常采用以蔗糖为介质的差速离心法，可分为细胞核分离和纯化两大步骤。细胞匀浆后，先以0. 25mol／L。的蔗糖1000g离心洗涤，然后在0. 34mol／L和0．88mol／L的蔗糖梯度中1500g离心15～20分钟，沉淀即为纯化的细胞核。现在细胞核的提取试剂已商业化生产，公司试剂盒中会提供详细的操作步骤。细胞核被分离后，可经甲苯胺蓝染色在光学显微镜下观察，或直接在电子显微镜下观察核内染色质的分布情况。 2、细胞核的鉴定 (1)光镜直接观察：普通光学显微镜下，贴壁细胞的细胞核为位于细胞中央的一团较深物质，悬浮细胞会显得更模糊，且都无法清晰分辨细胞核与细胞质。常用于细胞核的化学染料包括甲紫、苏木精、醋酸洋红、甲基绿等。苏木精．伊红染色简称HE染色，是组织学、胚胎学和病理学最常用最基本的细胞核细胞质染色方法，细胞核嗜碱被苏木精染成蓝色(图5-3-1)。

(2)电镜观察：电镜能清晰地观察到细胞核基质的基本形态，以及核膜、核仁、核染色质等，所以可以被应用到细胞核的可视化研究中。比如细胞凋亡，电镜下清晰可见，核基质由结构完整到出现紊乱，到凋亡小体的形成并由核内排出。因此，电镜扫描可以清晰展示出细胞核的各个阶段的状态，能更形象化地应用于细胞核功能学、发育学以及细胞凋亡等研究中(图5-3-2)。 (3)细胞学鉴定：核酸荧光染色后，可采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描荧光显微镜以及流式细胞仪检测。常用的三大经典核酸染料包括：插入性染料，如：ethidium bromide(EB)和propidiumiodide(PI)；DNA小沟结台染料，如：DAPI 和Hoechst：以及其他类核酸染料，如：吖啶橙、7-AAD、LDS751等。 DAPI是一种具有膜通透性的强力DNA荧光染料，可用于活细胞以及死细胞的细胞核染色。荧光显微镜下，DAPI可被紫外光激发出蓝色荧光，其荧光激发光358nm以及发射光461nm。因为彼此的发射光很少重叠，DAPI通常与绿色荧光(如GFP)和红色荧光(如RFP)结合，三者被用于细胞的多重荧光染色(图5-3-3)。Hoechst染料常用的有Hoechst 33258和Hoechst 33342，其激发光和发射光与DAPI非常相似，都可用于活细胞和固定细胞的标记。DAPI和Hoechst染料是科研人员最常使用的用于细胞核标记的荧光染料。