6、膜片钳实验流程

膜片钳记录系统

仪器简介：膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术，是研究细胞膜离子通道的重要工具。目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。

仪器名称：膜片钳记录分析系统

主要设备：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC 成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。

仪器功能及应用范围：单细胞膜片钳记录（急性分离细胞、培养细胞）、脑片膜片钳记录（盲法、可视法）

收费标准：培训费：1个月以内—500元；1~3个月—1000元。

指导操作：院内20元/小时，院外40元/小时。

独立操作：院内60元/天，院外120元/天（由两位指导老师认可培训

合格，方可进行独立操作）。

开放时间：周一至周五

管理规定：

⑴膜片钳记录分析系统属于高端精密仪器，因此任何进入本室进行膜片钳实验的人员，必须经过本室专门人员培训合格认可后，经允许方可进行膜片钳放大器、微操纵器、拉制仪、切片机、显微镜等仪器的操作。

⑵在实验过程中，必须严格按照实验流程进行操作，不得擅自更改操作步骤，不许自行调改仪器设置，以免造成仪器毁损。

⑶仪器损坏赔偿事宜按照我室赔偿制度进行处理。

⑷统一安排实验时间，使用仪器后作登记。

⑸实验人员负责当天的水电安全和室内卫生。

脑片膜片钳实验流程

(PC-2B)

一、脑片制作

1.配制新鲜蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室温，20~25°C）各1L。

2.用丙酮浸泡刀片30 min。

3.麻醉动物：爪蟾—MS-222，大鼠—乌拉坦。

4.解剖动物，取脑组织。

5.切片：根据不同的动物和组织选择不同的方案。

方案一：低熔点琼脂包埋组织后进行切片。

方案二：普通琼脂作托进行切片。

6.处理脑片：蔗糖溶液中40～60min（4°C或32°C）。

7.孵育脑片：NaCl溶液中放置0.5~1h（室温）后可进行膜片钳实验。

注：脑片制作过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录

（一）盲法

1.将脑片置于灌流槽内，用银丝压牢，并确保灌流系统通畅、稳定。

2.双手接触屏蔽罩以释放操作者身体静电。

3.打开放大器POWER→ON，记录模式选择SEARCH档。

4.打开IBBpatch-clamp软件，点击按钮，监测电流及电阻变化。

5.系统holding选择-50~ -80mV。

6.安装玻璃微电极。

7.用注射器给电极内施加适度正压。

8.降低电极入水，并接近脑片。

9.封接：用微操纵器推动电极接触脑片，并逐渐向脑片深处推进，当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，释放注射器内正压，缓慢抽吸，逐渐形成千兆欧姆封接（gigohm）。

10.破膜：轻拉注射器，突然出现大的电容电流，表明已破膜，Whole-cell 模式

形成。

11.迅速点击按钮，记录模式选择VC档。

12.点击按钮，可观察电流变化，但是不记录、不保存。点击按钮，可观察并保存电流变化。

（二）可视法

基本步骤同盲法，不同的是需要在步骤8之前打开监视器的DVCView软件，在水镜头下找到目的细胞后再将电极入水，逐渐接近脑片直至到达该细胞，在可视的情况下完成后续步骤。

单细胞膜片钳实验流程

(AXON200B)

一、单细胞急性分离

一般过程为：解剖→切片→孵育→消化→洗酶→吹打→细胞贴壁。

以急性分离大鼠海马神经元为例叙述如下：

1.配制人工脑脊液(ACSF) 250ml。

2.解剖：断头取脑，在冰冷（0~4°C）ACSF中取出海马。

3.切片：将海马沿矢状位切成400~600μm厚的脑片。

4.孵育：脑片在ACSF中室温下孵育50min。

5.消化：将孵育后的脑片移入酶消化液中，32°C消化25min。

6.洗酶：用ACSF洗脑片3次。

7.吹打：依次用口径递减的三个吸管轻轻吹打脑片，制成单细胞悬液。

8.贴壁：将单细胞悬液竖直静置5min，吸取上方细胞悬液加到培养皿中，约30min后细胞贴壁，即可进行膜片钳实验。

注：细胞急性分离过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录：

单细胞膜片钳实验需要在倒置显微镜下进行，其步骤与脑片膜片钳记录过程基本相同。由于可直接看到细胞，故可以将微电极直接接近并接触目的细胞，完成封接、破膜等一系列过程。软件设置和放大器操作不同之处主要有以下几点：

1.按下放大器POWER，记录模式选择Vm档

2.进入记录软件：开机后按F8键进入MS-DOS系统→ 输入“cd pclamp6”命令→ 输入“clampex / fetchex”进入记录界面。

3.File选择预先设定好的刺激参数。

4.Trial → TestSeal 监测电流变化，进行封接和破膜，形成全细胞模式。

5.记录模式选择V TRACK档

6.Trial → View 观察电流变化，但是不记录、不保存。

7.Trial → Record可观察并保存电流变化。

拉制仪操作流程

采用两步法拉制玻璃微电极：

1.打开电源POWER(-)，预热10min。

2.调节拉制参数。

第1步拉制参数：将左侧旋钮旋置NO.1 HEATER，再旋转右侧第一个旋钮NO.1 HEATER ADJ，调到所需参数。

第2步拉制参数：将左侧旋钮旋置NO.2 HEATER，再旋转右侧第二个旋钮NO.2 HEATER ADJ，调到所需参数。

注：调节参数过程的动作要迅速，持续时间不宜过长。

3.将左侧旋钮置于STEP2位置。

4.安装电极，将加热丝旋到上方，按START，完成第一步拉制。

5.将加热丝旋下，待加热丝完全变暗后，按START，完成第二步拉制。

6.关闭电源POWER(○)。

管理信息系统第六章系统分析--数据流程图的画法

数据流程图 1.定义：是一种能全面描述信息系统逻辑模型的主要工具。用少数几种符号反映信息在系统中的流动、处理和存储情况。 2.特点： 抽象性：表现在它完全舍去了具体的物质，只剩下数据的流动、加工处理和存储。 概括性：表现在它可以把信息中的各种不同业务处理过程联系起来，形成一个整体。 3.符号 库存台帐 数据存储 外部实体处理 数据流 外部实体：指本系统之外的人或单位，凡本系统之外的人或单位，都可以称为外部实体。 数据流：表示流动着的数据，它可以是一项数据，也可以是一组数据，也可以用来表示对数据文件的存储操作。 处理（功能）：又称功能。 数据存储：指通过数据文件、文件夹或账本等存储数据。 4.某企业成品销售管理的数据流程图。 销售科负责成品销售及成品库管理。该科计划员将合同登记人合同台帐，并定期根据合同台帐查询库存台帐，决定是否可以发货。如果可以发货，则填写出库单交成品库保管员。保管员按出库单和由车间送来的入库单填写库存台帐。出库单得另外两联分送计划员和财务科。计划员将合同执行情况登入合同台帐。销售部门的负责人定期进行销售统计并上报厂办。 数据流程图如下： 5. 画出银行储蓄存取款过程数据流程图 储户将填好的存（取）单及存折送交分类处理处。分类处理安三种不同情况分别处理。如果存折不符或存（取）单不合格，则将存折及存（取）单直接退还储户重新填写；如果是存款，则将存折及存款单送交存款处处理。存款处理处取出底帐登记后，将存折退还给储户；如果是取款，则将存折及取款单送交取款处理处，该服务台取出底帐及现金，记账后将存折

与现金退给储户。从而完成存（取）款处理过程。试按此画出数据流程图。 数据流程图如下： 面对强大的对手，明知不敌，也要毅然亮剑，即使倒下，也要化成一座山

检测和校准实验室能力认可准则(17025 2017)

CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则 （ISO/IEC 17025:2017）Accreditation criteria for the competenceof testing and calibration laboratories 中国合格评定国家认可委员会 2018 年 09 月 01 日实施

前言 本准则等同采用ISO/IEC 17025:2017《检测和校准实验室能力的通用要求》。 本准则包含了实验室能够证明其运作能力，并出具有效结果的要求。符合本准则的实验室通常也是依据GB/T 19001(ISO 9001, IDT)的原则运作。实验室管理体系符合GB/T 19001的要求，并不证明实验室具有出具技术上有效数据和结果的能力。 本准则要求实验室策划并采取措施应对风险和机遇。应对风险和机遇是提升管理体系有效性、取得改进效果、以及预防负面影响的基础。实验室有责任确定要应对哪些风险和机遇。 中国合格评定国家认可委员会（英文缩写：CNAS）使用本准则作为对检测和校准实验室能力进行认可的基础。为支持特定领域的认可活动，CNAS 还根据不同领域的专业特点，制定一系列的特定领域应用说明，对本准则的要求进行必要的补充说明和解释，但并不增加或减少本准则的要求。 申请CNAS 认可的实验室应同时满足本准则以及相应领域的应用说明。 本准则的附录是资料性附录，不构成要求，旨在帮助理解和实施本准则。 在本准则中使用如下助动词： ——“应”表示要求； ——“宜”表示建议； ——“可”表示允许； ——“能”表示可能或能够。 “注”的内容是理解要求和说明有关要求的指南。

离子通道研究技术的最新进展_全自动膜片钳技术

离子通道研究技术的最新进展———全自动膜片钳技术 曹小于1　郑婉云2　鲁燕滨3　黄　超1 (1.达科为生物技术有限公司　深圳　518054) (2.厦门大学生命科学学院分子细胞神经科学实验室　厦门　361005) (3.南京善康医药科技发展公司　南京　210013) 摘　要　全自动膜片钳技术是离子通道检测技术的最新进展,它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。近来在多个方面作出新的突破,如高的实验通量表现,较高的自动化程度、良好的封接质量、微量加样等。目前,该技术在以离子通道为靶标的药物研发,药物毒理测试以及虚拟药筛等方面有广阔的应用前景。本文对全自动膜片钳仪器的原理和技术细节作全面介绍。 关键词　全自动膜片钳　高通量药筛　hERG检测　虚拟筛选 引言 细胞是通过细胞膜与外界隔离的,在细胞膜上有很多种离子通道,细胞通过这些通道与外界进行离子交换。离子通道在许多细胞活动中都起关键作用,它是生物电活动的基础,在细胞内和细胞间信号传递中起着重要作用。随着基因组测序工作的完成,更多的离子通道基因被鉴定出来,离子通道基因约占1.5%,至少有400个基因编码离子通道。相应的由于离子通道功能改变所引起的中枢及外周疾病也越来越受到重视。以离子通道作为靶标的药物现占总靶标的5%,而潜在的离子通道靶标药物将占总靶标的25%,因此开发离子通道为靶标的药物将具有广阔的市场前景。已知与离子通道有关的疾病主要有:癫痫(ep ilep sy)、心律失常(Cardiac ar2 rhyth m ia)、糖尿病(diabetes)、高血压(hyperten2 si on)、舞蹈症(Huntingt on’s disease)、帕金森症(Par2 kins on’s disease)……。 离子通道的实验研究最初主要来源于生理学实验。1949～1952年,Hodgkin等发展的“电压钳技术”为离子通透性的研究提供技术条件。60年代中期,一些特异性通道抑制剂的发现为离子通道的研究提供有力武器。1976年Neher和Sak mann发展的膜片钳技术直接记录离子单通道电流,为从分子水平上研究离子通道提供直接手段。80年代中期,生化技术的进步,分子生物学以及基因重组技术的发展,使人们能够分离纯化许多不同的通道蛋白,直接研究离子通道的结构与功能关系(见表1)。 表1　传统膜片钳技术主要优缺点总结 优　点缺　点 A高信息量:能改变细胞膜电位,单细胞记录A需要受过良好训练的电生理学专家 B高灵敏性:能记录到pA级电流变化和单通道B通量很低,一天的实验数据量不超过10 　开关状态C劳动力投入密集,试验操作过程复杂 C灵活性好:可以控制改变细胞膜内外的溶液成分D不适合药物粗筛/二次筛选 D应用范围广:可以分析检测所有的离子通道类型E技术自动化非常困难,且不能进行平行检测E相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权 　威性和精确性〔1〕 1　多款全自动膜片钳系统分析 1.1　技术实现原理 Nani on公司的PatchL iner NPCκ216,Molecular Devices公司的I on works HT和PatchXp ress7000A 全部采用的是平板微阵列技术。其技术特点如下:在平板电极上打磨或者使用金属离子轰击成孔,每孔都是大小均一的直径约1～2μm的小孔,每个小孔下面有电极连接到放大器,可对实验过程中的电流变化进行记录。将细胞悬浮液加载到平板玻璃孔上,通过调节压力和吸力,一个细胞便可以自动定位在小孔上(相当于微管电极的尖端),自动进行封接,自动判断封接并进一步施加负压破膜以进行全细胞模式实验〔4,5〕。

ISO17025实验室认可准则--考核试卷

ISO17025实验室认可准则考核试卷 一.多项选择题（每题3分，共45分） 1. ISO/IEC17025-2005规定了实验室能力的通用要求，包括使用 _______ 所进行的测试和校准。 ①标准方法；②非标准方法；③实验室制定的方法。 2 ?取样记录必须包括___________ 。 ①取样人的识别；②取样程序；③环境条件（若有关） 3.如果实验室的工作要偏离测试和校准方法，则只要在这种偏离已经___________ 后才允许存在。 ① 被文件化；②经过技术验证经过批准；③ 被客户认可。 4?如果经评价认为实验室的不符合工作____________ 时，必须立即运行纠正措施程序。 ① 比较严重；②可能再次发生；③对实验室的运行与其政策和程序的符合性产生怀疑。 5?实验室的内部审核必须由____________ 的人员承担。 ①经过培训；②具备资格；③尽可能独立与被审核活动。 6?实验室的技术管理层全面负责__________ 。 ① 技术工作；②所须资源供应；③体系管理工作。 7. ___________________________ 实验室采取纠正措施必须入手。 ① 纠正错误；②调查确定问题的根本原因；③确定有关人员的责任。

8. ___________________________ 实验室的质量方针必须有批准发布。 ① 主要管理者；②实验室主任；③ 实验室的上级领导。 9?除非__________ ，否则实验室要为分包的工作向客户负责。 ① 客户指定分包方；②管理机构指定分包方；③分包方愿意承担责任。 10?实验室采取纠正措施的力度必须与_________ 相适应。 ① 问题的严重性；② 问题的危险性；③实验室管理者的要求。 ①停止使用；②单独放置或加贴明显的停用标签或标记；③立即清理出实验室。 二.判断题（每题1分，共35分） 1 ?实验室的客户可以依据本认可准则对实验室能力进行确认。（） 2?实验室的运作应符合有关规定和安全要求。（） 3?实验室本身必须是能承担法律责任的实体。（） 4?实验室的质量手册中必须规定技术管理者和质量经理的作用和责任。（） 5?实验室的作废文件必须销毁，不得保留。（） 6?实验室必须事先将分包协议书面通知客户。（） 7.影响实验室输出质量的物品的采购文件的技术内容必须经过审批后发布。（） 8 ?需要采取纠正措施时，实验室须选择并实施最有可能消除问题并防止其再次发生的措施。 （） 9?实验室须确定必要的改进机会和潜在的不合格原因，无论它使技术方面的或是与质量体系有关的。（） 10?对于影响检测和校准质量的区域，实验室必须根据其特定情况规定控制范围。（） 11?进行检测时，实验室制订的方法如果适合于预定用途并且经过确认，也可以采用。（）12?如果客户推荐的方法已过时，实验室可以直接予以更改，不需通知客户。（）

组织机构工作流程图怎么画

组织机构工作流程图怎么画 导语： 组织架构是企业的流程运转、部门设置及职能规划等最基本的结构依据，组织架构图可以帮助企业了解未来继续拓展的方向，也可以帮助员工了解公司各部门、各岗位之间的关系。那么具体要怎么画呢？我们一起来看下吧。 免费获取亿图图示软件：https://www.wendangku.net/doc/442665055.html,/edrawmax/ 怎么画出好看的流程图？ 看似专业又好看的流程图当然是用专业的软件画的了。亿图图示，一款可以绘制专业流程图的工具，拖拽式操作，10000+矢量素材，支持导出PPT、图片、PDF、HTML、PS等格式。除此以外，还可以将流程图作品存储到亿图云，或直接打印出来。

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所谓千言万语不如一张图，尤其是在进行PPT幻灯片演示的时候，将繁杂琐碎的事物用简单、明了的流程图表达出来，能够让观看者对事物进行中的顺序、布置和安排有更加生动的了解。 下面让我们一起来看几张适合做PPT展示用的流程图模板： 圆点PPT流程图模板

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17025实验室认可准则

SO17025/实验室认可目录一实验室认可的意义6 1. 什么是实验室认可？6 2. 在实验室认可活动中的实验室有什么涵义？ 6 3. 实验室的顾客有哪些？ 7 4. 我国为什么要推行实验室认可？ 7 5. 与实验室认可有关的组织有哪些？8 6. 使用认可实验室如何有益于政府？9 7. 认可实验室是如何得到国际承认的？9 8. 实验室为什么要申请认可？10 9. 实验室是否需要申请多重认可？11 10. 实验室申请认可需满足什么条件？11 11. 实验室认可是完全自愿的吗？12 12. 认可和认证有什么不同？12 13. 实验室认可和ISO9000 认证有什么关系？13 14. 实验室认可对全球测量一致性起什么作用？14 15. 实验室认可和合格评定有什么关系？14 二质量要素的理解16 16. 为什么要建立质量管理体系？16 17. 最高管理者、技术管理层和质量主管在实验室中各担负哪些职责？16 18. 纠正措施的实施由技术管理层负责，还是质量主管负责？16 19. 质量主管是否应对检测/校准质量承担领导责任？17 20. 在检测/校准活动中，实验室员工应对顾客的什么信息承担保密责任？17 21. 如何绘制组织结构图？18 22. 实验室可分配的资源和可使用的权利有哪些？18 23. 什么是二级法人的实验室？19 24. 二级法人的实验室如何做到质量活动的公正性？19 25. 组织结构的功能是什么？20 26. 如何进行实验室的组织设计？20 27. 质量管理和全面质量管理的目标是什么？21 28. 实验室如何加强质量管理？22 29. 监督员如何实施日常质量监督？22 30. 质量管理部门和监督员的工作有何不同？23 31. 怎样做到“足够的”监督？23 32. 监

业务流程图画法教程

业务流程图画法教程 导语： 业务流程图，是为了达到特定的价值目标而由不同的人分别共同完成的一系列活动的一种图形。绘制业务流程图一般都是用专业的工具来画，下面就为大家简单介绍一下专业的业务流程图的一些画法及技巧。 免费获取亿图图示软件：https://www.wendangku.net/doc/442665055.html,/edrawmax/ 制作业务流程图的软件有哪些？ 制作业务流程图的软件很多，比如word、PPT就可以画，但要选一个好用又专业的业务流程图软件的话，一定是亿图图示软件了。 这是一款跨平台使用的图形图表设计软件，兼容许多文件格式，可以一键导出PDF, office, 图片, HTML, Visio等格式。使用的是最简单的拖拽式操作，内置一套矢量的流程图符号，同时提供丰富的免费的业务流程图参考模板和实例。

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检测和校准实验室认可准则培训测试题

《检测和校准实验室认可准则》培训考核试题姓名__________班组________分数_________ 一．填空题:(在横线上填出正确的答案) https://www.wendangku.net/doc/442665055.html,AS-CL01：2006标准的中文名称是。 ：2006等同采用国际标准。 3.实验室的职责是以的方式从事检测和校准,并能满足、或需求。 4.质量监督人员的任职条件是和。 5.凡作为管理体系组成部分发给实验室人员的所有文件、在发布之前应 由。 6.实验室应有选择和购买有影响和 的政策和程序.还应有与检测和校准有关的和的购买、 和的程序。 7.“纠正”的定义是: 8.的定义是为消除已发现的不合格或其他不期望情况的原 因所采取的措施。 9.的定义是为消除潜在不合格或其他潜在不期望情况的原因所采取的措 施。 10.记录分为和两类。 11.内审的目的是。 12.审核应由和的人员来执行,且只要资源允许,审核人员应独立于。 13.管理评审是执行管理层定期对实验室的和 进行评审,以确保其持续和,并进行必要的。 14.实验室应对、和及实行 有效的监督。

15.管理层应授权专门人员进行、 以及。 16.对检测和校准方法的偏离,仅应在该偏离、、 和情况下才允许发生。 17.实验室应对、、 、进行确认,以证实该方法适用于预期的用途。 18.意味着对测量结果可信性、有效性的怀疑程度或不肯定程 度,是定量证明测量结果的质量的一个参数。 19.当需要利用以维持设备校准状态的可信度时,应按照 进行。 20.用于检测和(或)校准的所有设备,包括对检测、校准和抽样结果的准确 性或有效性有显着影响的辅助测量设备,在投入使用前应。 二.判断题:正确请打“√”错误请打“╳” 1.文件控制程序只需清楚规定内部文件,如质量手册、程序文件、作业指导 书如何控制,而不需规定外部文件,比如标准规范如何进行控制。() 2.实验室可根据不同类型的委托书、标书或合同，按照不同的规定实施评 审。() 3.实验室应保存合理的申诉和投诉及处理结果的记录并按规定保存。() 4.客户只需得到检测结果即可,无权到实验室监视与其工作有关的操 作。() 5.客户的抱怨一定要及时处理,但抱怨及对此开展的调查和纠正措施不一 定要予以记录。() 6.记录的修改只可划改,不能涂改、描改,且划改处应有改动人的签名或签 名缩写。() 7.实验室不但要确保固定设施的环境不会对测量质量产生影响,更要注意

产品分析流程图怎么画最简单

产品分析流程图怎么画最简单 导语： 对于产品部门而言，产品流程图拥有非常重要的地位，它可以用于表明一个产品的进展过程，也可以用于协调各部分的工作职能。本文小编就来跟大家一起来探讨一下产品分析流程图究竟要怎么做菜最简单。 免费获取亿图图示软件：https://www.wendangku.net/doc/442665055.html,/edrawmax/ 适合新手的产品流程图软件 新手一般用的什么产品流程图软件呢？亿图图示软件可以了解一下。这是一款支持快捷操作的产品流程图制作工具，极大的降低了专业流程设计的门槛，让大多数人可以在很短的时间里绘制出专业的产品流程图。 软件采用最简单的拖曳式作图方式，无需任何基础也能轻松上手使用，自带近千种模板，上万个符号可以自由使用，即使是绘图小白也能轻松创作出令人眼前一亮的图表。

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然后打开软件，新建一个空白文档，在符号库中找到“水平跨职能图形状”，将一个动态泳道图符号用鼠标“拖”进画布。 PS：点击“设置行数”时会弹出一个小窗口，在这里输入需要的泳道数量即可。 接着就是添加符号，在符号库中选择“基本流程图形状”，然后用鼠标直接拖到泳道中，这里有个小技巧，假如你想快速更换流程图符号样式，可以将鼠标

实验室生物安全认可规则

CNAS-RL05 实验室生物安全认可规则 Rules for the Accreditation of Laboratory Biosafety 中国合格评定国家认可委员会

目录 前言 (2) 1 范围 (3) 2 引用文件 (3) 3 术语和定义 (3) 4 申请认可条件 (3) 5 认可流程 (3) 5.1初次认可 (3) 5.1.1意向申请 (3) 5.1.2正式申请 (4) 5.1.3受理 (4) 5.1.4评审准备 (4) 5.1.5 现场评审 (4) 5.1.6评定 (5) 5.1.7 批准发证 (5) 5.2监督评审 (5) 5.2.1定期监督评审 (5) 5.2.2 不定期监督评审 (5) 5.3复评审 (6) 6 变更 (6) 6.1获得认可的实验室的变更 (6) 6.1.1变更通知 (6) 6.1.2变更的处理 (6) 6.2认可要求的变更 (7) 7 暂停、恢复、撤销和注销认可 (7) 7.1暂停认可 (7) 7.2恢复认可 (7) 7.3撤销认可 (7) 7.4注销认可 (7) 8 权利和义务 (8) 8.1 CNAS的权利和义务 (8) 8.2 实验室的权利和义务 (8) 8.2.1 申请认可实验室的权利和义务 (8) 8.2.2 获准认可实验室的权利和义务 (9)

前言 中国合格评定国家认可委员会（英文缩写：CNAS）是经国务院认证认可监督管理部门批准设立并授权，统一负责实验室和检验机构等认可及相关工作的国家认可机构；遵循的原则是：客观公正、科学规范、权威信誉、廉洁高效。认可规则是CNAS 认可工作公正性和规范性的重要保障，CNAS依据国家有关法律法规和《中国合格评定国家认可委员会章程》制定本规则。 根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《中华人民共和国认证认可条例》，国务院认证认可监督管理部门授权CNAS 依照实验室生物安全认可准则，统一实施实验室生物安全认可工作。 CNAS 实验室生物安全认可准则采用《实验室生物安全通用要求》（GB19489）和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中适用的明确规定；CNAS对实验室生物安全认可范围仅限于CNAS实验室生物安全认可准则的要求。 CNAS 应对通过认可的实验室颁发相应生物安全防护水平等级的认可证书。获得CNAS认可的实验室还应依据国家其他相关规定申请开展实验室活动的资格。 本规则是CNAS认可活动的程序和要求，包括认可条件、认可流程、变更、暂停、恢复、撤销、注销认可以及已认可实验室的权利和义务等。 本规则内容为强制性要求。 本规则于2016年制订，本次为第一次修订，修订后文件版本号不变。

膜片钳记录和分析技术

膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位

的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。

膜片钳技术原理与基本操作

膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导

膜片钳的发展与应用

膜片钳技术的发展与应用 崔梦梦 （生命科学学院 1241410026） 摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录 单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨 率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离 子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其 电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与 其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物 学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。 关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用 在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。 随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 一、膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。 二、膜片钳技术的改进与新进展 （一）穿孔膜片钳技术 1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.4—0.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电

全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用

全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用 来源：易生物浏览次数：513 网友评论0 条 全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用一：全自动膜片钳技术介绍：膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch... 关键词：应用药物全自动通道细胞研究 全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用 一：全自动膜片钳技术介绍： 膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional pat ch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。 传统膜片钳技术主要优缺点总结 全自动膜片钳技术的发展，经历了下列三个发展阶段，在每个阶段，所采取的原理和技术有所不同： 1. Flip-Tip翻转技术： 将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后,药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种方式形成

ISO17025实验室认可准则--考核试卷

包 ， ISO17025 实验室认可准则考核试卷 姓名： 工作部门： 考试地点： 培训时间： 阅卷人签字 考试时间： 评语 合格 □ 有缺陷 □ 不合格 多项选择题 判断题 问答题 总分 一. 多项选择题（每题3 分，共 45 分） 1．ISO/IEC17025-2005规定了实验室能力的通用要求，括使用 所进行的测试和校准。 ①标准方法； ②非标准方法； ③实验室制定的方法。 2．取样记录必须包括 。 ① 取样人的识别； ②取样程序； ③环境条件（若有关） 3．如果实验室的工作要偏离测试和校准方法则只要在这种偏离已经 后才允许存在。 ① 被文件化； ②经过技术验证经过批准；③ 被客户认可。 4．如果经评价认为实验室的不符合工作 时，必须立即运行纠正措施程序。 ① 比较严重； ②可能再次发生； ③对实验室的运行与其政策和程序的符合性产生怀疑。 5．实验室的内部审核必须由 的人员承担。 ① 经过培训； ② 具备资格；③ 尽可能独立与被审核活动。 6．实验室的技术管理层全面负责 。 ① 技术工作； ② 所须资源供应；③ 体系管理工作。 7．实验室采取纠正措施必须 入手。 ① 纠正错误； ②调查确定问题的根本原因；③ 确定有关人员的责任。 8．实验室的质量方针必须有 批准发布。

认 （ （ 任 （ ( ① ② 主要管理者； ②实验室主任；③ 实验室的上级领导。 9．除非 ，否则实验室要为分包的工作向客户负责。 ① ② 客户指定分包方； ②管理机构指定分包方；③ 分包方愿意承担责任。 10．实验室采取纠正措施的力度必须与 相适应。 ① ② 问题的严重性；② 问题的危险性； ③实验室管理者的要求。 ① ② 停止使用； ②单独放置或加贴明显的停用标签或标记；③立即清理出实验室。 二. 三. 判断题（每题1 分，共 35 分） 1．实验室的客户可以依据本认可准则对实验室能力进行确（ 。 ） 2．实验室的运作应符合有关规定和安全要求。 ） 3．实验室本身必须是能承担法律责任的实体。 ） 4．实验室的质量手册中必须规定技术管理者和质量经理的作用和责（ 。 ） 5．实验室的作废文件必须销毁，不得保留。 ） 6．实验室必须事先将分包协议书面通知客户。 )

6、膜片钳实验流程

膜片钳记录系统 仪器简介：膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术，是研究细胞膜离子通道的重要工具。目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。 仪器名称：膜片钳记录分析系统 主要设备：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC 成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。 仪器功能及应用范围：单细胞膜片钳记录（急性分离细胞、培养细胞）、脑片膜片钳记录（盲法、可视法） 收费标准：培训费：1个月以内—500元；1~3个月—1000元。 指导操作：院内20元/小时，院外40元/小时。 独立操作：院内60元/天，院外120元/天（由两位指导老师认可培训 合格，方可进行独立操作）。 开放时间：周一至周五 管理规定： ⑴膜片钳记录分析系统属于高端精密仪器，因此任何进入本室进行膜片钳实验的人员，必须经过本室专门人员培训合格认可后，经允许方可进行膜片钳放大器、微操纵器、拉制仪、切片机、显微镜等仪器的操作。 ⑵在实验过程中，必须严格按照实验流程进行操作，不得擅自更改操作步骤，不许自行调改仪器设置，以免造成仪器毁损。 ⑶仪器损坏赔偿事宜按照我室赔偿制度进行处理。 ⑷统一安排实验时间，使用仪器后作登记。 ⑸实验人员负责当天的水电安全和室内卫生。

脑片膜片钳实验流程 (PC-2B) 一、脑片制作 1.配制新鲜蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室温，20~25°C）各1L。 2.用丙酮浸泡刀片30 min。 3.麻醉动物：爪蟾—MS-222，大鼠—乌拉坦。 4.解剖动物，取脑组织。 5.切片：根据不同的动物和组织选择不同的方案。 方案一：低熔点琼脂包埋组织后进行切片。 方案二：普通琼脂作托进行切片。 6.处理脑片：蔗糖溶液中40～60min（4°C或32°C）。 7.孵育脑片：NaCl溶液中放置0.5~1h（室温）后可进行膜片钳实验。 注：脑片制作过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。 二、全细胞膜片钳记录 （一）盲法 1.将脑片置于灌流槽内，用银丝压牢，并确保灌流系统通畅、稳定。 2.双手接触屏蔽罩以释放操作者身体静电。 3.打开放大器POWER→ON，记录模式选择SEARCH档。 4.打开IBBpatch-clamp软件，点击按钮，监测电流及电阻变化。 5.系统holding选择-50~ -80mV。 6.安装玻璃微电极。 7.用注射器给电极内施加适度正压。 8.降低电极入水，并接近脑片。 9.封接：用微操纵器推动电极接触脑片，并逐渐向脑片深处推进，当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，释放注射器内正压，缓慢抽吸，逐渐形成千兆欧姆封接（gigohm）。 10.破膜：轻拉注射器，突然出现大的电容电流，表明已破膜，Whole-cell 模式

漂亮的图片流程图是怎么画出来的

漂亮的图片流程图是怎么画出来的 导语： 流程图可以用于表达产品的进行过程，通过它，可以将文字可视化。一张张的图片读起来比文字要通俗易懂得多。那么那些漂亮的图片流程图都是怎么画出来的呢？一起来了解下吧。 免费获取亿图图示软件：https://www.wendangku.net/doc/442665055.html,/edrawmax/ 零基础用什么软件画出漂亮有创意的流程图？ 许多初学者觉得自己绘制的流程图没有别人的漂亮，不知道别人那些漂亮又有创意的流程图是怎么画出来的。要画得和他们一样其实很简单，只是你没有选对软件。如果你还在用PPT、Word绘制，那么画得不好看也是正常的。 画流程图可以试试专业的流程图软件，比如亿图图示，这是一款国人设计的专业的综合性绘图软件，符合国人的操作习惯，拖拽式操作，小白也能轻松上手。软件内置海量剪贴画素材及专业符号，还有大量的实例模板，精美的配色与设计，想要不漂亮都难。它还可以一键分享到微信、微博、Facebook等社交平台供好友直接网页打开欣赏，也可以导出JPG、PNG、PDF、office、Visio等多种格式进行保存。

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2、接着进入之后找到亿图图示的下载页面，找到对应自己电脑系统版本的下载链接进行下载，这里有三个选项，分别对应的是Windows、Mac、Linux系统。 3、下载安装好之后，打开亿图图示软件，点击“新建”---“流程图”，这个时候可以看到右侧有很多的流程图模板可以使用，我们可以使用这些模板来快速创建，也可以点击右侧的“创建”来新建一个空白模板。

膜片钳技术

2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流