细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)

简介：

自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长355nm 。阻断滤光片波长512nm 。Leagene 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，适用于培养细胞的自噬染色，又称为MDC 染色液，可与EB 合用双染。

组成：

操作步骤(仅供参考)：

(一)、MDC 单独染色：

1、 用去离子水稀释1×Wash buffer 至1×。

2、 离心，收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞1次，弃上清。

3、 加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。

4、 取适量细胞悬液至新的EP 管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。

5、 室温避光染色。

6、 离心收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞2次，弃上清。

7、 加入Collection buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。

8、 荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm)，计数并拍照。

(二)、与EB 双染色：

1、 用去离子水稀释1×Wash buffer 至1×。

2、 离心收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞1次，弃上清。

3、 加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。

4、 取适量细胞悬液至新的EP 管中，分别加入MDC Stain 和 EB 染色液，轻轻混匀。

5、 滴加于在玻片上，室温避光染色，加盖玻片。 编号 名称 DA0041 Storage 试剂(A): MDC Stain 1ml -20℃ 避光 试剂(B): 10×Wash buffer 20ml 4℃ 试剂(C): Collection buffer 10ml 4℃ 使用说明书 1份

6、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长512nm)，计数并拍照。

染色结果：

正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光

凋亡细胞染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被

染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒

注意事项：

1、MDC Stain和EB，试剂有一定毒性，请小心操作。

2、吖啶橙染色常与EB染色合用，可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

3、操作过程中应注意减少试剂暴露于强光下的时间。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

细胞染色方法总结

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。 JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦 下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。

吖啶橙荧光染色法

吖啶橙荧光染色法 【实验原理】 吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染 色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。吖啶橙的阳离子 也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两 种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 (1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH2PO4?H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml; B 液：Na2HPO4 ? 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml; 取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。 (2)1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 (1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 (2)95%乙醇溶液固定5min。 (3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。 (4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显 示橘红色荧光 【注意事项】 (1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 (2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长 将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-

方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻 璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室 温下作用1－2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如 大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗 （稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把 玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗 体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看 看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti- rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵 育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三：

吖啶橙 溴化乙锭双荧光染色

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色 AO / EB原理与流程 zhongyisheng: 1、原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 2、AO/EB染色及观察结果：取 20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。 ym1051: 1、能否提供具体实验步骤? 2、您在文中所说的"1：100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞? zhongyisheng: 1、用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP 管吹打即可。 2、消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。 ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗? zhongyisheng: 的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。 医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享：

细胞免疫荧光步骤

方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟 使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片

细胞染色方法

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制 贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。 使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释 荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合， 染色与观察： 制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm.

注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。 上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。 按照1:20000的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。 可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。

细胞固定、染色原理与方法

细胞固定、染色原理与方法 一、固定与固定液 (一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。 1.目的 (1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。 (2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。 (3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 (4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 (5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。 2.时期 (1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。 (2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。 小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。 玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。 蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。 3.固定时的注意事项 (1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。 (2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。 (3)固定的时间要合适： 与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。 经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。 (二)固定液固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。 1.固定液的条件 (1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。 (2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。 (3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。 (4)使细胞内的成分凝固或沉淀。 (5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。

细胞免疫荧光步骤

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)

吖啶橙溴化乙锭双荧光染色试剂盒

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色试剂盒 简介： 吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA,属于异染性荧光染料， AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发橙红色荧光。溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)嵌合到双链DNA 或RNA 的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。吖啶橙可透过活细胞膜，EB 不能通过与活细胞膜具有相同通透性的细胞膜。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 AO/EB 工作液的配制：取试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)， 按照试剂(A):试剂(B):试剂 (C)=1:1:8的比例稀释成AO/EB 工作液。 2、 每份细胞样品中加入AO/EB 工作液2μl ，混合均匀。 3、 低速离心，弃上清。 4、 用AO/EB Dilution Buffer 重悬细胞，细胞计数，将细胞密度调整为0.5~5×106个/ml 。 5、 加入1μl AO/EB 工作液，充分混匀。 6、 取洁净载玻片，滴加上5μl 细胞悬液，轻轻盖上盖玻片。 7、 在荧光显微镜B 域进行观察。 染色结果： 注意事项： 1、用能通过活细胞膜与DNA 结合后发蓝色荧光的Hoechist 33342和只能通过死细胞与DNA 结合后发红色荧光的碘化吡啶( propidium iodide ，PI)对细胞进行双染的方法也比较常用。 编号 名称 DA0039 100T Storage 试剂(A): AO solution 200μl 4℃ 避光 试剂(B): EB solution 200μl RT 试剂(C): AO/EB Dilution Buffer 50ml 4℃ 避光 使用说明书 1份 活细胞 绿色荧光 死细胞 橙色荧光

细胞免疫荧光染色

细胞免疫荧光染色 1.盖玻片处理：用前1天用纱布擦净灭菌，放入6孔板。 2.接种细胞：较低密度为适宜，约2000－10000个/孔（根据细胞生长状态决定，常用 5000个/孔），2ml（浓度为2500/ml） 3.24h后细胞贴壁，根据需要同步16－18h，干预处理，细胞融合60－70％时染色最 佳 4.37度PBS洗涤，3ml/孔，贴边加（可将6孔板倾斜，加完样在放正以防冲掉细胞， 0.5min。室温PBS也可，但4度禁止，否则细胞易皱缩。 5.固定：4％多聚甲醛(1ml)，先常温稳定5min，然后4度，10min，（可放在饭盒内）。 6.吸掉多聚甲醛，迅速加PBS 5ml/孔，洗涤5min×3次，镜下观察，细胞形态如前。 7.透化：0.1％－4％triton×－100，1ml/孔，室温透化5min（triton是去污剂，目的是 将脂质成分破坏，如细胞膜、核膜等，故不影响实验结果，可不用洗涤） 8.5％BSA（滤过）室温封闭至少20min（可配制含5％BSA和0.2％triton的混合液，将 两步合成一步）风干 9.用5％BSA将一抗1：50或1：100（常用）稀释至EP管200ul/玻片 10.将纱布垫在饭盒中，去离子水润湿纱布，准备封口膜。 11.吸去BSA，迅速滴加一抗，从玻片1中央滴加，液体会自行扩散至全片。为保持细胞 湿润，将6孔板封好，放入饭盒，37度孵育1－2h（有利于抗体结合），再室温3－4h。（或室温2h后，4度过夜）注意勿晃动6孔板，防止抗体不均或从玻片洒出。 12.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床） 13.用5％BSA将二抗1：50稀释（得到的实际浓度为1：100，因二抗本身已经被甘油 稀释1倍），也可1：200稀释。室温1.5h后可显荧光（放在饭盒里，避光） 14.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床） 15.免疫荧光显微镜观察。泡在2ml的PBS中保存。 16.多聚甲醛: 4度避光保存100ML PBS加4克多聚甲醛，磁力搅拌器加热搅拌，温度控 制在60℃以下，最好用细粉末的多聚甲醛，如仍不溶，滴加NaOH,(1N或0.1N），最后调PH值，7.4左右。 triton：用PBS稀释，常温保存

细胞各种染色方法

细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。 第一节培养细胞的常规检查和观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为： 一、肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。 二、显微镜观察 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。 三、细胞的生长状态 细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。 四、微生物污染 细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等

吖啶橙染色液

吖啶橙染色液 吖啶橙染色液(1mg/ml) 产品简介： 吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。 (1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。染色 后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。 自备材料： 1、 荧光显微镜 2、 低速离心机 3、 PBS 4、 细胞计数板 5、 载玻片、盖玻片 操作步骤(仅供参考)： 1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节

细胞浓度至106/ml。 2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17 μg/ml，轻轻混匀。 3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。 4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。 染色结果： 正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光 凋亡细胞染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被 染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒 注意事项： 1、Acridine Orange Stain(1mg/ml)不含破膜剂，较少单独使用。 2、吖啶橙染色常与EB染色合用，可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。 3、如有低温离心机进行离心效果更佳。 4、操作过程中应注意减少试剂暴露于强光下的时间。 5、试剂有一定毒性，请小心操作。 6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：6个月有效。

Hoechst染色方法

Hoechst染色方法 实验步骤 1．贴壁细胞 1) 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片至于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%——80%满。 2)刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 3) 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 4) 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 5) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 6) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡，使细胞接触封片液，切勿弄反。 7) 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 2. 悬浮细胞 1) 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 2) 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 3) 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。 4) 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 5) 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 6) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 7) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 8) H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

吖啶橙荧光染色法

. ’. 吖啶橙荧光染色法 【实验原理】 吖啶橙（acridine orange ，AO ）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA 和RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm ，荧光发射峰为530nm （DNA ）、640（RNA ），它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA 和RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm ），核仁和胞质RNA 发橘红色荧光（>580nm ）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA 、RNA 两种核酸。 【实验用品】 1、 器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、 试剂 （1）0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH 2PO 4·H 2O 2.76g ，加蒸馏水至100ml ； B 液：Na 2HPO 4·7H 2O 5.36g ，加蒸馏水至100ml ； 取A 液16.5ml ＋B 液33.5ml ＋NaCl 8.5g ，用蒸馏水稀释至100ml 。 （2）1%吖啶橙原液 取0.1g 吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml （临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS 溶液稀释10倍）。 3、 材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 （1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 （2）95%乙醇溶液固定5min 。 （3）滴加0.01%吖啶橙染液5min 。 （4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA 的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA 的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色 【注意事项】 （1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 （2）每种荧光染料，均有自己的最适pH ，此时荧光最强。当pH 改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH 缓冲液中进行。

免疫荧光通用操作规程

免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白

7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min

血细胞化学染色检验

血细胞化学染色检验 发表时间：2011-05-13T17:08:37.940Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：张辉[导读] 中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，生成蓝色颗粒。 张辉 (黑龙江省林甸县中医院 166300) 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0146-02 【关键词】血细胞检验染色 (一)过氧化物酶(POX)染色中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质内含过氧化物酶(POX)，能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，生成蓝色颗粒。 1.酶活性增高可见于再生障碍性贫血、急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、放射病，嗜碱性粒细胞在慢性粒细胞白血病时可出现阳性。 2.酶活性减低可见于肿瘤、MDS、链球菌感染、风湿热等。 (二)中性粒细胞碱性磷酸酶染色 中性粒细胞中的碱性磷酸酶(NAP)能使试剂中的成分产生一系列化学反应，形成棕黑色颗粒定位于胞质中。胞质中出现灰色到棕黑色颗粒为阳性反应，视反应强度可分为阴性反应，+～4+。由此可计算出NAP阳性细胞的百分率和阳性积分值。 1.NAP积分增高可见于①细菌性感染时，NAP活性明显增高，病毒性或寄生虫性感染时常无明显变化或减低，这有助于感染性质的鉴别；②真性红细胞增多症以及再生障碍性贫血；③类白血病，由化脓性球菌引起的白血病反应；④急性淋巴细胞性白血病；⑤多发性骨髓瘤时，NAP活性显著升高；⑥烧伤、中毒、手术、外伤等。 2.NAP积分降低可见于①慢性粒细胞性白血病时NAP活性明显降低，经治疗病情缓解时活性恢复正常，急变时活性增强，有助于对病情判断；②粒细胞缺乏症、脾功能亢进等疾病；③感染革兰阴性杆菌、结核、病毒感染以及立克次体病等。 (三)酸性磷酸酶染色 血细胞中的酸性磷酸F(ACP)在酸性条件下水解试剂中的成分，产生的化学反应形成黑色颗粒定位于胞质中。 1.单核细胞、网状细胞、巨噬细胞、组织细胞中此酶呈阳性反应，有助于急性单核细胞性白血病、组织细胞性淋巴瘤及恶性组织细胞病的诊断。 2.毛细胞白血病时呈阳性反应，且不为左旋酒石酸所抑制，有助于毛细胞白血病的诊断。 3.高雪细胞呈阳性反应尼曼-匹克细胞细胞呈阴性反应，有助于两者鉴别。 (四)特异性酯酶染色 特异性酯酶(SE)为粒细胞所特有，能将试剂成分形成不溶性红色沉淀定位于胞质中。 急性粒细胞性白血病时，原粒及早幼粒细胞的SE活性显著增强；急性单核细胞性白血病时一般呈阴性反应；急性淋巴细胞性及单核细胞性白血病时均呈阴性反应。 (五)非特异性酯酶染色 血细胞中的非特异性酚酶(NSE)能将试剂中的成分形成不溶性的有色沉淀定于胞质中。 NSE主要存在干单核细胞系，从原单核细胞到成熟单核细胞其活性逐渐增强，粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应，淋巴细胞系一般呈阴性反应。在急性单核细胞性白血病时呈强阳性反应，但其活性能被氟化钠抑制。急性粒细胞性白血病时，有部分病理可呈弱阳性反应，但其活性不被氟化钠抑制，有助于急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病的鉴别。 (六)糖原染色 糖原染色又称过碘酸-雪夫(FAS)反应。过碘酸能将血细胞内的糖原氧化后与雪夫试剂反应形成紫红色化合物定位于细胞质中。胞质中出现红色颗粒或块状物质为阳性反应因细胞不同，其反应程度各异粒系细胞中原始粒细胞多呈阴性反应；早幼粒细胞以下各阶段随细胞成熟，阳性反应增强；红系细胞呈阴性反应；单核细胞呈弱阳性淋巴细胞多呈阴性；巨核细胞及血小板均呈阳性反应按阳性强度计算积分值。 1.鉴别良性与恶性淋巴细胞增生性疾病在良性淋巴细胞增生如传染性单核细胞增多症时，其淋巴细胞PAS阳性反应产物呈细小颗粒状，积分值正常；在恶性增生时如恶性淋巴瘤、急或慢性淋巴细胞性白血病时，其淋巴细胞中常呈粗颗粒或块状红细胞沉淀的阳性反应，积分值增高。 2.鉴别幼红细胞增生的性质在巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血时，幼红细胞PAS反应积分值正常；在红血病、红白血病时则呈强阳性反应，积分值增高。 3.鉴别急性白血病的类型原始及幼稚粒细胞PAS反应呈阴性；原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞反应呈颗粒状或块状阳性；原始单核细胞及幼稚单核细胞反应呈弥漫性强阳性。 4.鉴别某些细胞类型如巨核细胞呈强阳性反应，尼曼-匹克细胞呈弱阳性或阴性，李-斯细胞一般为阴性或弱阳性反应。 (七)铁染色 骨髓组织中的含铁血黄素(细胞外铁)和幼红细胞中的铁粒(细胞内铁)在酸性溶液中与亚铁氰化钾反应，生成蓝色沉淀定位于含铁部位及胞质中。 1.细胞内外铁消失或减低，见于铁原料摄入降低，铁吸收功能障碍或铁的丢失和消耗过度，使幼红细胞血红蛋白合成量减少或障碍，如临床常见的缺铁性贫血及能引起机体缺铁的相关疾病，如钩虫病、ITP等均能使机体细胞内外铁减少，产生贫血症状。 2.细胞内外铁增多，见于机体造血功能障碍，铁利用和转换能力下降或迟缓，临床常见的疾病有再生障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血、骨髓增生异常综合征、溶血性贫血、白血病等。 3.铁染色与血清铁、总铁结合力联合检测，有助于了解机体内铁的动态变化以及铁剂治疗的效果，可评价骨髓代偿造血能力。参考文献